槟榔（Areca catechu L.）系棕榈科（Palmae）热带作物,属多年生常绿乔木,主要分布在中非和东南亚。我国海南、台湾栽培较多,广西、云南、福建等地也有栽培。槟榔作为海南省的主要特色经济作物,种植面积约有15.58万hm2,据统计其初加工产值约有287.3亿元,是海南省230 万农民的主要经济来源[1]。槟榔含有丰富的功能活性成分,如多酚、多糖、生物碱等,具有多种药理作用[2]。但目前对槟榔功能活性物质的研究及开发不足,严重制约了槟榔的高附加值利用和产业发展。
糖尿病是对人类身体健康有重大危害的主要疾病之一,近些年来患糖尿病的人数不断地增加[3]。患糖尿病的主要原因是餐后高血糖的发生。而导致餐后高血糖发生的原因是人体内的α-葡萄糖苷酶水解多糖,释放出葡萄糖致使人体血糖浓度的升高[4]。因此缓解及治疗糖尿病患者的有效方法之一是寻找出对α-葡萄糖苷酶活性有抑制作用的物质,以达到对酶活性进行控制的目的[5]。目前用于临床医学治疗的抑制剂有阿卡波糖、伏格列波糖等,这些人工合成的抑制剂长期服用对人体有毒副作用,常见的副作用有消化系统紊乱等[6,7]。因此,如果能寻找出一种安全、高效、毒性小的抑制剂对医学治疗糖尿病方面的发展是非常重要的。
近年来,从植物中提取能够抑制α-葡萄糖苷酶的活性物质,并进行分离纯化、结构及相关抑制作用机理的研究,是α-葡萄糖苷酶抑制剂的研究热点[8]。目前国内外对槟榔多酚的研究主要集中在酚类物质的提取工艺、抗氧化及抑菌活性等方面[9,10],但关于槟榔多酚对α-葡萄糖苷酶活性抑制方面的相关研究较少。宋菲等[11]前期研究了槟榔水提物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用,结果表明槟榔籽、槟榔壳、槟榔花水提物均对酶的活性具有抑制作用,尤其是槟榔籽和槟榔壳水提物,且水提物中含有多酚类物质。因此,本研究以槟榔多酚（槟榔籽多酚和槟榔壳多酚）提取物为研究对象,采用体外酶抑制模型评价其对α-葡萄糖苷酶的抑制作用,并通过S-8大孔树脂对槟榔多酚提取物进行纯化;在此基础上,通过抑制动力学实验,判断酶活性抑制类型,同时研究槟榔多酚提取物与α-葡萄糖苷酶的结合性质及其对酶构象的影响,初步探讨其作用机制,不仅可以为新型天然降血糖药物及产品的开发提供参考,还可以为提高槟榔产品的附加值,促进槟榔产业的可持续发展提供科技支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 新鲜槟榔果采自中国热带农业科学院椰子研究所的槟榔种质资源圃,采收果龄为5~6个月,清洗表尘后晾干,并对半切开,60 ℃条件下干燥48 h,分别取槟榔壳、槟榔籽,采用粉碎机将其粉碎后,过24目筛,放入干燥器中备用。
α-葡萄糖苷酶（来源于酿酒酵母,酶活力为14.72 U/mg）,美国 Sigma 公司;阿卡波糖、对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）、福林酚、S-8大孔树脂,均为BR试剂,上海源叶生物科技有限公司;儿茶素标准品（色谱级,纯度≥98%）,上海源叶生物科技有限公司;乙醇等其他试剂均为国产分析纯。
1.1.2 仪器与设备 JA5003B电子天平,上海精科天美科学仪器有限公司;DHG-9140A电热鼓风干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司;DP-406DG 真空冷冻干燥机,无锡德普仪器制造有限公司;R-210旋转蒸发仪,瑞士步琪公司;Varioskan Flash全自动荧光免疫分析仪,美国Thermo Scientific公司;F-7000荧光分光光度计,日立高新技术公司。
1.2 方法
1.2.1 槟榔多酚的提取 分别取50.00 g的槟榔籽和槟榔壳样品（m1）,按料液比1∶10（W/V）加入75%乙醇,置于超声波发生器中提取,提取条件为水浴温度为60 ℃、频率为40 kHz、时间为30 min,重复提取4次,之后用200目纱布过滤,再经孔径为0.45 μm的有机滤膜真空抽滤,然后合并滤液,旋转蒸发除去乙醇,浓缩物用超纯水复溶后进行冷冻干燥,得到多酚提取物粉末并称量质量（m2）。多酚提取率采用如下公式计算：
$多酚提取率=\frac{{{m}_{2}}}{{{m}_{1}}}\times 100\%$
1.2.2 槟榔多酚的纯化 参考文献[12]的方法,采用S-8大孔树脂纯化槟榔多酚提取物。称取16.91 g树脂,湿法装柱（2 cm × 28 cm）,将200 mL浓度为0.50 mg/mL的槟榔多酚粗提液,以4 BV/h的上样流速过柱,吸附结束后用80 mL的蒸馏水洗去残液,并用170 mL 60%浓度的乙醇以4 BV/h的洗脱流速进行洗脱,收集洗脱液,旋转蒸发使乙醇溶剂除去,得到纯化后的槟榔多酚。
1.2.3 多酚含量的测定 称取一定质量的多酚提取物（m1）,采用福林酚法测定提取物中的多酚含量（m2）[12],结果以儿茶素当量表示。测得儿茶素的标准曲线为y=0.0039x+ 0.0784,R2=0.9962,有效浓度范围为0~100 μg/mL。多酚含量采用如下公式计算：
$多酚含量=\frac{{{m}_{2}}}{{{m}_{1}}}\times 100\text{ }\!\!\%\!\!\text{ }$
1.2.4 α-葡萄糖苷酶活性抑制率测定 采用文献[11]中的方法,分别测定纯化前后的槟榔多酚提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率。
1.2.5 抑制动力学实验 参考文献[11]中的方法测定纯化后的槟榔多酚提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用的动力学。其中,纯化后的槟榔籽多酚提取物的浓度为0、0.2、0.4 μg/mL,纯化后的槟榔壳多酚提取物的浓度为0、0.1、0.3 mg/mL。以酶浓度为横坐标,酶反应变化速率V（ΔA/min）为纵坐标作图,判断抑制类型是否可逆。以底物PNPG的浓度Q的倒数（1/Q）为横坐标,反应速率V的倒数（1/V）为纵坐标作图,得到Lineweaver- Burk双倒数曲线,以此判断可逆抑制类型。
1.2.6 荧光光谱分析 准确移取4.0 mL 待测溶液于1 cm 荧光池中,检测其荧光光谱。α-葡萄糖苷酶溶液的终浓度为1 U/mL,纯化后的槟榔籽多酚提取物的终浓度为0、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20 μg/mL,纯化后的槟榔壳多酚提取物的浓度分别为0、5、10、15、20、25、30、35 μg/mL。混合均匀后室温下作用5 min,在激发波长为280 nm,发射波长300~500 nm范围内扫描混合样品的荧光光谱,激发光和发射光狭缝均为5.0 nm。
1.2.7 同步荧光光谱分析 准确移取4.0 mL待检溶液于1 cm荧光池中,检测其同步荧光光谱。α-葡萄糖苷酶溶液的终浓度为1 U/mL,纯化后的槟榔籽多酚提取物的终浓度为0、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20 μg/mL,纯化后的槟榔壳多酚提取物的浓度分别为0、5、10、15、20、25、30、35 μg/mL,混合均匀后室温下作用5 min,分别以Δλ（激发波长与发射波长的距离）为15 nm和60 nm,扫描混合样品在300~500 nm范围内的同步荧光光谱,狭缝为5.0 nm。
1.3 数据分析
采用 SPSS 16.0 软件进行数据统计分析。
2 结果与分析
2.1 槟榔多酚的含量
槟榔籽、槟榔壳的多酚提取率及多酚含量见表1。槟榔籽多酚提取率为(49.06±1.34)%、槟榔壳多酚提取率为(16.74±2.47)%。槟榔籽、槟榔壳提取物的多酚含量分别为(43.83±2.48)%、(3.00±0.08)%,结果表明,槟榔籽提取物中多酚含量显著高于槟榔壳提取物中多酚含量（P<0.05）。经S-8大孔树脂纯化后槟榔籽、槟榔壳提取物中多酚含量分别为(79.18±3.81)%、(27.27±1.76)%,较纯化前均显著提高,是未纯化时的1.81倍、9.08倍。
表1 槟榔籽、槟榔壳多酚提取率及含量Tab. 1 Yield of polyphenols extracts and content of areca seed and areca shell |
| 样品 Samples | 多酚提取率 Yield of polyphenol extracts/% | 提取物中多酚含量 Polyphenols content in extracts/% | 纯化后的多酚含量 Contents of polyphenols after purification/% |
|---|---|---|---|
| 槟榔籽 | 49.06±1.34a | 43.83±2.48a | 79.18±3.81a |
| 槟榔壳 | 16.74±2.47b | 3.00±0.08b | 27.27±1.76b |
注：同列不同小写字母表示组间数据差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference in data between groups (P<0.05). |
2.2 槟榔多酚提取物对 α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用
图1 不同样品对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig. 1 Inhibition effect on α-glucosidase activity of different samples |
表2 不同样品对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的IC50值Tab. 2 IC50 value of inhibition on α-glucosidase activity of different samples |
| 样品 Samples | IC50值 IC50 value/(mg·mL-1) |
|---|---|
| 阳性对照（阿卡波糖） | 0.71±0.09c |
| 未纯化的槟榔籽多酚提取物 | (3.40±1.20)×10-4 a |
| 纯化的槟榔籽多酚提取物 | (3.30±1.00)×10-4 a |
| 未纯化的槟榔壳多酚提取物 | 1.73±0.31d |
| 纯化的槟榔壳多酚提取物 | 0.14±0.09b |
注：同列不同小写字母表示组间数据差异显著 (P< 0.05)。 | |
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference in data between groups (P<0.05). |
2.3 槟榔多酚提取物对 α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的动力学实验
图3 纯化的槟榔籽（A）及槟榔壳（B）多酚提取物对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的Lineweaver-Burk曲线Fig. 3 Lineweaver-Burk curve of inhibition on α-glucosidase activity by purified areca seed and areca shell polyphenol extracts |
表3 纯化的槟榔多酚提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制动力学参数Tab. 3 Kinetic parameters of inhibition on α-glucosidase activity of purified areca nut polyphenol extracts |
| 样品 Samples | 样品浓度 sample concentration /(μg·mL-1) | 方程 Equation | R2 | Vmax /(ΔA·min-1) | Km /(mmol·L-1) |
|---|---|---|---|---|---|
| 对照组 | y=19.70x+ 16.95 | 0.992 | 0.059 | 1.16 | |
| 槟榔籽多酚提取物 | 0.2 | y=43.55x+ 27.77 | 0.959 | 0.036 | 1.57 |
| 槟榔籽多酚提取物 | 0.4 | y=102.93x+52.46 | 0.995 | 0.019 | 1.96 |
| 槟榔壳多酚提取物 | 0.1×103 | y=55.54x+ 28.06 | 0.991 | 0.036 | 1.98 |
| 槟榔壳多酚提取物 | 0.3×103 | y=156.15x+59.13 | 0.973 | 0.017 | 2.64 |
2.4 荧光光谱分析
2.5 同步荧光光谱分析
Δλ为60 nm或15 nm时,显示的是色氨酸残基、酪氨酸残基的荧光光谱特性。通过扫描加入不同浓度的样品在Δλ=60 nm和Δλ=15 nm时的同步荧光光谱,分析样品对α-葡萄糖苷酶结构的影响。
图5 纯化的槟榔籽多酚提取物与α-葡萄糖苷酶相互作用的同步荧光光谱图Fig. 5 Simultaneous fluorescence spectra of purifie dareca polyphenol extracts interacting with α-glucosidase |
3 讨论
本研究提取了槟榔多酚（槟榔籽、槟榔壳多酚）,并采用S-8大孔树脂进行了纯化,结果表明,纯化前后槟榔籽多酚对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用比阿卡波糖强;而槟榔壳多酚在纯化前比阿卡波糖弱,但纯化后对酶的抑制作用提高,效果优于阿卡波糖。上述结果提示,槟榔多酚可能通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性进而发挥降血糖的功能。
抑制剂对酶的抑制类型有2种,分别为可逆抑制和不可逆抑制[18],判断依据为抑制剂与酶结合特点的不同。本研究的结果表明,纯化后的槟榔籽及槟榔壳多酚提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制类型均属于可逆抑制,表明其与酶的结合方式为非共价键结合。这种抑制作用可通过物理方法使酶的活性得到恢复。可逆抑制类型又分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。研究结果表明,纯化后的槟榔籽及槟榔壳多酚提取物对酶的抑制类型为竞争性与非竞争性的混合型可逆抑制。该结果与文献中竹叶椒乙醇提取物[19]、芳姜黄酮及其衍生物[20]对α-葡萄糖苷酶的抑制类型不同,它们是竞争性抑制。与前期的槟榔籽和槟榔壳的水提物[11]研究结果相同。通过对荧光光谱分析可知,纯化后的槟榔籽多酚和槟榔壳多酚对α-葡萄糖苷酶内源性荧光具有淬灭作用,但对酶的构象没有太大影响。同步荧光光谱分析结果也表明,其对α-葡萄糖苷酶中的酪氨酸和色氨酸残基都没有影响。
本研究结果表明,槟榔多酚对α-葡萄糖苷酶具有很好的抑制作用,对于槟榔在新型天然、高效降糖药物的开发应用方面具有重要意义。普义鑫[21]对S-8大孔树脂纯化的槟榔多酚进行了结构鉴定,表明芦丁、绿原酸、表儿茶素、没食子酸是槟榔多酚中的组分;祁静等[22]研究了槟榔壳多酚的组分,确定其中含有(-)-表儿茶素、(+)-儿茶素、柚皮素、山奈素、阿魏酸、绿原酸等。据报道这些多酚类物质都具有一定的抗氧化活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性,但其对α-葡萄糖苷酶的抑制率均低于本研究中的槟榔籽多酚提取物。因此,对于槟榔多酚提取物中主要发挥α-葡萄糖苷酶抑制作用的单体活性化合物是什么,其结构分析和不同的酚类物质之间的协同作用,以及对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用机理都有待进一步深入的研究。