魔芋又名蒟蒻、鬼芋、花梗莲、药翦等,属天南星科（Araceae）魔芋属（Amorphophallus Blume）多年生单子叶植物[1],是植物界内目前发现唯一能够在其发达的地下球茎中合成大量葡甘聚糖的草本植物,葡甘聚糖是地下球茎的主要成分,含量高达50%以上,具有降脂降血糖[2,3]、利便[4]以及预防高血压和血栓[5]等功效,并且由其地下球茎制成的魔芋粉具有较好的稳定性、持水性、凝胶性、复配性以及高黏性,被广泛应用于环保、食品、医药、保健、农业、日化及建筑等领域[6,7],具有很高的开发利用价值。魔芋在我国已经有2000多年的栽培历史[8],其中花魔芋（Amorphophallus rivieri Durieu）是栽培比较广泛的品种[9],但其繁殖系数低、生长周期长且规模化种植病害严重[10,11,12],尤其不适于在热带高温高湿多雨生态区种植,严重制约着我国魔芋产业的发展。
珠芽魔芋[Amorphophallus bulbifer(Roxb.) Blume]起源于东南亚热带雨林地区[11],是一类可以在植株主茎与分枝、分枝与分枝、分枝与裂叶、裂叶与裂叶交叉点上生长出气生珠芽球茎的魔芋种,主要分布在中国云南、老挝、缅甸、泰国、印度、孟加拉国以及马来西亚等地[13]。珠芽魔芋植株高1.6~1.8 m,喜高温高湿的环境,但惧强光直射,在遮荫度75%的环境下可以达到最佳产量[14],将其套种在3年生橡胶树下的光合速率和产量最高,且魔芋也可以极大地促进橡胶树的生长[15],不仅可以缓解林下土地资源闲置等问题,还可以稳固橡胶在国家可持续发展战略资源的地位。珠芽魔芋具有葡甘聚糖含量高、生长周期短、生育期长及抗病能力强等优良特性,是魔芋属中适宜于热带、亚热带低海拔地区高温高湿环境的半阴性经济作物,具有良好的产业开发与市场前景。但目前在珠芽魔芋栽培中存在用种量较大的问题,生产中多采用繁育叶面球茎或地下球茎切块的繁殖方式,远不能满足与日俱增的种苗需求,并且种芋品系不纯,内在品质存在明显差异,组培快繁技术对解决珠芽魔芋产业发展中种芋纯化及种芋供不应求的问题具有积极意义。虽然关于魔芋的组织培养技术已有诸多报道[16,17,18,19,20,21],但是关于珠芽魔芋组培研究的报道较少,吴金平等[22]采用珠芽魔芋叶鞘为外植体建立了组培技术体系,但未报道愈伤组织、不定芽诱导率等技术参数。胡楠[23]以珠芽魔芋2年生球茎为外植体,探索了植物生长调节剂配比和培养基状态对外植体褐化和愈伤组织诱导、不定芽诱导、生根诱导的影响,发现在所试激素配比下浅层液体培养基对防止外植体褐化和愈伤组织诱导、不定芽诱导、生根诱导均优于固体培养基,其研究结果还显示用球茎做外植体褐化率较高。桂明春等[24]以珠芽魔芋试管苗叶柄为外植体,探索了植物生长调节剂对珠芽魔芋组织培养各环节的影响。珠芽魔芋外植体的选择主要是球茎和叶柄,且珠芽类魔芋种质较多,不同外植体材料及种质使用的最佳植物生长调节剂组合差异显著,目前关于以珠芽魔芋不同发育时期的叶片为外植体建立组培快繁体系的研究鲜见报道。因此,本研究以从云南省景洪市获得的珠芽黄魔芋不同发育时期的叶片为外植体,开展组培快繁研究,以探索出一套适于珠芽黄魔芋的组培快繁技术体系,解决热区魔芋产业发展面临的健康优良种芋供应不足等问题,以期为加快热区魔芋产业发展提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
2018年从云南省景洪市获得珠芽黄魔芋（Amorphphallus bulbifer）叶面球茎,种植于海南省海口市中国热带农业科学院橡胶研究所实验室的盆栽试验区内,根据实验需要分别采集不同发育时期的叶片作为外植体材料开展组培实验,包括叶芽、开始伸出鳞片叶片、完全伸出鳞片叶片、刚展开的叶片和成熟的叶片（图1）。
1.2 方法
1.2.1 外植体消毒 采集珠芽黄魔芋开始伸出鳞片的叶片作为外植体材料,将材料清洗干净后,放置在干净的烧杯中并盖上一层纱布（用橡皮筋固定）,然后用自来水冲洗1 h后,最后在超净工作台上按无菌操作要求对外植体材料进行消毒处理。实验共设计4个消毒处理,即0.1% HgCl2溶液浸泡5、10、15、20 min,每处理3个重复,每处理60段材料。无菌操作步骤如下：（1）用75%酒精消毒30 s,然后用无菌水冲洗数次;（2）用0.1% HgCl2溶液分别浸泡5、10、15、20 min,再用无菌水冲洗5次,最后用无菌滤纸吸干水分;（3）将材料切成小段,每段长约0.5 cm,然后接种于MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂7 g/L的培养基（pH 6.0）中;（4）接种后于25 ℃条件下暗培养2周,再转移到25 ℃,光照1000~1500 lx下培养,每天光照12 h,30 d后统计外植体的污染率、褐化率及成活率。
1.2.2 外植体材料筛选 选取5种不同发育时期叶片作为外植体材料,即叶芽、开始伸出鳞片叶片、刚完全伸出鳞片叶片、刚展开的叶片、成熟的叶片,参照1.2.1中的外植体消毒（0.1% HgCl2溶液浸泡15 min）、接种、暗培养和光培养方法进行处理,30 d后统计外植体的污染率、褐化率、愈伤组织诱导率及死亡率。
1.2.3 愈伤组织诱导 愈伤组织诱导培养基设TDZ和NAA 2个因子,TDZ设置3个水平,分别为0.1、0.5、1.0 mg/L;NAA设置3个水平,分别为0.1、0.5、1.0 mg/L,随机区组设计,3个重复。培养基中添加蔗糖30 g/L,琼脂6 g/L,pH调至6.0。实验采用开始伸出鳞片的叶片为外植体材料,参照1.2.1中的外植体消毒方法（0.1% HgCl2溶液浸泡15 min）进行消毒并接种至愈伤组织诱导培养基上,每个处理接种45段,然后参照1.2.1中的暗培养和光培养方法进行培养,30 d后统计愈伤组织诱导率。
1.2.4 不定芽诱导 不定芽诱导培养基设6-BA和NAA 2个因子,6-BA设置3个水平,分别为0.1、0.5、1.0 mg/L;NAA设置3个水平,分别为0.1、0.3、0.5 mg/L,随机区组设计,3个重复。培养基中添加蔗糖30 g/L,琼脂6 g/L,pH调至6.0。选取接种质量约为5 g的愈伤组织小块,接种至不定芽诱导培养基上,每个处理接种45块,然后置于28 ℃、光照2000 lx下培养,每天光照12 h,培养45 d后统计各处理的不定芽诱导率及单位质量愈伤组织分化芽数。
1.2.5 生根诱导 设4个因素,分别为NAA、不同状态的组培苗、基本培养基和蔗糖浓度。其中NAA浓度设4个水平,分别为0.00、0.10、0.25、0.50 mg/L;组培苗状态设2个水平,3 cm长的芽和全展叶片苗;基本培养基设2个水平,1/2 MS和MS;蔗糖浓度设2个水平,15、30 g/L;添加琼脂6 g/L,pH调至5.8。采用L8(4×24)正交试验设计,每处理3个重复,每处理接种45株。将丛芽分切成单芽,接种于生根培养基,然后置于28 ℃、光照1000 lx下培养,每天光照12 h,4周后统计各处理生根株数及长于2 cm根数。
1.3 计算公式
污染率=污染外植体块数/接种总块数×100%
褐化率=褐化外植体块数/接种总块数×100%
成活率=成活外植体块数/接种总块数×100%
死亡率=死亡外植体块数/接种总块数×100%
愈伤组织诱导率=长愈伤组织外植体块数/接种总块数×100%
不定芽诱导率=萌芽的外植体块数/接种总块数×100%
单位接种质量愈伤组织分化芽数=N/（W2-W1）
式中,N：芽长大于2 cm个数;W1：培养基+ 瓶子;W2：培养基+瓶子+培养物。
生根率=生根株数/接种单苗总株数×100%
平均根数=长于2 cm根数/接种单苗总株数
1.4 数据处理
采用Excel 2016和DPS 7.5软件进行统计分析,多重比较采用邓肯氏新复极差检验法（Duncan’s multiple ranger test）。
2 结果与分析
2.1 不同消毒时间对开始伸出鳞片叶片外植体消毒效果的影响
从表1可知,0.1% HgCl2的消毒时间对开始伸出鳞片叶片外植体消毒效果具有显著性的影响。消毒时间低于15 min,随着时间的延长,污染率降低,消毒时间为5 min和10 min时污染率分别为36.7%和23.3%,污染率较高,观察到的污染均是细菌性污染,而消毒时间为15 min和20 min时污染率均为0,所以消毒时间过短不能完全杀死细菌。但是随着消毒时间的延长,褐化率也逐渐升高,消毒时间为15 min和20 min时褐化率分别达到3.3%和8.3%。通过综合评价,最佳消毒方式为使用0.1% HgCl2消毒15 min,其污染率为0,褐化率3.3%,成活率达到96.7%。
表1 0.1% HgCl2不同消毒时间对开始伸出鳞片叶外植体消毒效果的影响Tab. 1 Effects of different treatment time of 0.1% HgCl2 on sterilization of explants |
| 处理 Treatment | 消毒时间 Sterilization time/min | 污染率 Pollution rate/% | 褐化率 Browning rate/% | 成活率 Survival rate/% |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 5 | 36.7a | 0.0b | 63.3c |
| 2 | 10 | 23.3b | 0.0b | 76.7b |
| 3 | 15 | 0.0c | 3.3b | 96.7a |
| 4 | 20 | 0.0c | 8.3a | 91.7a |
注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05). |
2.2 不同发育时期外植体材料对愈伤组织诱导的影响
不同发育时期的外植体对愈伤组织诱导效果存在差异（表2）。叶芽的污染率和褐化率较高,分别达到16.7%和56.7%,可能原因是叶芽较幼嫩,消毒剂对其自身伤害较大,且卷曲多缝,消毒剂难以到达部分区域,导致消毒不够彻底。刚展开的叶片和成熟的叶片外植体材料生长缓慢,叶片边缘黄化,最终全部死亡。开始伸出鳞片叶片与刚完全伸出鳞片叶片的污染率、褐化率、死亡率均差异不显著,并且愈伤组织诱导率分别达到96.7%和93.3%。通过综合评价,最佳的外植体材料为开始伸出鳞片叶片。
表2 不同发育时期外植体材料对愈伤组织诱导的影响Tab. 2 Effects of different growth period explant materials on callus induction |
| 外植体材料 Explant materials | 污染率 Pollution rate/% | 褐化率 Browning rate/% | 愈伤组织诱导率 Callus induction rate/% | 死亡率 Mortality rate/% |
|---|---|---|---|---|
| 叶芽 | 16.7a | 56.7a | 26.7b | 73.3b |
| 开始伸出鳞片叶片 | 0.0b | 3.3b | 96.7a | 3.3c |
| 刚完全伸出鳞片叶片 | 0.0b | 0.0b | 93.3a | 6.7c |
| 刚展开的叶片 | 0.0b | 0.0b | 0.0c | 100.0a |
| 成熟的叶片 | 0.0b | 0.0b | 0.0c | 100.0a |
注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05). |
2.3 不同植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响
不同植物生长调节剂对愈伤组织诱导效果存在差异（表3）。当TDZ浓度一定时,随着NAA浓度的增大,愈伤组织诱导率逐渐下降,在TDZ浓度为0.1 mg/L与NAA浓度为1.0 mg/L时,愈伤组织诱导率最低,仅为26.7%;而当NAA一定时,随着TDZ浓度的增大,愈伤组织诱导率先升高后下降,在NAA浓度为0.1 mg/L与TDZ浓度为0.5 mg/L时,愈伤组织诱导率达到最高。这表明在愈伤组织诱导过程中,TDZ起主导作用,而低浓度NAA有利于愈伤组织的诱导。通过综合评价,愈伤组织诱导最佳植物生长调节剂配比为：TDZ浓度为0.5 mg/L,NAA浓度为0.1 mg/L,此时愈伤组织诱导率达到95.6%（图2A）。
表3 不同植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响Tab. 3 Effects of different plant growth regulators on callus induction |
| 处理 Treatment | TDZ /(mg·L-1) | NAA /(mg·L-1) | 愈伤组织诱导率 Callus induction rate/% |
|---|---|---|---|
| 1 | 0.1 | 0.1 | 53.3bc |
| 2 | 0.1 | 0.5 | 40.0cd |
| 3 | 0.1 | 1.0 | 26.7d |
| 4 | 0.5 | 0.1 | 95.6a |
| 5 | 0.5 | 0.5 | 71.1b |
| 6 | 0.5 | 1.0 | 55.6bc |
| 7 | 1.0 | 0.1 | 66.7b |
| 8 | 1.0 | 0.5 | 57.8bc |
| 9 | 1.0 | 1.0 | 46.7c |
注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05). |
2.4 不同植物生长调节剂对不定芽诱导的影响
表4 不同植物生长调节剂对不定芽诱导的影响Tab. 4 Effects of different plant growth regulators on adventitious bud induction |
| 处理 Treatment | 6-BA /(mg·L-1) | NAA /(mg·L-1) | 不定芽诱导率 Adventitious bud induction rate/% | 单位接种质量愈伤 组织分化芽数 Number of differentiation buds of callus with unit inoculation quality/(个·g-1) |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 0.1 | 0.1 | 86.7a | 1.73bcd |
| 2 | 0.1 | 0.3 | 82.2a | 1.00de |
| 3 | 0.1 | 0.5 | 68.9a | 1.07de |
| 4 | 0.5 | 0.1 | 86.7a | 1.76bcd |
| 5 | 0.5 | 0.3 | 71.1a | 1.20cde |
| 6 | 0.5 | 0.5 | 64.5a | 0.87e |
| 7 | 1.0 | 0.1 | 71.1a | 1.88bc |
| 8 | 1.0 | 0.3 | 60.0a | 2.09b |
| 9 | 1.0 | 0.5 | 71.1a | 2.88a |
注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05). |
2.5 不同培养基成分对生根诱导的影响
表5 不同培养基成分对生根诱导的影响Tab. 5 Effects of different medium components on rooting induction |
| 处理 Treatment | 不同状态组培苗 Tissue culture seedlings in different conditions | NAA /(mg·L-1) | 基本培养基 Basic medium | 蔗糖浓度 Sucrose concentration/(g·L-1) | 生根率 Rooting rate/% | 平均根数 Average root number |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 3 cm长的芽 | 0.00 | 1/2 MS | 15.0 | 71.1abc | 1.56b |
| 2 | 全展叶片苗 | 0.00 | MS | 30.0 | 46.7c | 0.97bc |
| 3 | 3 cm长的芽 | 0.10 | MS | 30.0 | 66.7abc | 0.82bcd |
| 4 | 全展叶片苗 | 0.10 | 1/2 MS | 15.0 | 53.3bc | 2.33a |
| 5 | 3 cm长的芽 | 0.25 | 1/2 MS | 30.0 | 46.7c | 0.13d |
| 6 | 全展叶片苗 | 0.25 | MS | 15.0 | 100.0a | 1.36b |
| 7 | 3 cm长的芽 | 0.50 | MS | 15.0 | 44.5c | 0.20cd |
| 8 | 全展叶片苗 | 0.50 | 1/2 MS | 30.0 | 90.0ab | 0.83bcd |
注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05). |
由表5可见,当NAA浓度在0~0.25 mg/L范围内增大时,全展叶片苗的生根率逐渐升高,在NAA浓度达到0.25 mg/L时,生根率达到100.0%。当NAA浓度在0.1~0.5 mg/L范围内增大时,全展叶片苗的平均每株生根数逐渐下降,但是长出的根会更加粗壮。综合考虑下,全展叶片苗在MS+NAA 0.25 mg/L+蔗糖15 g/L+琼脂6.0 g/L培养基中最适合生根诱导。
2.6 驯化移栽
3 讨论
影响愈伤组织诱导的因素一般包括消毒方式、外植体的类型以及培养基的类型等。其中,消毒时间是获得无菌培养材料的重要因素,在本研究中发现随着0.1% HgCl2消毒时间的增加,污染率逐渐下降,褐化率逐渐升高,而成活率先升高再下降,这表明消毒剂消毒时间过长也会对外植体本身造成伤害,这与李新等[25]对山蒌嫩茎消毒的研究结果一致。不同部位的外植体以及外植体的新老程度都会对愈伤组织的诱导有极大影响。目前关于魔芋组培外植体的选取研究中,使用芽、芽鞘[26]、叶片[27]、叶柄[28]、球茎[29]、种子[30]作为外植体材料并成功诱导出完整植株的研究皆有报道,而在珠芽魔芋组培快繁研究中,主要以球茎和叶柄作为外植体材料[23,24],而对不同发育时期的叶片作为外植体的研究未见报道。本研究采用珠芽黄魔芋不同发育时期的叶片作为外植体时发现,开始伸出鳞片至刚完全伸出鳞片的叶片的污染率、褐化率、死亡率均最低,而愈伤组织诱导最高,可能是该叶片发育时期的外植体生长最活跃,带菌少,细胞含酚类化合物较少,生理状态处于最适诱导愈伤组织时期;叶芽的污染率和褐化率较高,可能是因为顶芽生长在高温高湿的土壤中,不可避免地携带了大量的外生菌和内生菌,而内生菌极难通过表面消毒杀死,所以造成外植体污染率极高,这与刘进平[31]对胡椒组培过程中污染问题的研究结果一致;本研究中叶芽褐化率和死亡率较高,可能是因为叶芽期材料幼嫩,消毒剂对其伤害比较重。刚展开的叶片和成熟的叶片在愈伤组织诱导过程中发现,其生长速度缓慢,叶片边缘黄化,最终全部死亡,这与秦正伟等[27]采用全展开时期叶片作为外植体材料的研究结果一致。王自布等[7]以魔芋幼叶、块茎、茎段为外植体诱导愈伤组织过程中,发现在培养基中加入2,4-D或者IAA后,幼叶和茎段的愈伤组织诱导率大于块茎。张征兰等[26]在魔芋组织培养与植株再生的研究中发现,在MS培养基中只加入细胞分裂素或生长素均不能诱导出愈伤组织,只有同时加入细胞分裂素与生长素才能成功诱导出愈伤组织。本研究采用刚伸出鳞片叶片作为外植体材料,发现不同植物生长调节剂对愈伤组织诱导效果差异显著,当TDZ浓度为0.1 mg/L与NAA浓度为1.0 mg/L时,愈伤组织诱导率最低,仅为26.7%,而当NAA浓度一定时,随着TDZ浓度的增大,愈伤组织诱导率先升高后下降,在NAA浓度为0.5 mg/L与TDZ浓度为0.1 mg/L时,愈伤组织诱导率达到最高,这表明在愈伤组织诱导过程中,细胞分裂素起主导作用,而低浓度的生长素有利于愈伤组织的形成,这与庄承纪等[28]对魔芋属植物愈伤组织诱导的研究结果一致。
生长素可以有效促进组培苗生根[35,36],但浓度过高则会产生乙烯,从而产生抑制作用[37]。赵青华等[38]在对魔芋丛生芽生根的诱导过程中,添加了多效唑,可以与生长素起协同作用,使组培苗生根更快。本研究采用正交试验设计,探明了不同状态组培苗与培养基成分对组培苗生根的影响情况,通过比较F值发现,对生根诱导影响大小依次为：组培苗不同状态>NAA>蔗糖浓度>基本培养基。原因可能是因为全展叶片组培苗能够进行光合作用产生更多的生长素,更有利于促进组培苗的生根,而NAA对组培苗生根的影响仅次于组培苗不同状态,当NAA浓度在0~0.25 mg/L范围内增大时,全展叶片苗的生根率逐渐升高,在NAA浓度达到0.25 mg/L时,生根率达到100.0%,这与蒋晓云等[39]在研究红魔芋块茎生根诱导试验中的结果相似,蔗糖浓度和基本培养基对组培苗生根的影响较小。
本研究初步建立了包括外植体消毒与筛选、愈伤组织诱导、不定芽诱导、生根诱导及驯化移栽的珠芽黄魔芋组培快繁技术体系,为魔芋种苗的规模化生产提供了技术支撑,对解决珠芽魔芋产业发展中种芋供不应求的问题具有积极意义。