近年来,随着设施栽培产业的快速发展,设施内CO2施肥作为一项作物高产优质、抗病的技术手段越来越受到人们的关注。霍山石斛（Dendrobium huoshanense）为我国珍贵的石斛中药材,主要分布于安徽霍山县大别山、金寨、岳西以及河南[1],具有抗肿瘤、调节免疫力、抗氧化、治疗白内障、降血糖等作用[2,3,4]。霍山石斛属于阴生或半阴生植物,人工栽培的植株光饱和点和光补偿点较低[5],适合林下和设施栽培。目前,大量研究表明,提高CO2浓度能显著提升葡萄、大豆、水稻、小麦等经济作物的生物量和产量[6,7,8],促进番茄、黄瓜和欧芹等蔬菜营养物质的积累[9,10,11]。也有研究发现,提高CO2浓度还能显著提升朱顶红、非洲菊、蝴蝶兰等花卉的开花质量[12,13,14]。然而,有关CO2处理对霍山石斛的影响还未见报道。由于该石斛地域适应性较强,抗热性较差,在广东地区种植较为困难。为了进一步提高霍山石斛在广东设施种植的存活率和品质,本研究参考前人在鼓槌石斛[15]、蝴蝶兰[14]和非洲菊[13]等植物上报道的CO2浓度（800 μmol/mol）,通过CO2倍增处理霍山石斛幼苗,观察其生长、萌芽、存活的情况,以及其光合特性与有效成分的变化,为霍山石斛设施栽培下CO2施肥技术的应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
以霍山石斛种子为外植体,通过组织培养至株高为2~3 cm,单株叶片数为4~5片,长势良好的幼苗,大棚环境驯化2~3周后出瓶,栽培于木头上,玻璃温室环境中培养1个月。
1.2 方法
1.2.1 CO2倍增处理 试验在广州华南师范大学兰花研究中心进行,玻璃温室顶端覆盖遮阳网（遮阳率为75%）,环境温度为(24±1)℃,相对湿度为80%左右,环境因子由浙江求是公司记录仪实时监控并记录（每0.5 h记录1次）。温室内CO2由钢瓶供给（纯度95%,广州气体厂提供）。参考前人报道的CO2处理浓度[13,14,15],CO2处理组为大气倍增的CO2浓度,即(800 ± 50)μmol/mol,处理时间为2016年5月1日至10月25日的7：00— 17：00;对照组的CO2浓度为大气浓度,即(400 ± 50)μmol/mol。整个试验共处理180 d,分别于0、10、20、30、60、90、120、150、180 d随机取长势健康的第4片（从植株顶端往下数）完全展开的功能叶进行光合、形态及各项生理生长指标的测定。每个处理50丛,每丛10株,3次重复。正常肥水管理,每周施肥1次（质量浓度为0.5 g/L的德国进口COMPO肥,N∶P2O5∶K2O = 30∶10∶10）,每2 d浇1次水。
1.2.2 叶片光合指标测定 在上午9：30—11：00使用LI-6400便携式光合测定仪测定处理0、10、20、30、60、90、120、150、180 d的霍山石斛功能叶的净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、蒸腾速率（Tr）和水分利用效率（WUE）。
1.2.3 生长相关参数测定 从处理的30 d起,每隔30 d测定50丛（每10株为1丛,每10丛为1组,5次重复）霍山石斛对照组和处理组的存活率、着根率和新芽的生长情况。处理180 d后随机选取对照组和处理组植株各50株（每10株为一组,共5组）,分别测定单株苗的茎鲜重、茎干重、茎长、茎粗、单株叶片数、单叶面积、比叶面积和叶片厚度（石蜡切片观测,金华科迪KD-2260石蜡切片机）
1.2.4 叶片可溶性蛋白含量测定 参考Bradford的方法略加改进[16]。称取0.1 g新鲜叶片剪碎于冷冻过的研钵中,加1 mL磷酸缓冲液（pH 7.8）和少量石英砂,在冰浴中快速研磨成匀浆,匀浆倒入离心管中;再用4 mL的磷酸缓冲液将研钵中的匀浆洗入离心管中。在4 ℃条件下,5000 r/min离心10 min,取上清液倒入10 mL的容量瓶中,残渣加入5 mL磷酸缓冲液悬浮再离心,将上清液倒入上述容量瓶中,定容至10 mL待测。取0.3 mL样品提取液,加入0.7 mL磷酸缓冲液（pH 7.8）,再加5 mL考马斯亮蓝G-250试剂显色,摇匀,放置2 min,利用UV-2550分光光度计测定595 nm吸光值。以牛血清蛋白为标准品绘制标准曲线。
总氨基酸含量测定参考鲁芹飞[20]的方法稍作改进。取0.3 g干燥的铁皮石斛茎段粉末,置于具塞试管中,加入6 mol/L盐酸10 mL,110 ℃烘箱中水解24 h,冷却过滤,滤液至25 mL容量瓶,加水定容,量取10 mL,用30% NaOH调至中性,溶液至25 mL容量瓶中,加水定容至刻度。取样液2.0 mL置于25 mL试管中,加入1.0 mL磷酸盐缓冲液,1.0 mL 2%茚三酮,摇匀,沸水浴30 min,冷却加水定容至25 mL,利用UV-2550分光光度计测定570 nm吸光值。以天冬氨酸为标准品绘制标准曲线。
1.3 数据处理
所有数据由平均值±标准差表示,使用Excel 2010进行作图,并利用SPSS软件进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 CO2倍增对霍山石斛光合特性的影响
由图1A可以看出,CO2倍增处理组的Pn在各观测的时间段均显著高于对照组。在处理20 d后,对照组的Pn趋向相对稳定的水平,而处理组在前90 d呈现一个快速增加的趋势,并在第90 d出现了最大值,比同期对照组显著增加了51%。90 d之后,处理组的Pn也趋向于相对稳定的水平,由此可知,霍山石斛在CO2倍增条件下处理180 d没有出现“光合适应”现象。
2.2 CO2倍增对叶片可溶性蛋白的影响
由图2可知,处理30 d时,处理组和对照组的单位叶片可溶性蛋白含量均随霍山石斛的生长而增加,但两组之间无显著差异。在试验的60~ 180 d,对照组的单位叶片可溶性蛋白含量基本维持相对稳定的水平,而处理组则呈下降趋势,其显著低于同期的对照组,且在120 d时,出现了两组之间的最大差异值,也是处理组的最小值,比同期对照组下降了29%。
2.3 CO2倍增对霍山石斛生长的影响
表1 CO2倍增处理对霍山石斛存活率、着根率和新芽数的影响Tab. 1 Effects of doubled atmospheric CO2 concentration on survival rate, rooting rate and number of new buds |
| 时间 Time/d | 存活率Survival rate/% | 着根率Rooting rate/% | 新芽数Number of new buds | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 对照组Control | 处理组Treatment | 对照组Control | 处理组Treatment | 对照组Control | 处理组Treatment | |
| 30 | 66.2±4.6b | 91.4±1.8a | 4.3±1.0b | 22.2±0.9a | 1.2±0.1b | 4.2±0.1a |
| 60 | 62.0±3.9b | 89.6±1.9a | 10.6±0.7b | 67.2±1.2a | 2.3±0.1b | 5.4±0.1a |
| 90 | 59.8±2.5b | 87.6±1.7a | 25.6±1.5b | 83.4±1.4a | 2.7±0.5b | 6.1±0.1a |
| 120 | 59.0±2.5b | 87.2±1.3a | 32.0±1.7b | 92.5±1.9a | 3.0±0.1b | 7.0±0.1a |
| 150 | 56.8±3.3b | 86.0±1.2a | 35.0±2.8b | 94.9±0.9a | 3.6±0.2b | 7.7±0.3a |
| 180 | 56.2±3.3b | 85.6±1.5a | 38.3±1.9b | 97.0±0.9a | 3.8±0.2b | 8.0±0.3a |
注：不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Different lowercase letters indicate significant difference between two groups. |
随着栽培时间的推移,霍山石斛分蘖产生的新芽数逐渐增加,从30 d开始,CO2倍增处理组的霍山石斛幼苗分蘖产生的新芽数一直显著高于对照组,直至处理180 d后,处理组的新芽数为8.0株/丛,而对照组的新芽数仅为3.8株/丛,并且处理组的新芽不仅数量上明显高于对照组,而且在长势上也优于对照组（图3）。
表2 CO2倍增处理对霍山石斛生长的影响Tab. 2 Effects of doubled atmospheric CO2 concentration on growth of D. huoshanense |
| 测定项目Tested items | 对照组Control | 处理组Treatment |
|---|---|---|
| 茎鲜重/g | 0.175±0.010b | 0.207±0.010a |
| 茎干重/g | 0.017±0.010b | 0.021±0.010a |
| 茎长/cm | 3.022±1.280b | 3.654±4.390a |
| 茎粗/mm | 2.360±0.230a | 2.546±0.100a |
| 单株叶片数 | 1.980±0.190b | 2.700±0.590a |
| 叶面积/cm2 | 0.513±0.010a | 0.518±0.010a |
| 比叶面积/(cm2·g-1) | 325.200±17.700a | 284.700±7.810b |
| 叶片厚度/µm | 304.400±3.420b | 400.900±29.100a |
注：不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Different lowercase letters indicate significant difference between two groups. |
2.4 CO2倍增对霍山石斛有效成分的影响
由表3可知,CO2倍增处理能够影响霍山石斛有效成分。CO2倍增处理显著提高了霍山石斛茎的多糖含量,相比对照组提高了94%,而处理组生物碱含量则显著下降。同时,茎的总氨基酸含量、总黄酮含量在两组之间无显著差异。
表3 CO2倍增处理对霍山石斛茎有效成分的影响Tab. 3 Effects of doubled atmospheric CO2 concentration on effective components of stems |
| 测定项目 Tested items | 含量Content | |
|---|---|---|
| 对照组Control | 处理组Treatment | |
| 多糖/% | 5.500±0.37b | 10.680±0.45a |
| 生物碱/% | 0.045±0.01a | 0.036±0.01b |
| 总氨基酸/% | 1.279±0.11a | 1.164±0.03a |
| 总黄酮/(mg·g-1) | 0.815±0.04a | 0.906±0.13a |
注：不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Different lowercase letters indicate significant difference between two groups. |
3 讨论
大气CO2浓度的提高直接影响植物多种生理代谢,包括提高净光合速率、降低气孔导度、进而提高水分利用率、生长速率和产量等[21]。前人对红掌[22]、金钗石斛[23]、非洲菊[13]等植物的研究发现,CO2倍增显著提高了植物的净光合速率。本研究中CO2倍增同样显著提高了霍山石斛的净光合速率,在90 d达到最大值,比同期的对照组增加了51%,整个180 d试验期间平均增幅达27%。不少研究者还发现,长期提高栽培环境中的CO2浓度会导致植物的光合能力降低,即“光合适应”或“光合下调”,可能的原因是长期的高CO2浓度降低Rubisco的含量和色素对光的捕捉能力,进而减弱植物的光合能力[24]。在本研究中,霍山石斛在CO2倍增处理180 d后并没有出现光合适应现象,这与在铁皮石斛上的结果一致[25],但霍山石斛增加处理天数后的变化则需要进一步研究。
气孔的关闭受到多种因素的影响,如水分、光照、温度、CO2浓度等。为了更有效地利用CO2,植物减少了Gs,减少了水分蒸发。Gs对大气CO2浓度增加的响应本质上是植物对水资源利用的调节,也是植物水分生理的调节过程[13]。Ruhil等[26]发现高CO2浓度下芥菜的净光合速率平均提高了48%;气孔导度平均下降了23%,蒸腾速率下降了39.3%,在非洲菊[13]、大麦[27]上也得到相似的结果。但在本研究中,CO2倍增提高了霍山石斛气孔导度和蒸腾速率,铁皮石斛上也观察到了类似的情况[25],这可能的原因是环境相对湿度较高,霍山石斛通过增强气孔导度以获取更多的CO2来进行光合作用。虽然处理组的蒸腾速率显著提高,但随着处理时间延长,还是有效地提高了霍山石斛的水分利用率。
增加CO2浓度能够提高植物的光合能力,促进植物生长,进而增加植物的生物量、产量和干物质的积累,但这种作用会随着物种、生长季节的不同而有所不同[28]。CO2处理能使C3作物增产10%~20%,C4作物增产0%~10%[29,30]。笔者前期发现CO2倍增能显著提高铁皮石斛的鲜重、干重和茎长,但对茎粗无显著影响[25]。本研究结果与铁皮石斛类似,霍山石斛茎的干重和鲜重分别提高了24%和18%,茎长也显著提高了21%。同时,前人发现高浓度CO2都能促进拟南芥根的生长[31],而根系的发达有利于植物在高浓度CO2下对水分和氮的获取和利用[32]。本研究中CO2倍增处理则显著提高了霍山石斛幼苗的着根率和存活率,并使其根系生长旺盛,从而有利于植物更好地吸收水分和无机盐,促进了新芽的分蘖和生长,新芽的快速生长又可以提高霍山石斛的光合能力,增加霍山石斛的物质积累,反过来促进根系的生长。此外,大部分植物在长期高CO2浓度条件下都会出现叶片可溶性蛋白质含量下降的现象。对蝴蝶兰[33]、芥菜[26]研究发现,CO2加富均降低了植物叶片的可溶性蛋白质含量,而铁皮石斛在CO2倍增处理120 d时才出现显著下降的情况[25]。本研究中霍山石斛在CO2倍增处理60 d时,单位叶片中可溶性蛋白质含量就出现显著下降的情况,且在120 d时处理组和对照组的差异达到最大值。这可能与CO2浓度升高使Rubisco含量的下降有关[34],而Moore等[24]也发现长期CO2加富会导致Rubisco蛋白基因表达下调,编码Rubisco蛋白的小亚基转录水平也出现下调。
增加CO2浓度还会诱导植物的营养组分发生变化,进而改变作物的营养价值。Mamatha等[10]发现CO2施肥能显著增加了番茄的氨基酸含量,约为16.13%,但处理组的总酚、总黄酮、抗氧化物质、类胡萝卜素和番茄红素含量均出现了下降。笔者前期发现CO2倍增处理铁皮石斛180 d后,其茎中的多糖、生物碱、总氨基酸和总黄酮含量均与对照无显著差异[25]。本研究中,CO2倍增对霍山石斛茎的有效成分的影响是不同的,其中多糖含量显著增加了94%,而生物碱含量显著降低了20%,总黄酮和总氨基酸含量则变化不显著。《中华人民共和国药典》2020版规定霍山石斛的多糖含量不得少于17%（以干燥品计）[17],而随着栽培时间的延长,霍山石斛多糖含量也会不断积累,其中以两年生霍山石斛茎中多糖积累量最高[35]。笔者对霍山石斛仅栽培了180 d,尚未完全成熟,但两组之间的显著差异说明CO2倍增有利于霍山石斛茎中多糖的积累。