近年来广西柑橘产业发展迅猛,种植面积和产量均居全国首位。但是生产上大量使用嫁接苗,容易导致柑橘病毒病流行,严重威胁柑橘产业的健康发展[1]。已报道的广西柑橘病毒病的病原主要有柑橘碎叶病毒（Citrus tatter leaf virus, CTLV）[2,3,4]、柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus, CYVCV）[5]、柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus, CTV）[6]、柑橘裂皮病（Citrus exocortis viroid, CEV）[7]、温州蜜柑萎缩病（Satsuma dwarf virus, SVD）[8]等。柑橘碎叶病的病原有2种,分别是CTLV和苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus, ASGV）[9],其中最早于1908年在加利福尼亚的“迈耶”柠檬上发现了CTLV[4]。CTLV属于β线性病毒科（Beta fexiviridae）、发状病毒属（Capillovirus）的正义单链RNA病毒,大小为600~700 nm×15 nm,呈线性弯曲状[10]。CTLV易于机械传播,尚无通过介体传播的证据。该病毒在我国浙江、广东、广西、福建、台湾及湖南等地均有发现,在澳大利亚、南非和美国等国家也有发现[11]。该病毒对以枳及枳的杂种为砧木的柑橘树危害最大。感染特征为枳砧嫁接口肿大,结合处不亲和,截面呈黄褐色,易断裂,叶脉黄化,叶片易脱落,植株矮化等,严重时整株枯死。CTLV的外壳蛋白（coat protein, CP）基因序列的进化关系与宿主和地理来源均无明显相关性[9]。ASGV是β线性病毒科发状病毒属的代表种,其病毒粒子长为620~680 nm,直径为12 nm的弯曲线状[12]。ASGV在世界各地均普遍存在,是果树上一种重要的潜在病毒,该病毒寄主范围广泛,侵染率高,可以侵染苹果、梨、柑橘等果树。ASGV在苹果植株上的为害症状不明显[13,14],但对植株生长、果实产量和品质等造成严重危害,导致产量下降[15]。Hilf等[16]用ASGV抗体在柑橘碎叶病样品中检测到ASGV,其CP基因序列的同源性与宿主及地理位置无显著相关性[17,18]。柑橘叶斑病毒（Citrus leaf blotch virus, CLBV）是近年来国内新报道的一种柑橘病毒[19],该病毒属于β线性病毒科柑橘病毒属（Citrivirus）的正义单链RNA病毒
近年来,广西柑橘产业发展迅速,但是由于部分种植区田间管理不规范,病毒病日趋严重,导致果品及产量逐年下降。对广西多个柑橘种植区的柑橘碎叶病和叶斑病的发生情况进行调查,采集疑似病毒病样品进行病原分子鉴定和遗传多样性分析,将初步明确广西柑橘碎叶病和叶斑病发生情况及其病原的遗传多样性,为进一步研究和防治柑橘病毒病奠定基础。
1 材料与方法
1.1 田间调查及采样
2018年12月至2019年11月,对广西南宁、崇左、柳州、桂林、玉林、河池、贺州及防城港等8个主要柑橘种植区的不同品种进行柑橘病毒病调查。根据植株嫁接口肿大、叶片偏小且边缘不规则、叶片皱缩、叶脉变黄等表观特征,采集疑似病毒病样品,以及少量无症状样品,样品经液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱备用。
1.2 方法
1.2.1 柑橘叶片总RNA的提取 剪取50~100 mg柑橘叶片样品,置于备有2颗无菌钢珠的2 mL RNase free离心管中,使用研磨仪研成粉末状,用天根生化科技（北京）有限公司的RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取总RNA。按照试剂盒说明书进行操作,最后取1 μL纯化的总RNA样品,用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳以检测提取的总RNA质量,剩余RNA样品保存于-80 ℃冰箱备用。
表1 柑橘病毒检测引物Tab. 1 Citrus virus detection primers |
| 病毒名称 Virus name | 引物 Primers | 序列（5¢-3¢） Sequence (5¢-3¢) | 片段大小 Product Sizes/bp |
|---|---|---|---|
| CLBV | CLBV1F | AGCCATAGTTGAACCATTCCTC | 425 |
| CLBV5R | GCAGATCATTCACCACATGC | ||
| ASGV | ASGV-U | CCCGCTGTTGGATTTGATACACCTC | 499 |
| ASGV-2 | GGAATTTCACACGACTCCTAACCCTCC |
1.2.3 RT-PCR扩增 以柑橘叶片总RNA为模板进行反转录,反转录体系：4×gDNA wiper Mix 4 μL,RNA模板1 μL,RNase-free ddH2O 11 μL,瞬时离心,42 ℃水浴2 min;再加5×Hiscript III qRT Super Mix 4 μL,瞬时离心。反转录程序：37 ℃ 15 min;85 ℃ 5 s;4 ℃保存。所得cDNA稀释1倍,保存于-20 ℃备用。以cDNA为模板,分别使用CLBV、ASGV检测引物CLBV1F/5R和ASGV-U/-2对cDNA进行PCR扩增。在干净的PCR管中,加入2×Rapid Taq Master Mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL;上游引物（10 μmol/L）1 μL,下游引物（10 μmol/L）1 μL;已稀释的cDNA模板1 μL。PCR反应程序为：预变性95 ℃,3 min;变性94 ℃,15 s;退火56 ℃,15 s;延伸72 ℃,15 s;35个循环;72 ℃彻底延伸5 min;于4 ℃保存。
1.2.4 RT-PCR产物电泳及测序 取5 μL的扩增产物在1×TAE缓冲液中,于1.5%琼脂糖凝胶（含GoldView I型核酸染色剂）中以120 V、20 min,检测其完整性,用BIO RAD凝胶成像系统进行拍照分析。目的条带清晰明亮的片段采用PCR产物直接测序法,目的条带较暗淡的片段采用PCR产物纯化法,提高产物浓度。本研究所有阳性样品的PCR产物委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行正反链双向测序,对目标片段内正反向序列完全吻合的序列加以采用。所得核酸序列在NCBI数据库中用BLAST程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi）进行比对分析。
1.2.5 CTLV、ASGV和CLBV基因组的系统发育分析 为了分析CTLV、ASGV和CLBV基因组序列的系统发育关系,首先从GenBank基因组数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）中分别检索了所有与ASGV、CTLV和CLBV相关的序列,然后分别选择具有代表性的ASGV、CTLV和CLBV分离物的CP基因序列,分别与本研究获得的ASGV、CTLV和CLBV分离株的CP基因序列通过ClustalW程序与默认参数进行比对分析（表2）。序列对齐后,分别在序列的5°和3°端裁掉不对应的部分碱基以及删去本研究中一致性较高的序列,利用MEGA 7.0.26软件采用邻接法构建进化树,校检次数（bootstrap）为1000次。再根据构建的系统进化树分析各分离物的寄主和地理位置的相关性。
表2 26个广西柑橘碎叶病毒和柑橘叶斑病毒分离物的登录号Tab. 2 Registration numbers of 26 citrus leaf shatter virus and citrus leaf spot virus isolates from Guangxi |
| 分离物编号 Isolates No. | 寄主 Host | 来源 Origin | 登入号 Accession No. |
|---|---|---|---|
| A-D | 砂糖橘 | 桂林（柑橘所） | MT386550 |
| GL-2 | 砂糖橘 | 桂林（灵山县） | MT386566 |
| MS-1 | 沃柑 | 南宁（马山县） | MT386551 |
| MS-4 | 沃柑 | 南宁（马山县） | MT386552 |
| SL-8 | 沃柑 | 南宁（上林县） | MT386553 |
| W-5 | 沃柑 | 南宁（武鸣区） | MT386554 |
| W-7 | 沃柑 | 南宁（武鸣区） | MT386555 |
| W-9 | 茂谷柑 | 南宁（武鸣区） | MT386556 |
| W-11 | 茂谷柑 | 南宁（武鸣区） | MT386557 |
| YBY-44 | 金秋蜜橘 | 南宁（邕宁区） | MT386558 |
| ZG-2 | 沃柑 | 南宁（邕宁区） | MT386559 |
| ZG-3 | 沃柑 | 南宁（邕宁区） | MT386560 |
| ZG-4 | 沃柑 | 南宁（邕宁区） | MT386561 |
| ZG-7 | 沃柑 | 南宁（邕宁区） | MT386562 |
| ZG-9 | 沃柑 | 南宁（邕宁区） | MT386563 |
| ZG-10 | 沃柑 | 南宁（邕宁区） | MT386564 |
| ZG-11 | 沃柑 | 南宁（邕宁区） | MT386565 |
| ZG-1 | 沃柑 | 南宁（邕宁区） | MT386546 |
| YBY-2 | 沃柑 | 南宁（邕宁区） | MT386545 |
| BB-6 | 青柚 | 玉林（博白县） | MT386541 |
| BB-8 | 青柚 | 玉林（博白县） | MT386542 |
| BB-10 | 青柚 | 玉林（博白县） | MT386543 |
| BB-14 | 青柚 | 玉林（博白县） | MT386544 |
| ZG-2 | 沃柑 | 南宁（邕宁区） | MT386547 |
| ZG-7 | 沃柑 | 南宁（邕宁区） | MT386548 |
| ZG-10 | 沃柑 | 南宁（邕宁区） | MT386549 |
2 结果与分析
2.1 广西柑橘碎叶病和柑橘叶斑病的调查
2018年12月至2019年11月,在广西南宁、崇左、柳州、桂林、玉林、河池、贺州、及防城港等8个主要柑橘种植区调查柑橘病毒病的发生情况,共采集了165个样品,其中沃柑82个、青柚23个、砂糖橘30个、甜橙7个、早熟温州柑7个、贡柑7个、茂谷柑5个、蜜柚4个。调查结果显示,在玉林市的调查点只发现柑橘叶斑病,发病率为0%~7.7%;在桂林市的调查点发现柑橘叶斑病和柑橘碎叶病,发病率为3.8%;南宁市调查点也发现柑橘叶斑病和柑橘碎叶病,且发病率最高,为4.2%~11.7%;其中发病最严重的区域是南宁市邕宁区百济镇坛里祝柑果园,发病率高达73%;在柳州、贺州、河池、崇左和防城港的调查点未发现柑橘病毒病。本研究检测到感染CTLV的柑橘叶片表现为黄脉、叶片黄化、叶片不规则等症状。检测到感染ASGV、CTLV、CLBV的植株均有嫁接口不亲和、肿大的共同特征（图1A1）。检测到感染ASGV的植株叶片表现为褪绿、叶小等症状;检测到感染CLBV的柑橘叶片表现为叶片边缘不规则;检测到ASGV和CLBV复合侵染的植株表现为叶片皱缩、畸形、叶脉变黄、植株矮化等症状;检测到CLBV和CTLV复合侵染的植株表现为叶片皱缩、畸形、叶面有斑点等症状（图1A2）。
图1 柑橘碎叶病和柑橘叶斑病田间症状A1：树干症状;A2：树叶症状;CK：对照;ZG-2：ASGV和CLBV复合侵染;ZG-7：CTLV和CLBV复合侵染;ZG-9：CTLV;ZG-11：ASGV。 Fig. 1 Symptoms of CTLV and CLBV disease in field A1: Symptoms of the trunk; A2: Symptoms of leaves; CK: Control; ZG-2: ASGV and CLBV complex infection; ZG-7: CTLV and CLBV complex infection; ZG-9: CTLV; ZG-11: ASGV. |
2.2 RT-PCR检测CLBV和ASGV
用引物ASGV-U/ASGV-2和CLBV-1F/CLBV- 5R对采集的疑似样品进行RT-PCR检测。大部分样品中都扩增出499 bp（ASGV-U/ASGV-2）和425 bp（CLBV-1F/ CLBV-5R）左右的特异目的条带,而健康叶片和阴性对照无目标条带（图2）。PCR产物测序结果在GenBank数据库中进行比对,结果显示利用引物ASGV-U/ASGV-2扩增获得的序列与GenBank上的ASGV和CTLV序列具有高度相似性,在93.07%~99.31%之间;而引物CLBV-1F/CLBV-5R扩增获得的序列与GenBank上的CLBV序列相似性高达98.06%~99.86%。
图2 CLBV和ASGV的检测结果M：Mark;—：阴性对照;1：ZG-1;2：ZG-2;3：ZG-3;4：ZG-4;5：ZG-5;6：ZG-6;7：ZG-7;8：ZG-8;9：ZG-9;10：ZG-10;11：ZG-11。 Fig. 2 CLBV and ASGV detection results M: Mark; —: Negative control; 1: ZG-1; 2: ZG-2; 3: ZG-3; 4: ZG-4; 5: ZG-5; 6: ZG-6; 7: ZG-7; 8: ZG-8; 9: ZG-9; 10: ZG-10; 11: ZG-11. |
2.3 广西柑橘碎叶病和柑橘叶斑病的病原病毒种类及分布
田间病害调查时共采集165份叶片样品,包括有症状和无症状的植株样品,其中检测出26个样品含有CTLV、ASGV和CLBV（表3）。在南宁市（邕宁区、马山县、园博园、武鸣区）和桂林市采集的12个样品上检测到CTLV病毒,检出率为7.3%;在南宁市（邕宁区和上林县）和桂林市采集的5个样品上检测到ASGV病毒,检出率为3.0%;在南宁市（邕宁区）和玉林市采集的9个样品上检测到CLBV,检出率为5.5%;此外,发现一些样品存在2种病毒复合侵染现象,CTLV和ASGV复合侵染的样品有3份,占1.8%;CTLV和CLBV复合感染的样品2份,占1.2%;ASGV和CLBV复合侵染的样品1份,占0.6%。广西各地的柑橘病毒检出种类不同,检出率差异较大。南宁和桂林是广西的柑橘主要产区,病毒病发病率较高。南宁地区的病毒病发生情况也比较复杂,3种病毒均检出,其中ASGV 4份,占4.2%,CTLV 11份,占11.7%,CLBV 5份,占5.3%。桂林的26份样品检测出CTLV和ASGV各1份。玉林的柑橘叶斑病检出率较高,14份样品中有4份检测为阳性,占28.6%（表3）。这3种病毒病目前在南宁、桂林和玉林的柑橘种植区均有发现,其他地区的样品未检出,但仍需引起重视。
表3 广西柑橘碎叶病和柑橘叶斑病病原鉴定结果Tab. 3 Identification results of pathogenic virus in CTLV and CLBV in Guangxi |
| 地点 Region | 样品数 Number of samples | ASGV | CTLV | CLBV | 合计 Total/% | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 感染样品数 Number of infected samples | 占比 Percentage/% | 感染样品数 Number of infected samples | 占比 Percentage/% | 感染样品数 Number of infected samples | 占比 Percentage/% | |||
| 南宁 | 94 | 4 | 4.2 | 11 | 11.7 | 5 | 5.3 | 21.2 |
| 玉林 | 14 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4 | 28.6 | 28.6 |
| 柳州 | 21 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 桂林 | 26 | 1 | 3.8 | 1 | 3.8 | 0 | 0 | 7.6 |
| 河池 | 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 贺州 | 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 崇左 | 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 防城港 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 合计 | 165 | 5 | 3.0 | 12 | 7.3 | 9 | 5.5 | 15.8 |
2.4 CTLV和ASGV分离株的系统发育分析
图3 CTLV和ASGV分离物的系统进化及地理位置关系(A)：中国;(B)：韩国;(C)：日本;(D)：印度。●为本研究获得的分离物。 Fig. 3 Phylogeny and geographic location of CTLV and ASGV isolates (A): China; (B): South Korea; (C): Japan; (D): India. ● the isolates obtained in this study. |
2.4.1 地理位置分析 从地理位置进行分析发现,来源于中国的ASGV和CTLV主要以柑橘、苹果、梨、猕猴桃4种寄主为主（图3A）,并按寄主类型聚类共聚为8组,分别命名为A、B、C、D、E、F、G、H组。聚类分支为A组的分离物全部来源于柑橘,包括来自湖南、重庆、广东、广西、台湾等省（区）和本研究获得的1个来源于广西的分离物（MS-1）;聚类分支为B组的分离物均来源于武汉的梨;C组分为2个副组,部分来源于重庆、四川、湖北的柑橘聚为C1副组,部分来源于武汉猕猴桃的病毒为C2副组;D组和E组的分离物均来自湖北的梨;F组来源于湖南和台湾的柑橘分离物;G组来源于吉林苹果的分离物;H组大部分是本研究来自广西柑橘上的分离物,只有1个是来源于辽宁苹果上的分离物（A1）。因此,在中国的ASGV和CTLV 2种病毒与地域分布显著相关。ASGV在韩国主要寄生在梨和苹果植株上,没有检索到与CTLV相关的序列,也没有明显的寄主聚类支（图3B）,但分别聚为5组,分别命名为A、B、C、D、E组。分支为A组的ASGV分离物均来自苹果;B组的分离物有苹果和梨;ASGV-SGS是来源于梨的分离物,单独聚为C组;本研究分离物MS-1与韩国苹果的分离物A211和梨的分离物KP2聚为D组;本研究所获得的其他3个CTLV分离物和1个ASGV分离物全部聚在E组。在日本,ASGV和CTLV主要寄生在柑橘上,按地理位置聚为2组（图3C）,分别命名为A、B组。系统发育树分析结果显示,来源于日本柑橘上的ASGV和CTLV分离物聚为A组,本研究的ASGV和CTLV分离物聚为B组。值得一提的是,本研究的分离物MS-1与日本柑橘分离物聚为一组,其余7个分离物聚为另一组。从印度的系统发育分析来看,印度未检索到CTLV相关分离物,检测到的病毒以ASGV为主。ASGV的寄主有苹果、猕猴桃、梨、柑橘等,但没有寄主相关性,主要聚类为2个组（图3D）,分别命名为A、B组。其中A组又聚为A1、A2、A3三个副组,A1、A3均为印度分离物,而A2为本研究的中国广西分离物。本研究的5个分离物分为2组,分离物MS-1既不与广西分离物聚类,也不与印度分离物聚类,本地所有分离物与印度分离物不相关,包括较特异的MS-1。
2.4.2 寄主相关性分析 从寄主相关性角度进行分析,发现以柑橘为寄主的大多为CTLV,而ASGV较少,以印度分离物为主,中国和日本分离物只有少数,经NCBI检索同样可以证明这一点。根据系统发育树,将基因型分为4个聚类（图4A）,Ⅰ组由14个成员组成,其中大部分来自中国台湾和重庆的分离物,但本研究的MS-1与它们聚类在一组。由于在本研究中所评估的基因序列在聚类中表现出较大差异,因此它们的类群划分并无明确界限。有8个分离物聚为Ⅱ组,Ⅱ组又细分为3个亚组。Ⅱ组最明显的亚群为Ⅱ1,是来自中国的分离物（BJNM、YHC-1、SXH-1）,Ⅱ2的2个CTLV分离物（Meyer lemon、TL110）来自美国,3个来自印度的ASGV分离物聚类在Ⅱ3,在Ⅱ组中明显按地理位置聚类。因此,柑橘寄主上的CTLV和ASGV与地理位置具有一定相关性。来自中国重庆的2个分离物和来自中国广西的2个分离物聚类在Ⅲ组,由于它们的遗传距离较为相似,广西的2个病毒分离物有可能是在重庆引种时随着接穗带到广西。剩下的6个本地分离物（MS-4、XD-D、WM-7、SL-8、ZG-4、ZG-11）聚类在Ⅳ组。这6个样品来自广西5个不同的地点,CTLV分离物MS-4是马山县果园采集的样品,CXD-D是来自桂林的树苗移栽至广西大学的样品,WM-7样品采自武鸣区;ASGV分离物SL-8来自上林县,ZG-4和ZG-11样品采自邕宁区祝柑果园,南宁市区内的3个分离物聚为1个分支,上林和桂林的分离物聚为另一个分支,在广西同样具有一定地理位置关系。以上6个分离物均采自沃柑,而沃柑是广西的主要柑橘品种,ASGV和CTLV 2种病毒已经开始危害广西的柑橘产业,因此,应该重视这2种病害,加强检疫,减少该病毒对柑橘的危害。利用本研究的11个分离物序列分别对来自中国、韩国和印度等国家的24个梨分离物和28个苹果分离物进行基因系统树分析（图4B,图4C）。这些基因聚类为几个主要组别,而且本研究基因序列与NCBI检索的基因明显分开,以苹果为寄主的主要聚类为4个组群（图4B）,Ⅰ组主要是6个中国分离物和4个印度分离物,以及1个韩国分离物,还包括1个本地的柑橘分离物MS-1。MS-1与韩国苹果分离物K211聚为1个分支,本地CTLV柑橘分离物MS-1很有可能来源于韩国。9个韩国分离物和1个巴西分离物以及2个印度分离物聚类为Ⅱ组,巴西的分离物为一个分支,印度分离物单独一个分支,来自同一地理位置的分离物聚为一个分支,呈现出地理位置相关性。Ⅲ组由印度分离物和巴西分离物组成,各自又单独为一个分支,具有地理位置相关性。由本地柑橘的8个分离物与1个辽宁分离物（A1）聚类为Ⅳ组。以梨为寄主的呈现2个分歧很大的分支（图4C）,所有分离物聚为2个组,其中本研究的10个分离物聚为Ⅱ组,本研究的其余1个分离物MS-1与NCBI数据库检索的24个分离物聚为Ⅰ组,并且MS-1与韩国梨分离物KP2聚在一个分支。总的来说,不管是苹果还是梨,所有的组群都是由不同地区的ASGV组成,值得注意的是,本研究的分离物MS-1既与来自韩国苹果分离物K211聚类,又与韩国梨分离物KP2聚类。再次表明本地CTLV柑橘分离物MS-1可能来源于韩国,并且与寄主种类无相关性。
2.5 CLBV分离株的系统发育分析
3 讨论
柑橘碎叶病是普遍发生的一种柑橘病毒病,在全球主要柑橘种植区均有报道,其中在中国CTLV为害较严重。据报道,ASGV和CTLV都可通过嫁接传播[32,33]。用于嫁接的枝条或砧木带毒,以及嫁接工具未消毒是导致ASGV和CTLV传播的重要因素[34,35][5-7]。本研究对采自广西8个柑橘主要种植区的165份叶片样品进行RT-PCR检测,结果发现有3.0%的样品检出ASGV,7.3%的样品检出CTLV,5.5%的样品检出CLBV（表3）。与项周等[29]调查中国7个省的CLBV和CTLV检出率（9.6%、11.0%）相比,广西柑橘碎叶病和叶斑病的检出率略低。症状相同的植株携带的病毒种类可能不同,如南宁的ZG-2、ZG-7样品植株表观症状同为嫁接口肿大、叶片黄化偏小且边缘不规则,ZG-2检测到ASGV和CLBV,而ZG-7检测到CTLV和CLBV。广西柑橘病毒病复合侵染现象普遍存在,同时检测到ASGV和CLBV的植株表现为叶片皱缩、畸形、叶脉变黄、植株矮化等症状;同时检测到CLBV和CTLV的植株表现为叶片皱缩、畸形、叶面有斑点等症状;且未表现症状的植株样品也可能检测到病毒的存在。因此,在柑橘种苗繁殖过程中,开展病毒早期诊断极为重要,应在柑橘健康种苗的培育和生产中加强病毒检测,加强专业技术指导,规范嫁接过程,减少病毒感染和传播的机会。本研究首次在广西南宁、玉林的柑橘样品中检测到CLBV,是近年来国内新报道的一种柑橘病毒[19]。2017年项周等[29]首次报道该病毒在湖北、江西、四川和云南等省份的柑橘上发生。CTLV与CLBV属于不同病毒科,它们在受到复合侵染的柑橘植株中的关系如何,其共同侵染是否会在致病过程中产生协同作用,均值得进一步研究。
为了比较来自世界各地的基因组序列与中国广西分离株的遗传进化关系,按不同寄主和不同地理来源分别构建系统发育树（图3,图4）。结果表明,ASGV和CTLV与宿主或地理起源均呈一定相关性。经Blast结果证实,发状病毒属（Capillovirus）的CTLV与ASGV 2个分离株密切相关。姬盼等[36]在云南苹果上ASGV的研究表明,分子变异与寄主或地域来源存在一定的相关性。本研究从地理位置进行分析发现（图3A~图3D）,ASGV和CTLV在中国与寄主呈遗传相关性,这与Liebenberg等[37]研究发现ASGV的多样性与寄主存在一定相关性的结论一致。据报道,ASGV在西洋梨上的遗传进化也揭示了与寄主具有相关性[38]。在日本分离物的进化树中2种病毒的遗传关系呈现出与地理区域有关,这一结论在本领域研究甚少。在韩国和印度都未检索到CTLV,ASGV的遗传关系也与寄主无关。从寄主上进行分析,根据所构建系统发育树发现（图4a~图4c）,以柑橘为寄主的CTLV和ASGV没有明显分组,但亚组中明显按地理位置聚类;在苹果寄主上的Ⅱ组和Ⅲ组有一定的地理位置相关性,但不显著;这一结论与李正男等[17]在沙果上ASGV全基因组的分析一致。在寄主梨上既无地理位置相关性也无寄主相关性,郑银英等[18]通过分析ASGV的CP基因序列也表明其遗传关系与寄主及地理来源无明显相关性。综上分析,与来自不同寄主和不同国家无关的系统发育簇可能是无性繁殖、国家间种质交换以及繁殖材料长距离运输或是一棵树上多次嫁接所导致的。本研究的分离物MS-1不与其他本地分离物聚类而与韩国、日本分离物聚类,可能是在进行种质交换时,病毒通过引进种苗传播到广西。而其他本地分离物始终聚在一起,与不同寄主、不同来源的分离物都具有较远的遗传距离,说明本地砧木可能存在感染病毒的风险。因此,在引进柑橘品种过程中,不仅只检疫柑橘苗木,而且要对砧木进行检疫。
本研究对广西不同地理来源的柑橘植株上的CLBV分离物进行比对发现,该病毒遗传变异很小,这与Vives等[39]报道的结论一致,这表明该组群在某种程度上与CLBV的寄主呈一定相关性。本研究的CLBV系统发育分析结果显示,广西柑橘上CLBV的CP基因核苷酸序列与来源不同寄主的基因序列具有明显的寄主相关性。Chavan等[31]在猕猴桃基因组分析得出CLBV与其寄主来源有关。有研究表明,CLBV主要的传播途径包括无性繁殖材料和种苗运输过程[40],还可通过种子侵染柑橘[41]。因此,为了防止该病毒扩散,应加强对种苗及繁殖材料的检疫。目前有关这3种病毒的遗传多样性及其在中国柑橘上的危害特性研究相对缺乏,本研究分离了17个柑橘病毒基因序列,可为柑橘病毒遗传多样性研究提供更加丰富的病毒基因信息,同时,为后续病毒重组事件分析提供基因数据基础,以此获得更全面的病毒基因遗传情况,解析病毒的遗传变异。