MYB转录因子是真核生物中最大的一类转录因子家族,一般具有DNA结合结构域、转录激活结构域和不完全界定的负调节区3个保守功能域[1]。其中,DNA结合结构域最为保守,一般由1~4个不完全重复的R基序（R1、R2和R3）组成,每个R基序约有52个氨基酸残基[2]。根据结构域特征可将MYB转录因子分为1R-MYB、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和4R-MYB共4个亚家族,其中R2R3-MYB转录因子是植物中最丰富的转录因子类型之一[3,4]。MYB类转录因子在植物体内有着广泛的生物学功能,几乎参与了植物各种生长发育和代谢过程,并在响应逆境胁迫中发挥着关键的调控作用[5],这对于阐明植物抗逆分子机制及其遗传改良具有重要意义。
在MYB转录因子中,关于1R-MYB亚家族成员的功能研究相对较少,1R-MYB在调节植物生物钟、维持染色体结构完整性,以及调控DNA结合蛋白上起重要作用[6,7]。R2R3-MYB亚家族可能是由R1R2R3-MYB亚家族基因丢失了一个R1基序演化形成[8],且是数量最多的MYB转录因子,如拟南芥（Arabidopsis thaliala）有130多个,水稻（Oryza sativa）有109个,葡萄（Vitis vinifera）有117个,大豆（Glycinemax）有244个,玉米（Zea mays）有157个等[9]。R2R3-MYB亚家族的相关功能研究在MYB转录因子中也较多,R2R3-MYB是参与新陈代谢途径最广泛的一类,主要通过调控基因表达而发挥关键作用[2]。
R2R3-MYB转录因子在植物细胞形态建成、生长发育等系列生理过程中发挥重要作用[10],如棉花GhMYB9和GhMYB146能够调控棉花纤维的发育[11,12],拟南芥AtMYB37、AtMYB38和AtMYB84能够调控其侧分生组织的形态建成[13],杨树PtrMYB3和PtrMYB20参与了次生木质部的生物合成[14],大豆GmMYB181调控其生殖器官的发育[15]。R2R3-MYB转录因子也能调控初级、次级代谢产物的生物合成,如拟南芥、葡萄等植物中多个R2R3-MYB基因调控类黄酮生物合成[16]、苯丙烷代谢途径[17,18]以及花青素的生物合成等[19,20]。此外,R2R3-MYB转录因子作为调控蛋白,能够响应生物和非生物胁迫以提高植物的抗逆性[5, 21],如AtMYB44通过调控EIN2增强拟南芥对菜蛾和桃蚜的抗虫性[22],野生大豆GsMYB15异源过表达能够增强转基因拟南芥对棉铃虫和盐胁迫的抗性[23],OsMYB91通过调控SLR1的表达提高水稻的耐盐性[24],OsMYB3R-2转基因水稻的抗旱、抗寒和耐盐性有明显提高[25],烟草NtMYB44b能够响应MeJA、GA、ABA激素处理及干旱胁迫[26],马铃薯StMYB44通过负调控StPHO1应对低磷胁迫[27]。
菠萝（Ananas comosus）又称凤梨,是世界四大热带水果之一,其风味独特,营养丰富,深受国内外消费者的青睐。目前,陈哲等[28]从菠萝基因组中筛选鉴定出103个R2R3-MYB转录因子,并分析其基因结构、编码蛋白和系统进化,Liu等[29]对菠萝全基因组的R2R3-MYB特征和逆境下的表达情况做了分析。而基于转录组信息分析菠萝R2R3-MYB转录因子的研究鲜为报道。因此,本研究从菠萝转录组中筛选和克隆获得1个诱导表达显著上调的R2R3-MYB基因,并通过生物信息学方法和RT-qPCR分析对其生物学特性与功能进行研究,以期为阐明菠萝R2R3-MYB基因在响应冷害、干旱逆境胁迫及其在果实发育中的分子机制提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料和处理
试验材料为广西农业科学院广西亚热带作物研究所菠萝种质资源圃提供的‘金菠萝’（MD-2）品种、‘巴厘’（Comte de Paris）早熟品种和‘pérola’晚熟品种。分别对苗龄为60 d的‘金菠萝’组培苗进行20%浓度的PEG6000干旱胁迫和4 ℃低温胁迫处理,处理时间分别设为0、1、3、6、12、24 h,其中0 h处理的植株作为对照,每个处理设置3个重复,采集相应的叶片。在早熟品种‘巴厘’谢花（从第1朵自然开花的小花算起,下同）后20、35、50、60、65、70 d分别采集果肉,在晚熟品种‘pérola’谢花后20、40、60、80、100、120 d分别采集果肉。以上所有材料取样后进行液氮速冻,保存于-80 ℃超低温冰箱中,并迅速提取总RNA。
1.2 菠萝AcoMYB1基因的cDNA克隆
表1 菠萝AcoMYB1基因克隆与表达所用引物序列Tab. 1 Primer sequences used for cloning and expression of AcoMYB1 from A. comosus |
| 引物名称 Prime names | 引物序列（5°-3°） Prime sequences (5°-3°) | 注释 Notes |
|---|---|---|
| AcoMYB1-F | AGTGGGCATAAAGACCAGCAC | 开放阅读框ORF |
| AcoMYB1-R | GCAAGGTCGGGAATAAACATC | |
| QP-F | GAAGGCGCAAGAGCTAAGGAA | 荧光定量PCR |
| QP-R | ACGCAAGGTCGGGAATAAACA | |
| Q18S-F | AGTTGGACCTTGGGTTGTGTCG | 内参基因 |
| Q18S-R | ATGTATGCAGAGCTTGGGCTTG |
1.3 生物信息学分析
利用NCBI网站的Blast程序进行蛋白质序列的同源检索,用ORF Finder查找最大开放阅读框ORF,用SMART软件预测功能结构域,用ProtParam软件分析蛋白质的基本理化性质,用PSORT软件预测蛋白质的亚细胞定位,用SignalP软件预测信号肽,用TMpred软件预测蛋白质的跨膜区段,用SOPMA软件预测蛋白质的二级结构,用Swiss-model软件预测蛋白质的三维结构（表2）。在NCBI网站进行蛋白同源比对,并用MEGA 5.05软件构建系统进化树。
表2 生物信息学分析数据网址Tab. 2 Web site of bioinformatics analysis databases |
| 软件Software | 功能Function | 网址Web site |
|---|---|---|
| BLAST | 蛋白质序列同源检索 | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
| ORF Finder | 查找最大阅读框架 | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html |
| SMART | 预测功能结构域 | http://smart.embl-heidelberg.de/ |
| ProtParam | 预测蛋白质的基本理化性质 | http://web.expasy.org/protparam/ |
| PSORT | 蛋白质亚细胞分析 | http://www.psort.org |
| SignalP | 预测信号肽 | http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ |
| TMpred | 预测蛋白质跨膜区段 | http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html |
| SOPMA | 预测蛋白质二级结构 | http://www.expasy.org |
| Swiss-Model | 预测蛋白质三维结构 | http://swissmodel.expasy.org/ |
1.4 菠萝AcoMYB1基因表达分析
采用实时荧光定量RT-qPCR方法分析菠萝AcoMYB1基因的表达情况,AcoMYB1基因的特异引物为QP-F和QP-R,菠萝内参基因为18S rRNA基因,引物为Q18S-F和Q18S-R（表1）。通过RT-qPCR分析菠萝AcoMYB1基因在品种‘金菠萝’幼苗期分别经干旱（20% PEG6000）和低温（4 ℃）处理0、1、3、6、12、24 h,以及早熟品种‘巴厘’谢花后20、35、50、60、65、70 d和晚熟品种‘pérola’谢花后20、40、60、80、100、120 d的表达情况。RT-qPCR反应程序为：94 ℃预变性3 min;94 ℃预变性30 s,58.4 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s;72 ℃延伸5 min,18S rRNA和AcoMYB1循环数分别为20和30。每个试验设3次重复,采用2-ΔΔCT方法分析处理数据,确定AcoMYB1基因的相对表达量。
2 结果与分析
2.1 菠萝AcoMYB1基因的克隆
以菠萝品种‘金菠萝’cDNA第1链为模板,AcoMYB1-F和AcoMYB1-R为开放阅读框ORF的扩增引物。通过RT-PCR扩增和序列分析表明,菠萝AcoMYB1基因的cDNA全长序列为1221 bp,ORF长为747 bp,编码一个含248个氨基酸的蛋白质。利用NCBI网站的BLAST程序进行蛋白质序列同源检索显示,AcoMYB1蛋白含有典型的MYB结构域,属于MYB蛋白。因此,将该基因命名为AcoMYB1,GenBank登录号为XM_020230319。
2.2 AcoMYB1蛋白的多序列比对
经过多序列比对分析表明（图1）,AcoMYB1蛋白与海藻、油棕、石刁柏等其他植物来源的MYB家族蛋白具有较高的相似性,即氨基酸序列相似性均在60%以上。蛋白质结构域预测表明,AcoMYB1蛋白N端含有2个保守的SANT结构域,属于MYB转录因子的R2R3亚家族蛋白,其中第1个高度保守的SANT结构域含有51个氨基酸残基（第11~61位）,第2个高度保守的SANT结构域含有49个氨基酸残基（第64~112位）,而非保守序列主要集中于C端。
图1 AcoMYB1与其他植物MYB蛋白的同源性比较AcoMYB1：菠萝（XP_020085908.1）;MYBAS1-like isoform X1：海藻（XP_008795797.1）;MYBAS1：油棕（XP_029123914.1）;MYBAS2-like isoform X2：石刁柏（XP_020276648.1）;MYBAS1-like：铁皮石斛（XP_020682892.2）;MYB59-like isoform X2：蝴蝶兰（XP_020583391.1）。 Fig. 1 Homology of AcoMYB1 and other MYB proteins AcoMYB1: Ananas comosus (XP_020085908.1); MYBAS1-like isoform X1: Sargassum (XP_008795797.1); MYBAS1: Elaeis guineensis (XP_029123914.1); MYBAS2-like isoform X2: Asparagus officinalis (XP_020276648.1); MYBAS1-like: Dendrobium officinale (XP_020682892.2); MYB59-like isoform X2: Phalaenopsis (XP_020583391.1). |
2.3 AcoMYB1蛋白特性及结构分析
通过ProtParam软件分析AcoMYB1蛋白的理化性质显示,AcoMYB1蛋白的相对分子量为28.25 kDa,理论等电点（pI）为5.93,不稳定系数为72.77,亲水平均数为-0.892,因此,推测AcoMYB1蛋白为不稳定亲水酸性蛋白。PSORT软件分析表明,AcoMYB1蛋白可能定位于细胞质。SignalP软件和TMpred软件预测表明,AcoMYB1蛋白不存在信号肽和跨膜结构。SOPMA软件分析结果显示（图2）,AcoMYB1蛋白二级结构中主要含有α-螺旋（47.58%）和无规则卷曲（40.32%）,其次是折叠延伸链（7.26%）和β-转角（4.84%）,且AcoMYB1蛋白2个保守的SANT结构域（R2和R3）主要含有α-螺旋和无规则卷曲。
利用Swiss-model软件基于同源建模预测AcoMYB1蛋白的三维结构,以明确其蛋白结构域的结构特征。以WER转录因子2B的晶体结构（PDB ID：6kks.1A）为同源模板,构建AcoMYB1蛋白的三维预测模型。AcoMYB1蛋白三维结构模型的结果表明（图3）,AcoMYB1蛋白的氨基酸序列与模板序列一致性为54.55%,覆盖率为44%,GMQE值为0.36,QMEAN4值为0.87,主要以单体形式存在,无配体;而且获得的AcoMYB1蛋白三维模型与MYB转录因子的典型结构域高度相似,主要由α-螺旋和无规卷曲构成2个保守的SANT结构域（即DNA结合结构域R2和R3）,这与AcoMYB1蛋白的二级结构预测结果相符合。
2.4 AcoMYB1蛋白的系统发育分析
为了确定菠萝AcoMYB1蛋白在MYB转录因子中的系统进化地位,将来源于不同植物共16个MYB典型蛋白构建系统进化树。分析结果表明（图4）,MYB蛋白可明显分为4个进化分支,其中AcoMYB1与月季MYB59 isoform X1、苹果和罂粟MYB59-like isoform X1和石刁柏MYBAS2-like isoform X2的亲缘关系较近,具有相同的进化起源,推测他们具有类似的结构和功能;与菠萝MYBAS1-like、蝴蝶兰MYB59-like isoform X2和扁桃MYB59的亲缘关系较远。
2.5 菠萝AcoMYB1基因在不同胁迫和果实不同发育时期的表达分析
以菠萝18S rRNA为参照基因,利用实时荧光定量PCR分析菠萝AcoMYB1基因在不同胁迫和果实不同发育时期的表达情况。不同胁迫条件下的表达结果表明（图5）,AcoMYB1基因在幼苗期经4 ℃低温胁迫和PEG模拟的干旱胁迫后,叶片中的表达量都有明显提高,随着时间延长诱导表达的效果越明显,整体上表现出“先升后降”的趋势,推测该基因参与菠萝冷害、干旱逆境胁迫响应。在果实不同发育时期的表达结果表明（图6）,早熟品种‘巴厘’和晚熟品种‘pérola’果实发育成熟过程中,AcoMYB1基因均被诱导表达, 都表现为“升-降-升”的表达趋势,尤其在果实发育早期和果实成熟后期受诱导表达的强度比较突出,推测该基因在菠萝果实早期发育及后期成熟发挥调控作用。
3 讨论
本研究克隆获得了1个菠萝MYB转录因子基因,命名为AcoMYB1。氨基酸序列分析表明,AcoMYB1具有R2R3类MYB转录因子特有的2个高度保守SANT结构域（R2和R3）,这与陈哲等[28]研究结果一致。多序列比对分析显示,AcoMYB1与海藻、油棕、石刁柏等其他植物来源的MYB家族蛋白相似性均在60%以上,表明R2R3类MYB转录因子在进化过程中非常保守。蛋白质理化性质分析显示,AcoMYB1蛋白为不稳定亲水酸性蛋白,其结构不稳定,易溶解。这与R2R3类MYB转录因子其他成员的研究结果一致[23,24]。系统发育分析显示,AcoMYB1与MYB59成员的亲缘关系最近,具有相同的进化起源,推测他们具有类似的结构和功能,为进一步研究AcoMYB1的功能特征奠定基础。
R2R3-MYB转录因子作为植物重要的调控蛋白,能够响应非生物胁迫以提高植物的抗逆性[5, 21]。在非生物胁迫下,拟南芥AtMYB60和AtMYB96能够响应干旱胁迫[31];番茄SpMYB和小麦TaODORANT1能够响应多种非生物胁迫,都能提高转基因烟草的耐盐性和耐旱性[32,33];过表达SlMYB41的转基因番茄耐旱性显著高于野生型植株[34]。这些已报道的R2R3-MYB转录因子大多作为正调控因子,其表达受到多种非生物胁迫的诱导。本研究中实时荧光定量PCR分析表明,AcoMYB1基因在幼苗期经4 ℃低温胁迫和PEG模拟的干旱胁迫后,叶片中的表达量都有明显提高。由此推测AcoMYB1作为正调控因子,参与菠萝冷害、干旱逆境胁迫的响应过程。
此外,R2R3-MYB转录因子在植物生长发育等系列生理过程中同样发挥重要作用[10]。在果实发育成熟过程中,不同品种的草莓FaMYB5基因[35]、辣椒中茄科特有MYB基因MYB31[36]、樱桃pacMYBA基因[37]等都大量表达,尤其是后期的表达量明显高于前期,推测这些基因参与果实发育成熟及其代谢产物的生物合成。本研究中实时荧光定量PCR分析表明,在早熟品种和晚熟品种果实发育成熟过程中,AcoMYB1基因都大量表达,在果实发育早期和果实成熟后期受诱导表达的强度比较突出,推测该基因在菠萝果实早期发育及后期成熟发挥调控作用。至于AcoMYB1基因是否调控菠萝果实代谢产物的生物合成还有待于进一步研究。
R2R3-MYB转录因子是植物中最丰富的转录因子类型之一,是改良植物遗传特性的良好基因资源,可为植物抗逆育种提供一种新的技术途径。本研究表明,AcoMYB1基因可能参与菠萝逆境胁迫响应以及果实发育成熟的调控,但其具体的生物学功能还需采用亚细胞定位、酵母单杂交及遗传转化等技术进一步验证。