1 材料与方法
1.1 材料
实验地点位于云南省临沧市云县漫湾镇,属云南省西南部,地理位置99°43°~100°33° E,23°56°~24°46° N,海拔2200 m,属北亚热带气候类型,年降雨量1367.2 mm,主要集中在7—9月;土壤以沙壤土为主。野外实验于2018、2019年的10—12月进行。
1.2 方法
1.2.1 单花水平观测 随机选取30株开单花的植株,在花朵未开放前,用记号笔和小标牌挂牌标记,花朵开放后,观测单花形态变化并进行拍照记录。每天早上、中午和傍晚各观察一次,记录数据。观测单花开放状态：花冠开裂时间、萎蔫时间、凋落时间、开花持续时间、开花高峰、单花花期、花药变化、柱头变化等。
1.2.2 花序水平观测 随机选择即将开放的花序30朵,挂牌做标记,每天上午7：00进行观察记录,并照相。观察记录描述花序的开放状态：始花时间、末花时间、花序1/2开时间、花序开放持续时间、小花开放顺序、当天开放小花数、花序开放状态、颜色变化、花序开放持续时间。
1.2.3 单株水平观测 随机选取滇龙胆30株,挂牌做标记,从第一朵单花开始开花（判断花开放的标准是花瓣刚展开扬起）开始记录,每天12：00观察记录一次,直至最后一朵单花败落。每天记录单花变化情况,始花期、开花高峰期、终花期、花序开放数、单株开花持续时间等。
1.2.4 群体水平观测 采取直接观测与询问种植管理者相结合,记录萌芽期、现蕾期、始花期、盛花期、花瓣凋谢期（判断花朵枯萎的标准是花被变色、失去光泽、质地变软）、开花高峰期、开花持续时间。
1.2.5 花部形态特征观测 随机选取完全开放单花30朵,用电子游标卡尺和直尺测量与其开花生物学相关的形态特征值,如花冠、花瓣、花萼、雌雄蕊各部分的长度、颜色、形状等,并拍照记录。
1.2.6 花粉胚珠比（P/O）及杂交指数（OCI） 花粉胚珠比（P/O）为平均单花花粉总量除以单花胚珠数。花粉计数方法为：随机选取盛花期滇龙胆单花30朵,以单花为单位,将单花中的花药全部取出,定容至1 mL,取5 μL统计所有花粉数,最后换算成单花花粉量。胚珠计数方法为：随机选取30朵单花,将单花中的胚珠全部取出,定容至250 μL,取5 μL统计所有胚珠数,最后换算成单花胚珠数量,然后根据Cruden的标准评判交配系统类型;杂交指数（OCI）由3个花部特征（花序直径、花朵大小及开花行为）决定,根据Dafni的标准进行测定、计算和评判 [6]。
1.2.7 人工交配处理 在滇龙胆盛花期,随机选择长势良好一致健康植株,每个处理至少30朵,重复3次。进行以下处理。（1）对照（CK）：不进行处理,自然授粉;（2）处理1（不去雄套纸袋）：用以检测自发自交发生的机率;（3）处理2（去雄套纸袋,不进行授粉）：用以检测是否存在无融合生殖现象;（4）处理3（去雄套网袋）：用以检测是否存在风媒传粉现象;（5）处理4（去雄不套袋）：用以检测传粉昆虫对生殖的贡献;（6）处理5（同株同花授粉）：检测自交亲和性;（7）处理6（同株异花授粉）：保留即将开放小花去雄套袋,等柱头可授性最高时,再授以同株异花的花粉,套袋;（8）处理7（异株异花授粉）,检测异交亲和性。所有的去雄工作均在花药未散粉时进行,人工授粉时先采集散粉的花粉,用毛笔蘸取花粉后或用镊子直接涂抹至柱头上。试验期间,对套袋的花朵经常进行检查,揭袋换气,防止霉变。授粉2个月后检测各处理结实率和结籽率,翌年1月采集果实,统计种子数,计算平均每果实种子数。
1.3 数据处理
采用SPSS 22软件处理系统进行数据Duncan’s检验、差异显著性分析,Microsoft Office Excel 2010软件进行数据录入,用GraphPad Prism 8软件作图。
2 结果与分析
2.1 单花开放动态观测
如图1所示,单花花期经历了萌芽到出现花蕾,到花冠完全开放,花药完全开裂散粉,花药脱落,花丝萎蔫,柱头伸出花冠,花冠萎蔫,子房膨大等一系列过程,单花开花物候期持续17~19 d。单花萌芽期持续4~6 d（图1A）,花冠紧缩闭合,且在这个时期雄蕊发育高于雌蕊;现蕾期持续6 d（图1C~图1D）,花苞逐渐伸长至出现紫红色,雌蕊和雄蕊也逐渐伸长;始花期持续2 d（图1E）,花冠微微开裂至1/2花冠;盛花期持续3 d（图1F、图1G）,雄蕊的花粉囊逐渐开裂至花粉完全散出,雌蕊逐渐伸长至高于雄蕊,柱头开始开裂伸长至高于花冠;花瓣凋零期持续2 d（图1H）,花冠开始闭合到完全闭合,直至萎蔫,但不脱落。雄蕊脱落,子房膨大。上述结果表明,滇龙胆的单花从花芽到花朵开放需要经历14 d的发育,花朵开放后经历5~6 d的盛开期完成传粉受精,之后花冠枯萎,包裹在发育的子房表面。子房进一步完成下一阶段种子的发育。
2.2 花序开放动态观测
2.3 单株开放动态观测
通过对滇龙胆单株花序持续观测发现,滇龙胆的单株有1至多个花序,小花多数,单株水平花期可持续8周（图4）。从11月进入开花期,至12月末全株小花凋谢。在整个开花期间,侧枝花蕾不断长出,花序不断开放。单株开花高峰期为开花第4~6周,每天开放花序数为1~2朵,之后开放花序逐渐减少,直至单株花序上花朵完全开放。
2.4 花部形态特征观测结果
滇龙胆花呈锥状桶形或宽桶形（图5）,花朵由花冠、萼片、雄蕊和雌蕊组成;花朵开放时花冠顶端分裂张开,呈五角星形,花冠长度在2~ 2.5 cm之间,花冠颜色呈红紫色或蓝紫色。通过对滇龙胆花朵整个发育阶段的观测,测量了各个阶段花朵的雄蕊长、雌蕊长、花苞长、小总花苞长和萼片长;从雄蕊和雌蕊的测量结果（图6、图7）来看,研究发现花朵的发育有雌雄异位现象,在现蕾期以前,雄蕊长度都显著长于雌蕊;特别是在萌芽初期雄蕊长度(1.0±0.1)cm,雌蕊长度(0.5±0.1)cm,雄蕊的长度是雌蕊的2倍。之后的现蕾期雄蕊长度发育减缓,雌蕊迅速发育,直到始花期（图6E）,雄蕊和雌蕊发育长度趋于一致,长度在(1.65±0.1)cm,此时雄蕊发育完全,花药发育饱满;在盛花期（图6F、图6G）雌蕊会进一步发育生长,最终长于雄蕊,此时柱头具有可授性,可以完成传粉受精过程。在之后的发育中,柱头完成受精,雌蕊下部子房发育膨大;雄蕊花药和花丝枯萎最终脱落。花苞的发育在完成受精前都是一个逐渐生长的过程（图7）,在发育到15 d时生长减缓长度在(3.6±0.1)cm。小总花苞长和萼片长度发育均缓慢生长,在发育到15 d时长度分别为(1.2±0.1)cm和(0.9±0.1)cm。
图6 雌蕊和雄蕊发育动态A~B：萌芽期;C：现蕾期;D~E：始花期;F~G：盛花期; H: 花瓣凋零期。 Fig. 6 Development of pistil and stamen A‒B: Germination period; C: Budding period; D‒E: Initial flowering period; F‒G: Full flowering period; H: Petal withering period |
2.5 OCI值
由表1可看出花朵直径集中在(15±1)mm~ (16.67±1.15)mm之间（>6 mm,记为3）;对花药开裂与柱头可授性时间间隔的观测结果发现,花药先开裂,柱头后生长伸出花冠（图6E）;研究发现开花第2天花粉活力最高,开花3~4 d后柱头才具有可授性,所以滇龙胆花朵的发育属于雄先熟（1）类型;在进一步的观测中,研究发现单花开放当天,随着柱头伸出花冠,花药远离柱头,之后花药开裂散粉脱落,与柱头没有接触,柱头与花药在空间上是分离的,雌蕊和雄蕊的空间间隔在(2.33±0.29)mm~(3.33±1.15)mm之间,即定义雌雄蕊器官在空间上存在分离,记为1。杂交指数（OCI）值为5,根据Dafni标准,滇龙胆属于异交型,部分自交亲和,需要传粉者。
表1 OCI观察测定结果Tab. 1 The results of observation and determination of hybrid index (OCI) |
| 观测位置 Observation position | 序号 Serial number | 数量 Number | 花朵直径 Flower diameter/mm | 雌雄蕊异熟 Dichogamy | 柱头与花药空间间隔 Space between stigma and anther/mm | 杂交指数值 Hybrid index value | 繁育系统类型 Type of breeding system |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 滇龙胆花药 | 1 | 3 | 16.67±1.15（3） | 雄蕊先熟（1） | 2.50±0.50（1） | 5 | 异交型,部分自交亲和,需要传粉者 |
| 2 | 3 | 14.67±1.15（3） | 雄蕊先熟（1） | 3.13±0.50（1） | 5 | ||
| 3 | 3 | 16.00±1.73（3） | 雄蕊先熟（1） | 2.50±0.50（1） | 5 | ||
| 4 | 3 | 15.17±0.76（3） | 雄蕊先熟（1） | 3.33±1.15（1） | 5 | ||
| 5 | 3 | 15.57±1.50（3） | 雄蕊先熟（1） | 2.67±0.28（1） | 5 | ||
| 6 | 3 | 14.67±1.53（3） | 雄蕊先熟（1） | 3.00±1.00（1） | 5 | ||
| 7 | 3 | 16.67±1.15（3） | 雄蕊先熟（1） | 2.50±0.50（1） | 5 | ||
| 8 | 3 | 15.67±1.53（3） | 雄蕊先熟（1） | 3.16±0.76（1） | 5 | ||
| 9 | 3 | 16.00±1.00（3） | 雄蕊先熟（1） | 3.00±1.00（1） | 5 | ||
| 10 | 3 | 15.00±1.00（3） | 雄蕊先熟（1） | 2.33±0.29（1） | 5 |
2.6 P/O值
表2 P/O值测定结果Tab. 2 Determination results of P/O |
| 观测位置 Observation position | 序号 Serial number | 数量 Number | 单花花药数 Number of anthers per flower | 单花花粉量 Pollen amount per flower | 胚珠数 Ovule number | 花粉胚珠比 Pollen ovule ratio | 繁育系统类型 Type of breeding system |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 滇龙胆花药 | 1 | 3 | 5 | 114 067±27 680 | 153±66 | 582.8±441.2 | 兼性异交型 |
| 2 | 3 | 5 | 119 533±33 140 | 153±77 | 915.9±433.7 | ||
| 3 | 3 | 5 | 118 133±33 073 | 110±34 | 1405.8±550.8 | ||
| 4 | 3 | 5 | 126 133±18 237 | 140±30 | 949.5±343.4 | ||
| 5 | 3 | 5 | 97 667±5 623 | 96±20 | 1047.2±256.9 | ||
| 6 | 3 | 5 | 108 933±28 381 | 160±79 | 777.9±341.1 | ||
| 7 | 3 | 5 | 98 333±8 488 | 133±20 | 753.8±169.3 | ||
| 8 | 3 | 5 | 99 600±3 985 | 106±15 | 946.5±136.1 | ||
| 9 | 3 | 5 | 129 400±18 543 | 120±43 | 902.3±281.3 | ||
| 10 | 3 | 5 | 120 000±19 745 | 123±30 | 1033.9±377.4 |
2.7 交配系统的测定结果
通过人工授粉套袋等处理对滇龙胆交配系统进行验证（图8）。结果表明,在自然条件下,滇龙胆的结实率和结籽率分别为90%和75.27%,说明滇龙胆交配系统对高山环境适应较好;去雄套纸袋结实率10%、结籽率1.77%,显著低于自然对照,说明滇龙胆不存在无融合生殖现象。而同株异花授粉滇龙胆结籽率高达82.71%,显著高于自然对照,说明滇龙胆具有高度的自交亲和特性。不去雄套纸袋隔离昆虫传粉的处理,其结实率和结籽率显著降低,分别为43.00%和17.88%,说明滇龙胆虽然自交亲和,自发自交现象出现频率极低,需要传粉者为其传粉才能结实。去雄套网袋的结实率和结籽率分别为12.44%和1.77%,而去雄不套袋具有较高的结实率和结籽率,分别为83.33%和86.47%,说明为滇龙胆花朵传粉方式可能是虫媒传粉,风媒传粉率低。滇龙胆自然条件下的结籽率为75.27%,而通过同株异花授粉和异株异花授粉后,结籽率显著提高至81.24%和93.67%,说明人工补充授粉,可显著提高其结籽率,说明自然条件下滇龙胆存在花粉限制。
图8 人工授粉实验结果柱中字母代表不同处理间结实率和结籽率差异显著（P<0.05）;图中线段代表±标准差（n = 30）。 Fig. 8 Result of artificial pollination experiment Letters in the column represent significant difference in seed setting rate and seed setting rate among different treatments (P<0.05); Line segments in the graph represent ± Standard deviation (n=30). |
3 讨论
研究发现,滇龙胆雌蕊和雄蕊存在雌雄异位的现象,并且雄蕊比雌蕊先熟,表现出雌雄异熟。滇龙胆花开放后雄蕊不再生长,而雌蕊继续生长,柱头从花药上方伸出,随后顶端分成2裂,柱头的2裂弯曲,改变了花中雌蕊的位置以及柱头和花药之间的相对距离[13]。滇龙胆花雌雄的成熟在时间上的分离以及雌蕊和雄蕊在空间上的异位,降低了自花授粉的可能性,促进异株异花授粉,从而增强其后代的环境适应能力[14⇓-16]。完成受精后花萼逐渐闭合,雌蕊下部的子房膨大发育。通过对授粉后滇龙胆花朵的持续观测,发现滇龙胆花冠枯萎后并不会脱落,而是紧紧闭合包裹着内部已经完成授粉的雌蕊,包裹的花被可以保护子房不受低温的侵害,这种进化的特征或许就是滇龙胆能够成功适应高山环境的关键原因。
通过杂交指数和花粉胚珠比的测定,发现滇龙胆花属于兼性异交型;人工辅助授粉试验结果显示滇龙胆繁育方式以异交为主,部分自交亲和,需要传粉者,不存在无融合生殖。自然状态下滇龙胆的结籽率可达75.27%,说明其异交传粉机制有效。而在不去雄套袋的自花授粉情况下结籽率为16.29%,说明在极端缺少传粉者情况下,物种会保持一定的自花传粉来维持物种的生存与繁衍[17]。滇龙胆柱头在开花后会分裂成2裂并向外弯曲,增大触及花粉的可能性,无处理套袋结实率为41.67%也证实了这一点。