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2021 , Vol. 42 >Issue 5: 1310 - 1317

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.016

Germplasm Resources, Genetics & Breeding

Genetic Diversity Analysis and SSR Fingerprint Construction of Pitaya Cultivars

  • HU Wenbin ,
  • HONG Qingmei ,
  • LI Jing ,
  • PU Wenhui ,
  • HE Yun ,
  • LI Hongli , * ,
  • LI Qiong , *
Expand
  • Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China
* LI Hongli,E-mail: ;
LI Qiong,E-mail: 。

Received date: 2020-07-03

  Request revised date: 2020-08-08

  Online published: 2021-05-25

Copyright

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Fold

Abstract

In order to accurately identify pitaya cultivars and evaluate their genetic diversity, 20 pairs of SSR core primers were used to analyze the genetic diversity of 58 pitaya varieties, and polymorphic alleles were detected by capillary electrophoresis. Totally, 116 polymorphic alleles were revealed, with an average of 5.8 for each primer pairs. The average number of alleles (Na), number of effective alleles (Ne), observed heterozygosity (Ho), expected heterozygosity (He), and polymorphism information content (PIC) was 5.8, 2.0519, 0.3318, 0.4603 and 0.417, respectively. Based on the clustering results of genetic similarity coefficient, the main commercial cultivars of pitaya were divided into three groups. Based on 20 pairs of SSR primers amplified from 58 cultivars, the fingerprints of 58 cultivars of pitaya were constructed using 9 pairs of primers. A strategy of combining primer pair with distinct alleles for fingerprint construction was developed and applied to the 58 cultivars. The confidence probability of variety identification was almost 100%. The research results would provide important theoretical basis and technical support for the germplasm classification, cultivar identification and varieties property protection of pitaya.

Key words： pitaya; SSR; fingerprint; variety identification; genetic diversity

Cite this article

HU Wenbin , HONG Qingmei , LI Jing , PU Wenhui , HE Yun , LI Hongli , LI Qiong . Genetic Diversity Analysis and SSR Fingerprint Construction of Pitaya Cultivars[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2021 , 42(5) : 1310 -1317 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.05.016

火龙果（Hylocereusundatus Britt. & Rose）又名红龙果,属仙人掌科（Cactaceae）多年生攀缘植物,原产于墨西哥南部及中美洲诸国的太平洋沿岸地区。火龙果是近年发展起来的具有较高的营养价值[1]、药用价值[2,3,4],以及观赏价值[5]的新兴热带亚热带果树。在中国、越南、美国、泰国、以色列、哥伦比亚、厄瓜多尔、巴西、澳大利亚等国家有大规模种植,目前中国的种植面积大约有80 000 hm2,主要分布在广东、广西、海南、贵州、云南、福建等省（区）,但是火龙果现有品种存在严重的同物异名、同名异物以及品种混淆等问题,由于主要商业品种外形特征极为相似,传统形态学分类手段难以有效鉴定。为了实现现有资源特别是商业品种的准确鉴定,亟需开展DNA分子身份证构建相关研究。
2005年国际植物新品种权保护组织（UPOV）,将构建DNA指纹数据库的标记方法确定为SSR和SNP,目前国家认定的植物品种鉴定DNA分子标记法的行业标准,以SSR、SNP、IDP标记为首选标记[6],主要是采用SSR。微卫星DNA标记（simple sequence repeat, SSR）具有按照孟德尔遗传方式分离、共显性遗传、位点数量多、多态性高、实验程序简单等优点,在农作物品种鉴定的研究上得到了广泛应用。SSR在水稻[7]、玉米[8]、小麦[9]等农作物品种鉴定上的研究,不仅形成了有效的鉴定技术体系,构建了对应的DNA指纹数据库,还将其应用于实践中。目前水稻[10]、玉米[11]、大豆[12]、小麦[13]等都建立了基于SSR标记的品种鉴定技术规程,发布相关的行业标准,已经分别在中国水稻、玉米、大豆和小麦等品种鉴定中得到了实施和应用。SSR标记在火龙果种质资源遗传多样性分析中已得到应用[14,15],但尚未有主要商业品种分子身份证构建相关报道。为了构建适合火龙果品种鉴定的分子身份证,本试验以58份火龙果主要商业品种为材料,从前期引物筛选所得火龙果SSR核心引物中选择20对引物开展遗传多样性分析和分子身份证构建研究,以期为火龙果种质分类、品种鉴定和品种权保护提供重要的理论依据与技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的58份火龙果品种资源（表1）主要来自火龙果主产区,包括国内的海南、云南、广西、广东、福建、贵州、台湾等省（区）的火龙果主产区,以及国外的美国、越南、以色列、厄瓜多尔、哥伦比亚、巴西、澳大利亚等国家的火龙果主产区。以上材料均保存于海南儋州中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所农业农村部火龙果种质资源保护海南创新基地。
表1 58份火龙果种质的名称和来源

Tab. 1 Names and origins of 58 pitaya germplasm resources

编号No. 名称Names 材料来源Origins 编号No. 名称Names 材料来源Origins 编号No. 名称Names 材料来源Origins
H001 大红 中国台湾 H021 H14 越南 H041 美龙1号 中国广西
H002 蜜红 中国台湾 H022 糖龙 美国 H042 美龙2号 中国广西
H003 软枝大红 中国台湾 H023 明珠 美国 H043 美龙3号 中国广西
H004 临家红韵 中国台湾 H024 澳洲红肉 澳大利亚 H044 紫红龙 中国贵州
H005 蜜宝2号 中国台湾 H025 澳洲紫肉 澳大利亚 H045 粉红龙 中国贵州
H006 富贵红 中国台湾 H026 青红 中国广西 H046 晶红龙 中国贵州
H007 金都一号 中国台湾 H027 青白 中国广西 H047 紫龙 中国海南
H008 红宝龙 中国台湾 H028 红花青龙 中国广西 H048 大龙 中国海南
H009 石火泉 中国台湾 H029 巴西白肉-1 巴西 H049 长龙 中国海南
H010 莲花 中国台湾 H030 巴西白肉-2 巴西 H050 燕窝果2 哥伦比亚
H011 福龙 中国台湾 H031 蜜味水晶白 中国海南 H051 黄锦 中国台湾
H012 甜龙 中国台湾 H032 红娘 中国海南 H052 白蜜龙 中国台湾
H013 帝龙 中国台湾 H033 双色 中国云南 H053 巴西粉肉 巴西
H014 南寮 中国台湾 H034 柠檬 中国云南 H054 秘鲁燕窝 秘鲁
H015 银龙 中国台湾 H035 白水晶 中国广东 H055 粉红佳人 中国台湾
H016 香蜜龙 中国台湾 H036 红水晶 中国广东 H056 红皮燕窝 中国台湾
H017 白玉龙 中国台湾 H037 粤红 中国广东 H057 翠西亚 美国
H018 燕窝果1 厄瓜多尔 H038 粤红3号 中国广东 H058 长龙果 中国广西
H019 无刺黄龙 以色列 H039 双色一号 中国广东
H020 越南白肉 越南 H040 桂红龙 中国广西

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 使用天根生化科技（北京）有限公司高效植物基因组DNA提取试剂盒（DP350）提取58份火龙果幼嫩茎样品的总DNA,操作参照产品说明书进行。样品统一稀释到20 ng/μL后,-20 ℃保存备用。
1.2.2 SSR程序及PCR产物检测 火龙果SSR引物由前期核心引物筛选试验所得（表2）,PCR产物检测使用毛细管电泳,普通引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行合成。毛细管电泳所需荧光引物由武汉诚至生物科技有限公司合成,分别在各引物对的F向引物的5°端加上FAM或HEX荧光修饰基团。
表2 SSR引物信息表

Tab. 2 Information of SSR primers used in this study

引物名称
Primer name		 正向引物（5′-3′）
Forward primer (5′-3′)		 反向引物（5′-3′）
Reverse primer (5′-3′)		 目标片段长度
Target fragment length/bp
HU-ssr3 GACGTGCAGTGACAGATTTACAG ATCTCCTTCCTCAGTCTAGGGC 154
HU-ssr10 CAACCTTTCTCCCTCTCTCTCAG ACTGTTCGGGTTCTGGGTTAG 146
HU-ssr15 AACAACAGTACCTTAGGGTCACATC AGTGTGTCCTCCCAAAGTAACAG 139
HU-ssr20 ACTACGAGGAGGAGAGTGACCC GAGAGAAGATGGGAATGGAAGTC 145
HU-ssr23 ATGAACCACCTACGGCAGAC CAAGCATTTCCGTCTCCATT 194
HU-ssr27 TCTCGGAGGCATCAAAGAGT TCCTCCATAAACCAAGGGTG 254
HU-ssr36 TGACCAGCTGCCCTTAGTTT CCCACCAAAATCACCATAGG 169
HU-ssr43 GGGCGATATCATCTTTCCTG GAGTCTGCTTCGGAGTCGTT 265
HU-ssr56 AAGCTATTCCTCGCGACTCA GGCTACCTTTCCGACTCACA 162
HU-ssr65 AATTTTGCCATCAGAGAGGC TGGAAGCATCCACATAAAACA 216
HU-ssr66 CTGTAACATCCCAGCCACCT GGGGCTGTATGCCTGTATGT 169
HU-ssr67 TACCATGTTTGGTTGCTTGC TGTGCGTAGAAAGCGAGAGA 238
HU-ssr74 GCAAAAGAAGATATAAACAGCAGAAA TGCAAGAAGGTTTGTAGGGG 135
HU-ssr77 CGATGTTCCATCTTCGCTTT GCCAATTCTGAGAGGCAGTC 243
HU-ssr80 AATGGCTCGGTAAAATCACG GTATTCCTGGGTGGTTGTGG 168
HU-ssr85 CCCATGCTAATTGCTTACCC GCAGTTGTGGATGCTTTTCA 268
HU-ssr86 AAATCACAAGGGCAATGAGG AAGAAGACCGAGGCACAAGA 170
HU-ssr91 ATGGAGTTGGGACTCTCGAA CACAGCAACCAGAACGAAGA 155
HU-ssr94 AGGAAACAAAGCCAAGCTCA CGATGTCCCCATTTGAGAAT 241
HU-ssr99 CTAGCGCGTGGATAGAAAGG GAACTTCATTGGGCGTAGGA 259
SSR荧光引物反应体系（共10 μL）：PCR反应体系总体积为10 μL,含2×Taq PCR Master Mix 5.0 μL,带荧光的F-primer（10 μmol/L）0.5 μL,R-primer（10 μmol/L）0.5 μL,模板DNA（20 ng/μL）2.0 μL,ddH2O 2.0 μL。
扩增程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,复性30 s（根据引物Tm值设计退火温度）,72 ℃延伸30 s,共35个循环;最终72 ℃延伸10 min。4 ℃保存。
将甲酰胺与分子量内标按100∶1的体积比混匀,再将PCR产物进行稀释10倍后,取1 μL PCR稀释产物+9 μL甲酰胺（含1%分子量内标）变性后上DNA分析仪ABI 3730xl（美国）进行毛细管荧光电泳检测。
1.2.3 数据处理与遗传多样性分析 将毛细管电泳检测结果导入到GeneMarker分析软件中,进行数据整理,每对引物导出PDF峰图文件。根据毛细管电泳结果,选择条带清晰、多态性高的进行统计,将同一位点的所有等位基因从小到大排列,有条带记为“1”,空白记为“0”,统计所得的数据利用Excel软件转换成NTSYS-2.10所需要的格式,利用软件NTSYSpc2.10计算遗传相似系数,采用非加权组平均法（UPGMA）,利用筛选出的SSR核心引物对58份火龙果种质资源进行聚类分析。用Cervus软件和Popgene软件进行遗传多样性分析,等位基因数（No. ofalleles,Na）、有效等位基因数（No. of effective alleles,Ne）、香农信息指数（Shannon’ sinformation index,I）、Nei氏期望杂合度（Nei’s expected heterozygosity,Nei’s）、观测杂合度（Observed heterozygosity,Ho）、期望杂合度（Expected heterozygosity,He）等参数使用Popgene软件计算,各个位点的多态性信息含量（Polymorphism information content,PIC值）由Cervus软件计算。
1.2.4 指纹图谱构建 从上述结果中选择适当鉴定力强的SSR引物构建主要商业品种的指纹图谱,以所分析的SSR引物名称为前缀,该标记在某样品上扩增带的分子量为后缀,得到每个品种在某个标记的带型编号,按照固定的引物排序综合不同引物分析结果,串联各带型编号,形成该品种的SSR指纹图谱。根据指纹图谱出现的概率公式P=1/2n（n为多态位点数,2n则为检测n个位点涉及的所有可能的试验材料个数）,统计图谱的置信概率。

2 结果与分析

2.1 主要商业品种的SSR标记多态性分析

从前期实验得到的火龙果SSR标记核心引物中筛选出20对引物,对58份样品进行遗传多样性分析（部分检测结果见图1）。20对SSR引物在58份火龙果种质资源中共检测出116个等位变异,多态性条带数为116个,多态位点百分率达100%。等位基因数变化范围为2~13,平均每个位点等位基因数（Na）5.8个,有效等位基因数（Ne）变化范围为1.0194~3.3029,平均值为2.0519,香农信息指数（I）平均为0.9186,观测杂合度（Ho）平均为0.3318,期望杂合度（He）平均为0.4603,多态性信息含量指数（PIC）平均为0.417,说明引物的多态性较高,有效揭示了58份火龙果主要商业品种的遗传多样性,同时说明这些引物能用于主要商业品种的指纹图谱构建（表3）。其中引物HU-ssr15、HU-ssr67、HU-ssr91的PIC值高,分别有7、9、13个等位变异,对应的基因型有11、15、16个,有很高的鉴别能力,可以将绝大多数材料鉴别出来,可以作为指纹图谱构建的优选引物。
图1 火龙果品种HU-ssr15引物扩增产物的毛细管电泳检测图

部分火龙果品种用HU-ssr15引物扩增产物的毛细管电泳检测图示例,HU-ssr15引物在所有样品中共扩增多态性位点7个,分别是131、135、137、139、141、145、149 bp。

Fig. 1 Image of capillary electrophoresis detection results of amplified products of pitaya cultivars with HU-ssr15 primer

Some sample images of capillary electrophoresis detection results for pitaya cultivars with HU-ssr15 primer, A total of 7 polymorphic alleles were detected by HU-ssr15 primer in all samples, the size of alleles were 131, 135, 137, 139, 141 ,145 and 149 bp, respectively.

表3 核心引物在参试品种中的多态性信息

Tab. 3 Polymorphism information of core primers in tested cultivars

引物名称Primer name 等位基因数
No. ofalleles		 有效等位基因数
No. of
effective alleles		 香农信息指数
Shannon’s
information index		 Nei氏期望杂合度 Nei’s expected
heterozygosity		 观测杂合度
Observed
heterozygosity		 期望杂合度
Expected
heterozygosity		 多态信息含量指数
Polymorphic
information content
HU-ssr3 8 1.7562 0.9529 0.4306 0.4483 0.4343 0.409
HU-ssr10 2 1.9842 0.6892 0.4960 0.8750 0.5005 0.373
HU-ssr15 7 3.3029 1.4340 0.6972 0.6724 0.7033 0.658
HU-ssr20 3 1.4516 0.5882 0.3111 0.0172 0.3138 0287
HU-ssr23 5 2.6078 1.1882 0.6165 0.6897 0.6219 0.571
HU-ssr27 4 2.2286 0.9273 0.5513 0.5000 0.5561 0.469
HU-ssr36 6 2.4663 1.0909 0.5945 0.0345 0.5997 0.512
HU-ssr43 6 2.4974 1.1689 0.5996 0.6207 0.6048 0.553
HU-ssr56 7 1.8450 0.9979 0.4580 0.0000 0.4620 0.432
HU-ssr65 2 1.0194 0.0542 0.0190 0.0192 0.0192 0.019
HU-ssr66 3 1.4797 0.5566 0.3242 0.1897 0.3270 0.282
HU-ssr67 9 3.1543 1.5580 0.6830 0.1636 0.6892 0.656
HU-ssr74 6 2.7882 1.2241 0.6413 0.1034 0.6469 0.588
HU-ssr77 4 1.1906 0.3488 0.1601 0.0345 0.1615 0.152
HU-ssr80 12 1.9027 1.1904 0.4744 0.3448 0.4786 0.460
HU-ssr85 3 1.9939 0.8351 0.4985 0.5088 0.5029 0.430
HU-ssr86 4 1.2158 0.4148 0.1775 0.0690 0.1790 0.172
HU-ssr91 13 3.0063 1.5693 0.6674 0.6897 0.6732 0.632
HU-ssr94 5 1.4849 0.6721 0.3265 0.2931 0.3294 0.304
HU-ssr99 7 1.6633 0.9121 0.3988 0.3621 0.4022 0.384
平均值 5.80 2.0519 0.9186 0.4563 0.3318 0.4603 0.417

2.2 主要商业品种聚类分析

根据20对核心引物扩增数据,用NTSYS- pc2.1软件,依据遗传相似系数采用UPGMA算法对58个种质进行聚类分析。从图2可见,在遗传相似系数为0.72时,58份火龙果商业品种总体上被分为3个类群。其中第1类只包含了H057（‘翠西亚’）;第2类包括H018（厄瓜多尔‘燕窝果’）、H022（‘糖龙’）、H050（哥伦比亚‘燕窝果’）、H054（‘秘鲁燕窝’）、H056（‘红皮燕窝’）;第3类为常见的主栽品种和地方品种,主要量天尺属类或杂交群体,总共有52份。包括‘大红’‘金都一号’‘蜜红’‘蜜宝’‘石火泉’‘富贵红’‘帝龙’‘福龙’‘甜龙’等系列品种,越南、澳大利亚等国主栽品种,也包括广西、广东、海南、贵州等地方审定品种,这一类群又可以分为多个亚类群,基本上为红皮红肉、红皮白肉、双色等系列品种。这些品种遗传相似系数基本在0.90以上,说明现有主栽品种差异小,遗传背景狭窄,其中H002（‘蜜红’）与H048（‘大龙’）、H020（‘越南白肉’）与H046（‘晶红龙’）等之间的相似系数接近为0.99,说明它们之间的亲缘关系近。
图2 基于20对核心引物的火龙果品种聚类分析

Fig. 2 Cluster dendrogram of the tested pitaya cultivars based on alleles amplified by 20 pair of core primers

2.3 指纹图谱构建

根据20对核心引物扩增结果可以将所有品种区分开,选取最优的9对引物组合（HU-ssr03、HU-ssr15、HU-ssr23、HU-ssr36、HU-ssr56、HU-ssr67、HU-ssr68、HU-ssr74、HU-ssr91）就可以将58份品种完全区分,将代表每个样品等位基因位点有无的“1”和“0”按顺序组成数字指纹,构建了58份主要商业品种和优良品系的指纹图谱（表4）。这些引物的多态性位点有65个,根据概率公式1/2n可知,理论上在265份品种中才有可能存在2个品种的电泳图谱完全相同,置信概率几乎为100%,该指纹图谱可准确检测其中任何品种。其中引物HU-ssr91的多态位点数达13个,可以区分H001（‘大红’）、H022（‘糖龙’）、H057（‘翠西亚’）等16个品种。
表4 58个火龙果商业品种的指纹图谱

Tab. 4 Fingerprint of 58 commercial pitaya cultivars

编号 No. HU-ssr03 HU-ssr15 HU-ssr23 HU-ssr36 HU-ssr56 HU-ssr67 HU-ssr68 HU-ssr74 HU-ssr91
H001 01000000 0001001 00101 001000 0000010 100000000 0100 001000 0001100000000
H002 01000000 0010001 00101 001000 0000000 100000000 0100 001000 0001100000000
H003 01000000 0010001 00001 001000 0000010 100000000 0100 001000 0001100000000
H004 01010000 0011000 01010 001000 0010000 100000000 0100 000100 0011000000000
H005 01100000 0010001 00101 000100 0000010 010000000 0100 001000 0001100000000
H006 01100000 0010100 00101 001000 0010000 100000000 0100 001000 0001100000000
H007 01000000 0010001 00101 100000 0000010 100000000 0100 001000 0001100000000
H008 01000000 0001001 00101 000100 0000010 010000000 0100 001000 0001100000000
H009 01000000 0010001 00101 000100 0000010 001000000 0100 001000 0001100000000
H010 01000000 0010001 00101 010000 0000010 100000000 0100 001000 0001100000000
H011 01100000 0010001 00101 001000 0000010 100000000 0100 010000 0001100000000
H012 01100000 0010001 00101 000100 0000010 001000000 0100 001000 0001100000000
H013 01010000 0010100 00001 000100 0000010 100000000 0100 001000 0001100000000
H014 01010000 0010001 00101 001000 0000010 100000000 0100 010000 0001100000000
H015 01000000 0010001 00101 001000 0000010 001000000 0100 010000 0001100000000
H016 01000000 0010001 00101 000100 1000000 100000000 0000 010100 0001100000000
H017 01000000 1010000 00100 000100 0000010 100000000 0000 000100 0001000000000
H018 01001000 0110000 00100 000100 0000010 001100000 0100 001000 0000100001000
H019 01000000 0110000 01100 000010 0000010 100000000 0001 000001 0001000000000
H020 01000000 0010000 00100 000100 0000010 000000000 0101 000100 0001000000000
H021 01000000 0000100 01100 000101 0000010 000001000 0100 001000 0001000000000
H022 01010000 0001000 01010 000100 0000100 000011000 0001 001000 0001001000000
H023 01000000 0010100 00101 001000 0010000 100000000 1010 010000 0001100000000
H024 01100000 0001100 01100 001000 0000010 000000100 0001 000100 0001000010000
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3 讨论

本研究使用的20个SSR标记,对58份样品进行遗传多样性分析结果中,检测出116个等位变异,多态性条带数为116个,多态位点百分率达100%,等位基因数变化范围为2~13,平均每个位点等位基因数（Na）5.8个,多态性好。但是有效等位基因数（Ne）变化范围为1.0194~ 3.3029,平均值为2.0519,香农信息指数I为0.0542~1.5693,平均为0.9186,观测杂合度（Ho）0.0000~0.8750,平均为0.3318,期望杂合度（He）为0.0192~0.7033,平均为0.4603,多态性信息含量指数（PIC）为 0.019~0.658,平均为0.417,在0.25 < PIC < 0.50之间,为中度多态性,其中20个标记中有7个具有高度多态性（PIC > 0.50）,10个具有中度多态性（0.25 < PIC < 0.50）,3个标记为低度多态性（0 < PIC < 0.25）,说明引物的多态性较高,能有效揭示58份火龙果种质资源的遗传多样性,也能很好地鉴别现有主要商业品种。然而,虽然本研究的样品数增加了,但是相较于前期引物筛选所用18份材料得出的结果（PIC为0.471、13个高度多态性,相关结果文章已发表于《热带农业科学》2020年12期）,整体多态性指数都有降低,说明58份样品的多样性不够。而聚类分析结果也证明火龙果主要商业品种丰富度不够,遗传背景较狭窄。除了第1类H057（‘翠西亚’）和第2类H018（厄瓜多尔‘燕窝果’）、H022（‘糖龙’）、H050（哥伦比亚‘燕窝果’）、H054（‘秘鲁燕窝果’）、H056（‘红皮燕窝果’）,其他的大部分材料相似度很高。H057（‘翠西亚’）棱边缘木栓化、棱边缘波浪形、枝条带粉状物、刺多而细长、果皮暗红色、果肉紫肉、果无刺,与美国品种El特征很相似,从表型描述上基本符合量天尺属的Hylocereus ocamponis表型特征,明显区别于其他类型火龙果。H018（厄瓜多尔‘燕窝果’）、H022（‘糖龙’）、H050（哥伦比亚‘燕窝果’）、H054（‘秘鲁燕窝果’）、H056（‘红皮燕窝果’）可以基本概括为燕窝果类。因此,需加强国外原生种资源的引进,选择遗传差异大的种质作为亲本,这样有助于扩大双亲的遗传基础,提高火龙果育种的效率。而为了更好更准确地进行火龙果种质资源遗传多样性分析,需要筛选更多的多态性位点。另外由于火龙果没有公开发表的基因组序列信息,无法保证所用SSR位点在基因组上均匀分布且每一条染色体上有位点分布,如果要建立品种鉴定的标准方法,需要更多的引物筛选与完整的基因组信息。
早期的RAPD、ISSR、AFLP、SRAP等分子标记方法由于分型不稳定、基因型过多、重复性差、非共显性等原因,不太适合做种质资源的精准鉴定与遗传多样性分析。目前主要用SSR、SNP标记开展相关研究。SSR由于重复性好、多态性高且共显性标记,实验条件要求不高而成为主要应用标记。虽然本研究利用SSR标记构建了现有主要商业品种的分子身份证,实现了品种鉴定,对完成现有主要商业品种分类、品种鉴定和品种权保护提供了技术支撑。但是SSR标记也有其缺点：由于DNA聚合酶的“滑动”现象容易出现错误基因型,SSR位点差异小需要精准确定位点大小比较难。这些缺点导致SSR有一定的错误率。随着测序技术的发展,在基因组水平上的SNP（单核苷酸引起的序列多态性）、MNP（多个核苷酸引起的序列多态性）应用越来越广泛,小麦[16]、玉米[17]、大豆[18]、油菜[19]等主要农作物都开展利用SNP标记进行品种鉴定的相关研究,但是单个SNP位点鉴定能力有限,需要大量的SNP位点才能实现鉴定目标,加上SNP位点太多,多态性位点筛选工作量大;另外SNP位点检测也存在一定的错误率。新的标记法MNP标记可以避免SSR、SNP的缺点、充分利用了SNP标记的优点,多态性丰富、准确率高、效率高等优点,是目前最有效的鉴定方法。后期我们将基于MNP标记法开展火龙果种质资源鉴定研究。
由于我国不是火龙果的原产国,国内引进的大部分火龙果种质资源以商业化品种为主,在火龙果育种过程中可利用的亲本资源不多,再加上集中利用少数亲本导致国内火龙果种质资源遗传多样性低。需要加强国外原生种资源的引进,提升资源丰富度。同时未来将结合SSR与MNP标记法开展火龙果种质资源鉴定与遗传多样性研究,提高技术水平,利用合适的分子标记以期建立更准确更标准化的品种鉴定技术规程,更系统更准确地对火龙果种质资源进行遗传多样性和亲缘关系分析,选择遗传差异大的种质作为亲本,充分利用现有资源,提高火龙果育种的效率,为火龙果分类、育种、品种鉴定、新品种权保护提供重要的技术支撑和理论依据。种质资源和育种辅助技术双管齐下,提升育种效率,加快培育具有自主知识产权的优异品种,推动我国火龙果产业健康可持续发展。

References

Publishing order | Descend order by publishing year | Descend order by cited within
[1]
蔡永强, 向青云, 陈家龙, 等. 火龙果的营养成分分析[J]. 经济林研究, 2008,26(4):53-56.

[2]
Ariffin A A, Bakar J, Tan C P, et al. Essential fatty acids of pitaya (dragon fruit) seed oil[J]. Food Chemistry, 2009,114(2):561-564.

DOI

[3]
Nurliyana R, Syed Zahir I, Mustapha Suleiman K, et al. Antioxidant study of pulps and peels of dragon fruits: A comparative study[J]. International Food Research Journal, 2010,17:367-375.

[4]
Wu L C, Hsu H W, Chen Y C, et al. Antioxidant and antiproliferative activities of red pitaya[J]. Food Chemistry, 2006,95(2):319-327.

DOI

[5]
李兴华. 21世纪保健食品——火龙果[J]. 云南农业, 2001(7):14.

[6]
王凤格, 易红梅, 赵久然, 等. 植物品种鉴定DNA指纹方法总则: NY/T 2594—2014[S]. 北京: 中国农业出版社, 2014.

[7]
程本义, 施勇峰, 沈伟峰, 等. 水稻品种DNA指纹检测技术体系及其应用[J]. 杂交水稻, 2008,23(1):54-59.

[8]
王凤格, 赵久然, 戴景瑞, 等. 玉米品种DNA指纹数据库构建的标准化规范[J]. 分子植物育种, 2007,5(1):128-132.

[9]
李根英, Susanne D, Marilyn L W, 等. 小麦指纹图谱数据库的建立及SSR分子标记试剂盒的研发[J]. 作物学报, 2006,32(12):1771-1778.

[10]
徐群, 魏兴华, 庄杰云, 等. 水稻品种鉴定技术规程SSR标记法: NY/T 1433—2014[S]. 北京: 中国农业出版社, 2014.

[11]
王凤格, 易红梅, 赵久然, 等. 玉米品种鉴定技术规程SSR标记法: NY/T 1432—2014[S]. 北京: 中国农业出版社, 2014.

[12]
廖琴, 陈应志, 邱丽娟, 等. 大豆品种纯度鉴定技术规程SSR分子标记法: NY/T 1788—2009[S]. 北京: 中国农业出版社, 2009.

[13]
赵昌平, 支巨振, 邱军, 等. 主要农作物品种真实性SSR分子标记检测普通小麦: NY/T 2859—2015[S]. 北京: 中国农业出版社, 2015.

[14]
Limei Pan, Jiaxin Fu, Rong Zhang, et al. Genetic diversity among germplasms of pitaya based on SSR markers[J]. Scientia Horticulturae, 2017,225:171-176.

DOI

[15]
杨仕美, 乔光, 毛永亚, 等. 基于火龙果转录组测序的SSR标记开发及种质亲缘关系分析[J]. 分子植物育种, 2018,16(24):8096-8110.

[16]
刘丽华, 刘阳娜, 张明明, 等. 我国75份小麦品种SNP和SSR指纹图谱构建与比较分析[J]. 中国农业科技导报, 2020,22(5):15-23.

[17]
赵久然, 王凤格, 易红梅, 等. 我国玉米品种标准DNA指纹库构建研究及应用进展[J]. 作物杂志, 2015(2):1-6.

[18]
魏中艳, 李慧慧, 李骏, 等. 应用SNP精准鉴定大豆种质及构建可扫描身份证[J]. 作物学报, 2018,44(3):315-323.

[19]
赵仁欣, 李森业, 郭瑞星, 等. 利用SNP芯片构建我国冬油菜参试品种DNA指纹图谱[J]. 作物学报, 2018,44(7):956-965.

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