油梨（Persea americana Mill.）又名鳄梨、牛油果、酪梨和樟梨等,为樟科（Lauraceae）鳄梨属（Persea）,原产于中、南美洲,属热带、亚热带常绿乔木果树[1]。其果实营养丰富、风味好,是一种高能低糖水果,可作为糖尿病人及减肥人群的保健食品。13世纪,墨西哥已开始种植油梨,20世纪初,国外开始将油梨作为商业性果树广泛种植[2]。我国于1918年开始引进种植,目前主要分布在广东、福建、台湾、云南、广西和海南等省（区）[3]。
国内外已报道的油梨病害有Phytophthora cinnamomi[4]、Armillaria tabescens、Papulaspora sp.和Ustulina sp.[5]引起的根腐病;Rosellinia necatrix[6]、Raffaelea lauricola[7,8]、Verticillium alboatrum[9]、P. citricola[10]、Neofusicoccum parvum[11,12]和P. palmivora[13]引起的茎部病害;Pseudomonas syringae[14]引起的树皮溃疡病;Pestalotiopsis sp.[15]引起的梢枯病;Botryosphaeria dothidea[16]、Pseudocercospora purpurea[17]、Lasiodiplodia theobromae[18]、Colletotrichum gloeosporioides、C. fructicola[19,20]和Pestalotiopsis sp.[21]引起的果实病害;Avocado sunblotch viroid[22,23]引起的日斑类病毒病。其中,根腐病是制约油梨产业快速发展的重要病害之一,而由樟疫霉引起的根腐病又是最严重的一种土传病害,具有相当强的侵染能力,该病害严重时会导致整个油梨园毁灭[24]。1984年,Zentmyer[5]报道了引起油梨根腐病的病原菌为P. cinnamomi。1997年,谢光煜等[25]报道了广西油梨根腐病的病原菌为P. cinnamomi。
2018年9月,笔者在海南省白沙黎族自治县大岭农场附近的某种植基地发现一种为害油梨根部的病害。该病害最初从根尖侵染,逐渐向侧根、主根和茎基部扩展,最终导致植株死亡,发病率为5%~10%。本研究对该病害进行田间症状描述和病原菌分离纯化、鉴定、生物学特性和室内药剂筛选,以期为田间油梨根腐病的发生、流行和防控提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病株采集 2018年9月,3 a树龄油梨病株采自海南省白沙黎族自治县大岭农场附近的某种植基地。
表1 本研究所用引物Tab. 1 Primers used in this study |
| 基因 Gene | 退火温度 Annealing temperature/℃ | 引物 Primer | 引物序列（5°-3°） Primer sequence (5°-3°) |
|---|---|---|---|
| ITS | 59 | ITS1 | TCCGTAGGTGAACCTGCGG |
| ITS4 | TCCTCCGCTTATTGATATGC | ||
| LSU | 51 | LROR | GTACCCGCTGAACTTAAGC |
| LR7 | TACTACCACCAAGATCT | ||
| COXⅡ | 52 | FM82 | TTGGCAATTAGGTTTTCAAGATCC |
| FM78 | ACAAATTTCACTACATTGTCC |
表2 供试药品名称及其浓度Tab. 2 Names and concentrations of fungicides tested |
| 药剂 Fungicides | 生产厂家 Manufacture factory | 药剂浓度 Concentration /(µg·mL-1) |
|---|---|---|
| 50%烯酰吗啉WP | 巴斯夫植物保护 （江苏）有限公司 | 0.3、0.2、0.1、0.05、0.02 |
| 15%氟吗·精甲霜WP | 青岛奥迪斯生物科技有限公司 | 0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 |
| 69%烯酰·锰锌WP | 山东圣鹏科技股份有限公司 | 3、1、0.8、0.5、0.2 |
| 60%丙森·醚菌酯WG | 海利尔药业集团股份有限公司 | 20、10、5、1、0.5 |
| 68%精甲霜·锰锌WG | 先正达（苏州）作 物保护有限公司 | 10、5、2、1、0.5 |
| 60%锰锌·氟吗啉WP | 沈阳科创化学品有限公司 | 8、6、4、2、1 |
| 64%噁霜·锰锌WP | 先正达（苏州）作 物保护有限公司 | 20、10、5、2、1 |
| 72%霜脲·锰锌WP | 陶氏益农农业科技（江苏）有限公司 | 30、20、10、5、2 |
| 62.5%精甲·咯菌腈CS | 杭州宇龙化工有限公司 | 120、100、50、10、2 |
| 45%敌黄钠WP | 丹东市农药总厂 | 120、100、80、50、20 |
1.2 方法
1.2.1 菌株的分离及纯化 采用组织分离法[26]对菌株进行分离。具体方法如下：选取具有典型症状的发病侧根,用自来水清洗干净,晾干,在超净工作台取5 mm发病侧根,先用75%酒精消毒30 s,2%次氯酸钠消毒3 min,再用无菌水清洗3次（每次30 s）,置于10% V8培养基上,28 ℃连续光照培养,待病根组织块长出少量菌丝时,挑取菌落边缘菌丝至新鲜的10% V8培养基上培养5 d,用无菌接种针挑取菌丝尖端纯化菌株,并将纯化的菌株转接于10% V8斜面培养基,于25 ℃保存备用。
1.2.2 菌株的致病性测定 试验材料为灭菌基质上培育的健康油梨幼苗,采用无伤和刺伤2种方式进行致病性测定。将菌株置于28 ℃连续光照的培养箱中培养6 d,用直径5 mm的无菌打孔器取菌饼,然后将菌饼紧贴在油梨苗根部,对照组用无菌培养基,表面覆盖无菌吸水纸保湿,每个处理10株,重复3次,观察和记录发病情况。待出现症状后,取发病根部再分离病原菌,观察菌落特征和孢子囊形状。
1.2.3 病原菌形态学鉴定 28 ℃,连续光照条件下,用10% V8培养基培养病原菌6 d后,从菌落上挑取菌丝体至10% V8培养液中培养24 h,再从培养液中挑取菌丝体至土壤浸出液中培养24 h,诱导产生大量球形厚垣孢子和孢子囊。
1.2.4 病原菌的分子生物学鉴定 用无菌药匙刮取新鲜气生菌丝100 mg,用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒（OMEGA BIO-TEK）提取基因组DNA。PCR扩增所用的通用引物见表1。用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物并纯化后,由生工生物工程（上海）股份有限公司完成序列测定。测序序列在NCBI数据库进行BLAST比对后,提交序列至GenBank。从GenBank数据库中下载已报道的其他相关基因序列,用拼接软件SequenceMatrix按照ITS-LSU-COXⅡ顺序串联,用MEGA 7.0软件的最大似然法构建系统发育树。
1.2.5 生物学特性测定 （1）培养基对菌丝生长的影响。28 ℃,黑暗条件下,用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）培养病原菌6 d,用直径5 mm灭菌打孔器取菌饼,然后分别转接至PDA、马铃薯胡萝卜琼脂培养基（PCA）、玉米粉琼脂培养基（CMA）、番茄琼脂培养基（TA）、10% V8培养基、燕麦琼脂培养基（OMA）、大豆琼脂培养基（SA）和胡萝卜琼脂培养基（CA）,培养4 d,每个处理重复4次,用十字交叉法测量菌落直径。
（2）温度对菌丝生长的影响。设置8个温度梯度,分别为15、20、25、28、30、32、35、40 ℃,然后将菌饼转接至PDA培养基上,培养7 d,每个处理重复4次。培养条件、菌饼制备和菌落直径测量方法同1.2.5-（1）。
（3）pH对菌丝生长的影响。高压蒸汽灭菌后,用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液调节PDA培养基pH,pH分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11,转接菌饼至PDA培养基上,培养7 d,每个处理重复4次。培养条件、菌饼制备和菌落直径测量方法同1.2.5-（1）。
（4）光照对菌丝生长的影响。将3个培养箱分别设置24 h光照、12 h光暗交替和24 h黑暗,转接菌饼至PDA培养基上培养7 d,每个处理重复4次。培养条件、菌饼制备和菌落直径测量方法同1.2.5-（1）。
1.3 数据处理
采用Microsoft Excel 2016软件和Graphpad Prism 8软件对试验数据进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 田间症状描述
2.2 菌株致病力测定
图2 油梨根腐病菌的致病性测定A：刺伤接种发病植株和对照植株;B：刺伤接种发病的侧根（15 d）;C：刺伤接种对照植株的侧根;D：无伤接种发病植株和对照植株;E：无伤接种发病的侧根（15 d）;F：无伤接种对照植株的侧根。 Fig. 2 Pathogenicity tests of avocado root rot pathogen A: Symptoms of wounded inoculation and control plant; B: Branch root of wounded inoculation (15 d); C: No wounded control; D: Symptoms of no wounded inoculation and control plant; E: Branch root of no wounded inoculation (15 d); F: Wounded control. |
2.3 病原菌形态观察
图3 病原菌的形态特征A：无隔菌丝体;B：珊瑚状的菌丝膨大体;C：放大的珊瑚状菌丝膨大体;D：簇生的厚垣孢子;E：顶生的厚垣孢子;F：椭圆形孢子囊;G：卵圆形孢子囊。 Fig. 3 Morphological characteristics of the pathogen A: Non-septate mycelium; B: Mycelium like coral; C: Amplification mycelium like coral; D: Clustered chlamydospores; E: Terminal chlamydospores; F: Elliptical sporangia; G: Oval sporangia. |
2.4 病原菌分子生物学鉴定
将克隆和测序得到的病原菌YLPC0321的ITS、LSU和COXⅡ序列提交至GenBank,登录号分别为MT229356、MT240478和MT233527。将3个基因序列在NCBI上进行BLAST比对,并与NCBI下载的序列构建系统发育树。结果表明：病原菌YLPC0321与P. cinnamomi在自举值为100%水平上聚在同一个进化分支（图4）。根据形态学鉴定和分子生物学分析,最终将油梨根腐病病原菌鉴定为樟疫霉（P. cinnamomi Rands）。
2.5 生物学特性测定
2.5.1 培养基对菌丝生长的影响 在供试的8种培养基上病原菌YLPC0321的菌丝生长速率存在显著差异（图5）。SA培养基上菌丝生长速度最快,培养4 d菌落直径达7.5 cm,气生菌丝不发达;而在PDA培养基上的菌落气生菌丝发达,呈花瓣状,边缘不整齐,菌丝生长速度较快;在PCA、10% V8、TA、OMA、CA、CMA培养基上的菌落平展,不呈花瓣状,边缘较为整齐,气生菌丝较发达或极不发达。
2.5.2 温度对菌丝生长的影响 病原菌YLPC 0321在15~30 ℃间均能生长。在15~28 ℃间,不同处理温度之间存在显著差异,菌丝生长速度不断增加,当温度达到28 ℃时,菌丝生长速度最快,菌落直径达7.52 cm;在28~30 ℃时,菌丝生长速度随温度的增加开始缓慢下降,在32~35 ℃时,菌丝生长速度急剧下降,当温度达到40 ℃时,菌丝停止生长。由此可说明该病原菌的最适生长温度为28 ℃（图6）。
2.5.3 pH对菌丝生长的影响 病原菌YLPC0321在pH 3~10时均能生长。pH为3~8时,不同pH之间存在显著差异,菌丝生长速率随pH的增加而显著增加。pH为8时,菌落直径最大,为6.68 cm;pH为8~10时,不同pH之间存在显著差异,菌丝生长速率随pH的增加呈明显的负增长;pH为11时,菌丝停止生长（图7）。说明该病原菌更适合生长在微碱性环境中,过酸或过碱均不适合该病原菌的生长。
2.5.4 光照对菌丝生长的影响 不同光照条件对病原菌菌丝生长具有显著影响。黑暗条件下,菌丝生长速度最快,直径达7.85 cm;光暗交替条件下,菌丝生长速度较快,直径达6.87 cm;光照条件下,菌丝生长速度最慢,直径为6.39 cm（图8）。由此可知,该病原菌更适合生长在黑暗条件下。
2.6 室内药剂筛选
结果显示,10种药剂对油梨根腐病病原菌生长的抑制效果不同。烯酰吗啉的抑制作用最强,EC50为0.0929 µg/mL,氟吗·精甲霜和烯酰·锰锌的EC50均小于1 µg/mL,其中,氟吗·精甲霜的EC50为0.4146 µg/mL,丙森· 嘧菌酯、精甲霜·锰锌、锰锌·氟吗啉、噁霜·锰锌和霜脲·锰锌的抑制效果相对较弱,而精甲·咯菌腈和敌磺钠对病原菌的抑制作用最差,EC50分别为12.4525 µg/mL（表3）和39.9554 µg/mL。因此,烯酰吗啉可以作为进一步进行田间防治效果试验。
表3 不同药剂对油梨樟疫霉菌的室内毒力Tab. 3 Toxicity of different fungicides on P. cinnamomic of avocado pathogen |
| 药剂 Fungicides | 回归方程 Regression equation | 相关系数 Correlation coefficient | EC50 /(µg·mL-1) |
|---|---|---|---|
| 烯酰吗啉 | y=3.1125x+8.2116 | 0.9403 | 0.0929 |
| 氟吗·精甲霜 | y=5.9358x+2.4471 | 0.9626 | 0.4146 |
| 烯酰·锰锌 | y=2.7351x+5.0853 | 0.9352 | 0.9307 |
| 丙森·嘧菌酯 | y=1.4753x+4.6427 | 0.9437 | 1.7466 |
| 精甲霜·锰锌 | y=1.8105x+4.4914 | 0.9658 | 1.9094 |
| 锰锌·氟吗啉 | y=4.1485x+2.9861 | 0.9926 | 3.0580 |
| 噁霜·锰锌 | y=3.0516x+2.6296 | 0.9115 | 5.9810 |
| 霜脲·锰锌 | y=2.3481x+2.8665 | 0.9665 | 8.1024 |
| 精甲·咯菌腈 | y=0.7308x+4.1996 | 0.9853 | 12.4525 |
| 敌磺钠 | y=2.6920x+0.6885 | 0.9488 | 39.9554 |
3 讨论
樟疫霉（P. cinnamomi）属腐霉科（Pythiaceae）疫霉属（Phytophthora）,分布地区和寄主范围十分广泛,目前,它主要分布在亚洲、非洲、北美洲、南美洲、中美洲和大洋洲等地区,可侵染凤梨、木瓜、香樟、兰屿肉桂、雪松、山茶和油梨等,其寄主多达3000种,造成农作物巨大的经济损失。1922年,Rands从印尼的苏门答腊岛地区发病的肉桂树上首次发现樟疫霉（P. cinnamomi）[4, 29-33]。1942年,在美国加州首次鉴定樟疫霉是引起油梨根腐病的病原菌[4]。该病害首先从根尖或根部伤口侵入,继而逐渐向侧根、主根和茎基部扩展,最终导致植株死亡。在国内,关于樟疫霉引起的油梨根腐病的报道主要是综述性文献[34]。本研究中,笔者通过对病害田间症状诊断及描述、病原菌分离及纯化、致病性测定、病原菌形态学鉴定和分子生物学分析,将为害油梨根部病害的病原菌鉴定为樟疫霉（P. cinnamomi）,属国内首次结合形态学和分子生物学鉴定油梨根腐病的病原。
本文较系统地研究了油梨根腐病菌的生物学特性。在供试的8种培养基中,病原菌均可生长,但病原菌在PDA培养基上的菌落呈花瓣状,且菌丝最为浓密,较适合病原菌的生长。徐敬友等[35]报道了从雪松上分离的樟疫霉菌在OMA培养基上气生菌丝生长旺盛,而本研究中,樟疫霉菌在OMA培养基上气生菌丝不旺盛,不适合该病原菌的生长;该病原菌对温度的适应范围相对较广,在15~35 ℃均能生长,在25~30 ℃生长良好,最适生长温度为28 ℃。王明生等[32]报道樟疫霉生长的最适温度范围为26~29 ℃,与本研究的结论基本相同;该病原菌更适合生长在微碱性的环境中,最适生长的pH为8,与郑小波[29]的报道一致,而谢光煜等[25]报道,土壤pH为6.5时,最利于该病害发生;黑暗条件更有利于该病原菌的生长。
目前,Fungicide Resistance Action Committee（FRAC）报道了可用于防治由樟疫霉引起的油梨根腐病的杀菌剂有精甲霜灵和亚磷酸。精甲霜灵可用于防治由疫霉属和其他卵菌纲引起的病害[36],可以干扰病原菌RNA聚合酶并阻断病原菌RNA的合成[37],可有效抑制菌丝体生长和产孢,但其缺点是对病原菌作用位点单一,易产生抗药性[38]。亚磷酸可以直接抑制病原菌生长,但其具体作用方式尚不清楚[39,40],据报道可能与宿主植物防御系统的诱导有关[41,42]。本研究在室内条件下测定了10种药剂对油梨樟疫霉菌生长的抑制效果,结果表明烯酰吗啉的抑制效果最好,EC50为0.0929 µg/mL,后续可以进行田间防治效果试验,并对其作用方式进行研究。
在油梨种植过程中,应采取“预防为主、综合防治”的方针防控油梨根腐病的发生。樟疫霉是一种土传病害[24],在潮湿、偏碱的环境有利于病害的发生,高温、干旱和偏酸的环境对病害的发生不利。在种植油梨前,应深翻暴晒土壤减少菌源侵染,适当增施有机肥,以丰富土壤的微生态环境,施用酸性肥料降低土壤pH,营造不利于病原菌生长的环境,可以有效控制病害的发生;选择肥力高,土层较厚的沙土为宜,这种地块土壤通透性好,雨后有利于及时排出积水;选用健壮种苗,深沟高畦栽培,可及时排水,降低田间湿度;田间植株得病后,可采取化学药剂防治。本研究结果表明,烯酰吗啉对菌丝生长的抑制效果最好,可进一步进行田间防治试验;病株死亡后,提倡原位处理,不建议清除病株,因为在清除病株时,病原菌所处的微生态环境遭到破坏,可能会向周围蔓延,从而侵染其他健康的植株,造成根腐病发生更加严重。油梨根腐病在全世界所有种植区都有发生,是制约油梨产业发展的重要因素之一,本研究为今后油梨病害的田间防控提供了一定的理论依据。