根际促生细菌（plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR）天然生存于植物根际,具有拮抗病原菌、促进植株生长、诱导植株抗病、修复根际环境等多种功效,是当前实施“减肥、减药”的有效支撑手段[1,2]。芽孢杆菌（Bacillus spp.）具有广普高效、容易培养、耐逆境、耐储藏等特点,是国内外研究和应用最多的生防菌类群。次生代谢产物是芽孢杆菌发挥生防功效的重要手段。目前已发现芽孢杆菌能够产生多种对植物有益的次生代谢产物,包括非核糖体途径（non-ribosomal peptide synthesis,NRPS）合成的脂肽类化合物[3,4]、聚酮合酶合成途径（polyketide synthase,PKS）合成的聚酮类化合物[5,6,7],以及核糖体途径（ribosomal peptide synthesis,RPS）合成的含噻唑（啉）线性肽类物质（linear azol(In)E-containing peptides,LAP）[8]、细菌素（bacteriocin）[9]、硫肽类物质（thiopeptide）[10]、萜烯类物质（terpene）[11]等。芽孢杆菌分泌的有益次生代谢产物种类繁多,全基因组测序是认识和利用生防菌株的重要基础。
1 材料与方法
1.1 材料
生防菌株B. velezensis Z由本研究室从感染胡椒瘟病的胡椒叶片组织中分离获得,保存于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心（China General Microbiological Culture Col-lection Center, CGMCC）,菌株保藏编号为No. 4844。
1.2 方法
1.2.1 全基因组测序 生防菌株B. velezensis Z在LB培养基中于37 ℃ 200 r/min条件下培养12 h 后,1000´g离心收集菌体,提取基因组总DNA,DNA纯度检测合格后,委托深圳华大基因股份有限公司进行de novo测序分析。测序采用第三代PacBio平台与第二代Illumina平台相结合的测序技术,测序结果与COG（cluster of orthologous groups of proteins）、GO（gene ontology）等12个数据库比对进行基因功能注释[14]。
1.2.2 比较基因组学分析 从NCBI Genome上下载B.velezensis FZB42、B. subtilisW23、B. subtilis168等模式菌株的全基因组序列,与B. velezensis Z全基因组序列（包含质粒）一起进行以下比较基因组学分析。
（1）共有基因（Core Gene）和特有基因（Specific Gene）分析：参照Fu等[15]的方法,将生防菌B. velezensis Z的蛋白基因集与其他3个模式菌株的蛋白基因集一起采用CD-HIT 4.6.6软件进行聚类分析,将聚类获得的所有非冗余的基因集定为Pan Gene,提取聚类结果中4个菌株共有的基因集为Core Gene,单个菌株中特有的基因集为Specific Gene,Pan Gene中去除Core Gene为非共有基因集（Dispensable Gene）。根据各基因集在4个菌株基因组中的分布情况,绘制Dispensable Gene热图和Pan Gene文氏图以展现菌株间的聚类情况。参照Tannistha等[16]的方法,将Core/Pan分析结果用TreeBeST 1.9.2软件采用最大似然法（PHYML）计算,bootstraps参数设置为1 000次,构建系统进化树。
1.2.3 次生代谢产物合成基因簇分析 生防菌株B. velezensis Z的抑菌次生代谢产物合成基因簇分析方法与前人[14]报道相同,采用antiSMASH软件（https://antismash.secondarymetabolites.org/#!/start）[19]在线预测。并结合NCBI BLAST比对分析结果,对预测的次级代谢产物合成基因簇进行分析。
2 结果与分析
2.1 全基因组测序结果
测序结果分析发现,生防菌株B. velezensis Z含有1条4 054 780 bp大小的染色体和1个17 122 bp大小的质粒,总基因组的GC含量为46.24%,共编码4173个基因,基因注释率为98.39%;其中染色体的GC含量为46.27%,编码基因4155个,含有27个rRNA、86个tRNA基因、34个sRNA;含有串联重复序列177个,其中13个微卫星DNA,138个小卫星DNA。另外,质粒DNA的GC含量为39.84%,编码基因18个,含有sRNA和串联重复序列各2个。
基于COG数据库注释结果构建基因组圈图（图1）。在预测的4173个基因中,（1）遗传信息类别：染色质结构与动力相关基因1个,RNA加工与修饰相关基因1个,核糖体结构、翻译和生物合成相关基因231个,转录相关基因286个,复制、重组和修复相关基因128个;（2）细胞相关类别：细胞周期控制、染色体分离和细胞分裂相关基因61个,细胞膜、细胞外膜和细胞壁的合成相关基因209个,细胞骨架相关基因2个,细胞外结构相关基因2个,细胞内转运、胞外分泌和小泡运输相关基因36个,细胞运动相关基因64个,防御机制相关基因94个,信号转导机制相关基因183个;（3）新陈代谢类别：翻译后修饰、分子伴侣和蛋白转运相关基因122个,可移动基因组序列（转座子、原噬菌体）相关基因25个,能量产生与转换相关基因177个,氨基酸转运与代谢相关基因305个,碳水化合物转运与代谢相关基因265个,脂类转运与代谢相关基因151个,核苷酸转运与代谢相关基因94个,辅酶转运与代谢相关基因192个,无机离子转运与代谢相关基因180个,次级代谢产物合成、转运与代谢相关基因115个;未知（Poorly）类别：仅常规功能预测的基因335个,功能未知基因206个。
图1 贝莱斯芽孢杆菌Z基因组圈图从外向内依次为：1. 基因组的刻度（大小为Mb）;2. 正链基因;3. 负链基因;4. 正链长链非编码RNA;5. 负链长链非编码RNA;6. 重复序列;7. GC百分含量;8. GC偏好。 Fig. 1 Circle diagram of B. velezensis Z genome From outer to inner: 1. Genome size (Mb); 2. Forward strand gene; 3. Reverse strand gene; 4. Forward strand ncRNA; 5. Reverse strand ncRNA; 6. Repeat; 7. GC; 8. GC-SKEW. |
2.2 比较基因组学分析
2.2.1 基于4个菌株全基因组序列的Core/Pan分析 通过Core/Pan分析,发现B. velezensis Z与3个模式菌株的所有非冗余的Pan Gene数量为5651个,长度为1 578 662 bp;其中共有的Core Gene数量为2702个,长度为823 203 bp;非共有的Dispensable Gene数量为1347个,长度为45967 bp;各菌株特有Specific Gene数量分别为628个、436个、341个和197个。4个菌株中,以B. velezensis Z的Specific Gene数目最多,散布于基因组中,部分基因功能预测与外排转运、核糖体、脂类转运代谢、膜蛋白、DNA修饰、次生代谢产物等相关,大部分基因功能未知（图2）。通过Dispensable Gene同源关系热图（图2A）、Pan Gene同源关系文氏图（图2B）和Core Gene系统发育树（图2C）可看出,B. velezensis Z的基因组与贝莱斯芽孢杆菌模式菌株FZB42最为相似,与另外2株枯草芽孢杆菌模式菌株168具有明显的遗传距离。
图2 4个菌株之间基因组Core/Pan分析结果A：Dispensable Gene同源关系热图;B：Pan Gene同源关系文氏图;C：基于Core Gene同缘关系的系统发育树。 Fig. 2 Core/Pan genome analysis of four bacteria strains A: Heat map based on Dispensable Gene homology; B: Venn diagram based on Pan Genes homology; C: Phylogenetic tree based on Core Gene homology. |
2.2.2 基于4个菌株全基因组序列的Gene Family分析 通过Gene Family分析,发现B. velezensis Z、B. velezensis FZB42、B. subtilis 168、B. subtilis W23等4个菌株能够聚类到Gene Family的基因数量分别为3685个、3907个、3706个和3565个,Gene Family数量分别为2710个、2816个、2715个和2601个;其中共有的Gene Family数量为2777个,各菌株特有的Gene Family数量分别为6个、11个、7个和3个（图3A、图3B）。通过Gene Family系统发育树可看出,B. velezensis Z菌株与B. velezensis FZB42菌株聚类到同一分支,与另外2株枯草芽孢杆菌之间的遗传距离约为0.20（图3C）。
2.3 基于全基因组序列的次生代谢产物预测分析
通过antiSMASH在线预测和NCBI BLAST比对分析,结果发现B. velezensis Z菌株共编码13个次生代谢产物合成基因簇,其中8个基因簇能够找到完全相似或相似度极高的已鉴定基因簇,另有5个基因簇未能找到已鉴定基因簇（表1）。由表1可看出,B. velezensis Z菌株编码的次生代谢产物有非核糖体途径的表面活性素（surfactin）、溶杆菌素（bacilysin）和泛革素（fengycin）;聚酮合酶合成途径的bacillaene、macrolactin和difficidin;以及核糖体途径中Linear azol(in)e-containing peptides（LAP）类的plantazolicin和Bacteriocin类的amylocyclicin。在与已知基因簇比对结果中,表面活性素和Plantazolicin编码基因簇的相似度分别为82%和91%,其他基因簇的相似度均为100%。此外,B. velezensis Z菌株还可能编码5种未知的次生代谢产物,初步预测为2种聚酮类物质、2种萜烯类物质和1种硫肽类物质。在与其他菌株基因组比对结果中,仅有1个基因簇的相似度高达97%,其他基因簇均不高于70%。
表1 次生代谢产物合成区域鉴定结果Tab. 1 Identified secondary metabolite regions |
| 基因组中区域Region of genome | 最相似（已知）基因簇Most similar (known) cluster | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 起始位点From | 结束位点To | 产物Products | 途径Pathways | 相似度Similarity/% | 来源Resources |
| 304 772 | 369 582 | surfactin | NRPS | 82 | Bacillus velezensis FZB42[3] |
| 681 312 | 703 494 | plantazolicin | LAP | 91 | B. velezensis FZB42[8] |
| 1 399 525 | 1 487 630 | macrolactin | PKS2 | 100 | B. velezensis FZB42[5] |
| 1 706 839 | 1 816 558 | bacillaene | PKS1 | 100 | B. velezensis FZB42[6] |
| 1 874 211 | 2 010 127 | fengycin | NRPS | 100 | B. velezensis FZB42[3] |
| 2 418 981 | 2 525 159 | difficidin | PKS3 | 100 | B. velezensis FZB42[7] |
| 3 154 694 | 3 206 486 | amylocyclicin | Bacteriocin | 100 | B. velezensis FZB42[9] |
| 3 717 182 | 3 758 600 | bacilysin | NRPS | 100 | B. velezensis FZB42[7] |
| 568 029 | 596 913 | - | Thiopeptide | 57 | Bacillus velezensis JJD34[20] |
| 914 499 | 955 743 | - | PKS2 | 97 | B. velezensis JJD34[20] |
| 1 040 636 | 1 057 969 | - | Terpene | 56 | B. amyloliquefaciens L-S60[21] |
| 2 033 712 | 2 055 595 | - | Terpene | 46 | B. subtilis 916[22] |
| 2 124 225 | 2 165 331 | - | PKS3 | 70 | B. velezensis NAU-B3[23] |
注：“-”代表该基因簇尚未被鉴定。 | |
Note: “-” in the table means the gene cluster has not been identified. |
3 讨论
细菌de novo测序是其分子机理研究的重要工具,广泛用于遗传进化关系研究、功能相关基因鉴定、工程菌改造等领域,能够为生防菌的分子机理研究及开发利用提供信息基础。本研究对生防菌株B. velezensis Z进行de novo全基因组测序,虽然该菌株的基因组（包括质粒）大小仅有3.88 Mb,但其各种功能元件非常丰富,编码基因长度占总基因组的88.71%。此外,B. velezensis Z 中还携带一个大小为16.72 kb的质粒,共有22个ORF阅读框,其中ORF2~ORF9等8个ORF阅读框与ORF12~ORF19等阅读框的同源性高达100%,每组ORF阅读框中均编码Rap（ORF5/ ORF15）和Rep蛋白（ORF7/ORF17）,表明该质粒的功能可能与细菌群体感应的Rap-Phr双组分调控系统相关[24],为研究和利用生防菌株的群体感应提供了材料和基础。
芽孢杆菌能够分泌丰富多样的次生代谢产物,是其发挥防病、促生长等对植物有益效果的重要前提。王晓宇等[22]发现B. subtilisBs-916菌株的全基因组中包含8个NRPS/PKS基因簇,可以合成fengycin、surfactin、bacillomycin L等物质,具有抑制细菌、真菌、形成生物膜、累积铁离子等作用。Wu等[23]发现B. velezensis NAU-B3的基因组中包含bacillomycin D、bacilysin、bacillaene等8个功能已知的次生代谢产物编码基因簇和1个功能未知基因簇,其长度占基因组总长度的8.5%,合成途径涵盖NPRS途径、PKS途径、PRS等途径。本研究发现生防菌B. velezensis Z编码的fengycin、bacilysin、macrolactin、bacillaene、difficidin、amylocyclicin等6种抑菌产物合成基因簇与已鉴定基因簇完全相同,surfactin和plantazolicin合成基因簇与已鉴定基因簇的相似度也高达82%和91%。这些次生代谢产物被报道具有拮抗植物病原细菌、真菌、病毒,诱导植株抗病性,积累铁离子,生物膜形成等有益功效[3,4,5,6,7,8,9,10,11],说明生防菌B. velezensis Z具有良好的应用价值。此外,从B. velezensis Z菌株的基因组中还预测出5种未知的次生代谢产物合成基因簇,为今后深度挖掘B. velezensis Z生防潜力和发现新型抑菌物质提供基础。