辣木（Moringa spp.）为辣木亚目（Moringineae）辣木科（Moringaceae）辣木属（Moringa Adans.）植物,是单科单属植物[1]。辣木原产于印度、巴基斯坦等南亚国家以及阿拉伯半岛及非洲大陆,具有独特的经济价值和营养保健作用。辣木各个部位如叶、花、果、种子等均可食用,特别是辣木叶含有较高的蛋白质、维生素和矿物质等营养成分[2,3,4,5]。辣木叶、花、果等部位还含有丰富的植物多糖、黄酮类、生物碱、酚类等多种活性成分,具有降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗炎抑菌等作用,有较高的药用价值[6,7,8]。此外,辣木因生长迅速、主杆粗壮、株型圆满、花期长、花量多等优点,已应用于城市广场绿化。辣木有13个种,其中只有4个种有栽培价值。常见种植的主要是多油辣木（M. oleifera Lam.）和狭瓣辣木[M. stenopetala (Baker f.) Cufod.]2个种。多油辣木原产于印度北部喜马拉雅山脉,由于口感好,产量高,是目前世界上的主栽种。印度科研人员在多油辣木原种的基础上,采用选择育种和杂交育种方式分别培育出2个改良品种‘PKM1’和‘PKM2’,并在全世界得到推广种植[1, 9]。狭瓣辣木原产于埃塞俄比亚和肯尼亚北部,叶片较大,芳香味浓,在非洲有较大面积栽培[1]。近10 a来,随着消费群体对辣木营养价值、药用价值及功效的认识逐渐深化,辣木在我国云南、广西、海南、广东、福建等热带、南亚热带地区得到了快速推广种植[10,11,12,13],并在北方一些栽培设施内也得到了推广[14]。
我国并非辣木原产地,目前国内种植所需种子大部分是从境外进口,小部分由国内种植者自己采种。由于辣木在国内大面积种植时间较短,没有自主产权的辣木品种,辣木种子管理尚不规范,因而市场上辣木品种混杂,真假难分。国内科研人员已着手进行辣木选育种工作[15]。辣木以杂交育种为主,亲本间的遗传关系将在很大程度上决定杂交F1代种子的质量。因而,将筛选出具有明显表观特征的辣木种质资源,利用分子标记进行遗传关系分析,是育种过程中重要的一环。
随着分子标记技术的发展,多种DNA分子标记技术已广泛应用于种质资源评价、遗传多样性分析和图谱构建等方面,如限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）、随机扩增DNA多态性（random amplified polymorphic DNA, RAPD）、简单重复序列（simple sequence repeat, SSR）、相关序列扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism, SRAP）和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）等[16,17]。SRAP因具有较好的重复性、较强的多态性、共显性标记系统和操作简便、成本低等特点,成为植物亲缘关系和遗传多样性分析的有效手段,已应用于果树、蔬菜、花卉等多种植物辅助育种研究中[18,19,20,21]。目前,鲜见有关SRAP分子标记技术应用于辣木种质资源亲缘关系分析的研究报道。笔者自2012年起收集辣木种质资源,建立了种质资源圃,进行试种观测。本研究对辣木SRAP标记的通用引物进行筛选,对18份具有鲜明特征、拟作为育种亲本的辣木种质资源进行遗传多样性和亲缘关系分析,了解其遗传背景,明确各材料间的亲缘关系,为下一步进行辣木杂交育种提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料均采自福建省热带作物科学研究所辣木种质资源圃。资源圃的辣木种质主要引自于中国云南、海南、广东、台湾,以及印度、泰国、缅甸、卢旺达等地。供试材料共18份,根据种（品种）名、引种地及特征进行编号（表1）,其中S6~S8尚不能确定品系归属。采集各供试材料的幼嫩叶片,装入自封袋并编号,每袋20片叶子,加入硅胶,叶片充分干燥后保存于-80 ℃冰箱中备用。
表1 18份辣木品系样品信息表Tab. 1 18 Moringa materials information |
| 编号 No. | 品种名称 Variety | 引种地 Germplasm sources | 特征 Characteristic |
|---|---|---|---|
| S1 | M. oleifera Lam. | 中国云南 | 嫩梢绿色 |
| S2 | M. oleifera PKM2 | 印度 | 嫩梢绿色 |
| S3 | M. oleifera Lam.Y1 | 中国云南 | 嫩梢微红 |
| S4 | M. oleifera PKM2 | 印度 | 嫩梢红色 |
| S5 | M. oleifera PKM1 | 印度 | 小叶较大 |
| S6 | 待定 | 缅甸 | 嫩梢绿色 |
| S7 | 待定 | 泰国 | 嫩梢绿色 |
| S8 | 待定 | 中国台湾 | 嫩梢绿色 |
| S9 | M. oleifera Lam. | 印度 | 嫩梢微红 |
| S10 | M. oleifera Lam. | 印度 | 嫩梢绿色 |
| S11 | M. oleifera PKM1 | 中国云南 | 嫩梢红色 |
| S12 | M. oleifera PKM1 | 中国云南 | 嫩梢绿色 |
| S13 | M. oleifera PKM2 | 中国云南 | 嫩梢红色 |
| S14 | M. stenopetala (Bakerf.) Cufod. | 卢旺达 | 小叶较大 花香较浓 |
| S15 | M. oleifera PKM2 | 中国云南 | 嫩梢绿色 |
| S16 | M. oleifera PKM1 | 中国云南 | 果荚较长 |
| S17 | M. oleifera Lam. | 中国海南 | 嫩梢红色 |
| S18 | M. oleifera Lam. | 中国海南 | 嫩梢绿色 |
1.2 方法
1.2.1 总DNA的提取和检测 辣木基因组DNA提取参考林艺华等[22]的方法,采用天根高效植物基因组DNA提取试剂盒（DP350）进行提取,总DNA采用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测完整性,并用核酸蛋白仪（Eppendorf BioPhotometer Plus）测定其浓度和质量。基因组DNA条带明亮,完整无降解。加入适量无菌水后将其稀释至20 ng/µL,并置于-20 ℃冰箱保存备用。
1.2.2 PCR引物筛选及反应体系 以种质S1的DNA为模板,筛选17条上游引物（编号为A~Q）,10条下游引物（编号为1~10）,两两组成170对SRAP引物,引物序列见表2。SRAP-PCR扩增总体积为25 µL,其中包括不含Mg2+的10×PCR buffer 2.5 µL,Mg2+ 2 mmol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,DNA浓度为2 µL（20 ng/µL）,Taq DNA聚合酶用量为0.625 U,上下游引物各0.75 µmol/L。引物来源于生工生物工程（上海）股份有限公司,PCR试剂来源于宝生物工程（大连）有限公司。
表2 SRAP引物及其序列Tab. 2 SRAP primer sequence |
| 编号 No. | 上游引物（5'-3'） Forward primer (5'-3') | 编号 No. | 下游引物（5'-3'） Reverse primer (5'-3') |
|---|---|---|---|
| A | GACTGCGTACGAATTAAT | 1 | TGAGTCCAAACCGGATA |
| B | GACTGCGTACGAATTTGC | 2 | TGAGTCCAAACCGGAGC |
| C | GACTGCGTACGAATTGAC | 3 | TGAGTCCAAACCGGAAT |
| D | GACTGCGTACGAATTTGA | 4 | TGAGTCCAAACCGGACC |
| E | GACTGCGTACGAATTAAC | 5 | TGAGTCCAAACCGGAAG |
| F | GACTGCGTACGAATTGCA | 6 | TGAGTCCAAACCGGTAG |
| G | GACTGCGTACGAATTATG | 7 | TGAGTCCAAACCGGTTG |
| H | GACTGCGTACGAATT AGC | 8 | TGAGTCCAAACCGGTGT |
| I | GACTGCGTACGAATTACG | 9 | TGAGTCCAAACCGGTCA |
| J | GACTGCGTACGAATTTAG | 10 | TGAGTCCAAACCGGTAC |
| K | GACTGCGTACGAATTTCG | ||
| L | GACTGCGTACGAATTGTC | ||
| M | GACTGCGTACGAATTGGT | ||
| N | GACTGCGTACGAATTCAG | ||
| O | GACTGCGTACGAATTCTG | ||
| P | GACTGCGTACGAATTCGG | ||
| Q | GACTGCGTACGAATTCCA |
将上述SRAP-PCR反应混合液按如下程序进行扩增：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,37 ℃复性1 min,72 ℃延伸1 min,5个循环;94 ℃变性1 min,50 ℃复性1 min,72 ℃延伸1 min,35个循环;72 ℃再延伸10 min,于4 ℃下保存。
1.3 数据处理
SRAP-PCR扩增后采用2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,使用凝胶成像系统拍照记录结果。根据扩增结果,清晰、可重复且长度范围在200~2000 bp内的进行记录,对同一引物的扩增条带,有条带记为“1”,无条带记为“0”,建成原始表征0-1数据矩阵。SM相似系数利用NTSYS 2.1软件中Similarity程序的Qualitative data计算,用Clustering程序中的SHAN进行UPGMA聚类分析,绘制出聚类图。辣木遗传多样性参数采用POPGENE 32计算,包括群体多态性位点百分率（P）、观察等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、基因多样性指数（H）和Shannon信息指数（I）。
2 结果与分析
2.1 SRAP引物筛选
表3 13对SRAP引物组合筛选情况Tab. 3 Screened results of 13 pairs of primer combinations |
| 上游引物 Forward primer | 下游引物Reverse primer | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| A | - | - | - | - | - | √ | - | - | - | - |
| B | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| C | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| D | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| E | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| F | √ | √ | √ | - | - | - | - | - | - | - |
| G | - | - | √ | - | - | - | - | - | - | - |
| H | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| I | - | - | - | √ | - | - | - | - | - | - |
| J | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| K | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| L | - | - | - | - | - | - | - | √ | - | - |
| M | - | √ | √ | - | - | - | - | - | - | - |
| N | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| O | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| P | - | - | - | - | - | - | √ | √ | - | - |
| Q | √ | √ | - | - | - | - | - | - | - | - |
注：√为有差异条带、带型清晰的引物组合。-表示条带不清晰或多态性不佳的引物组合。 | |
Note: √ indicated the primer combinations which existed differential and clear bands. - indicated the primer combinations with unclear bands or poor polymorphism. |
图1 SRAP标记的引物筛选电泳图M：2000 bp DNA marker;A中1~10号泳道上下游引物分别为L1~L10;B中1~10号泳道上下游引物分别为M1~M10。 Fig. 1 Agarose gel electrophoresis results for SRAP primers screening M: 2000 bp DNA marker; The primer combinations of land 1-10 were L1-L10 in fig. A; The primer combinations of land 1-10 were M1-M10 in fig. B. |
2.2 扩增多态性及遗传多样性分析
用13对SRAP引物对18份辣木样品进行PCR扩增,总共获得104条扩增带,其中多态性条带数为65条,平均多态性条带百分率为62.50%。采用POPGENE软件对SRAP分子标记方法扩增的结果进行分析,结果表明,等位基因数（Na）为1.6250,基因多样性指数（H）为0.2632,有效等位基因数（Ne）为1.4777,Shannon信息指数（I）为0.3797。说明试验所用18份辣木种质资源间有较丰富的遗传多样性。
2.3 辣木亲缘关系分析
根据SRAP分子标记PCR扩增的结果进行数据统计,形成0-1矩阵,进而通过NTSYS 2.1软件对该数据进行聚类分析。基于SRAP分子标记的聚类结果表明（图2）,在相似系数为0.62处时,S14单独聚类为1个分支,为来自于非洲卢旺达的狭瓣辣木。在相似系数为0.732处,另外17份辣木材料分为2类,I类为S1~S11,共11份材料;Ⅱ类为S12~S13、S15~S18,共6份材料。I类群的11份材料主要为来源于印度的多油辣木及其改良种‘PKM1’和‘PKM2’,Ⅱ类群的6份材料主要为来源于我国云南和海南的多油辣木及其改良种‘PKM1’和‘PKM2’。
3 讨论
分子标记技术是DNA水平上遗传变异的直接反映,不受环境及基因表达与否的限制,遍及整个基因组,遗传稳定,能够克服形态学鉴定的很多困难。利用分子标记对辣木遗传多样性和亲缘关系进行分析对育种工作中亲本的选择具有重要指导意义。已有研究表明,辣木种间、种内不同个体间存在着丰富的遗传多样性。韩闯等[23]利用ISSR标记对7个不同种的辣木材料进行了分析,将7份材料聚为4类,认为同种辣木植物的样品间遗传距离相对较小,不同种的辣木遗传距离较远。李海渤等[24]采用RAPD分子标记技术对同一品种内78株不同形态特征的辣木遗传多样性进行了研究,将参试材料划分为4个大类,并认为参试材料虽为同一品种但单株间差异大,遗传背景丰富,不同形态特征与遗传无关,可能是环境变化或营养组分的差异所致。魏静[25]应用SSR标记对多油辣木种内10个种源进行了分析,也认为各种源内存在广泛的变异,个体层次的遗传背景丰富。郑硕理等[26]采用AFLP分子标记技术对27份在云南省栽培的辣木遗传多样性和亲缘关系进行了分析,发现来自同一栽培区域、具有相同性状的材料没有按预期聚类在一起,因而认为栽培辣木种群内遗传分化较大。林艺华等[27]曾利用RAPD和ISSR分子标记技术分析了16份辣木种质资源的亲缘关系。
不同分子标记在辣木种质资源的分析中各具特点,SSR和AFLP标记都存在费用较高的问题,RAPD标记的稳定性和重复性差,ISSR对PCR扩增的最适条件要求严格。SRAP标记是基于PCR的一种新型标记系统,通过一对引物对开放阅读框进行扩增,在设计引物时正反引物分别是针对序列相对保守的编码区与变异大的内含子、启动子和间隔序列,因此多数SRAP标记在基因组中分布均匀[18]。SRAP标记具有简便、高效、重复性好、成本低等优点,被认为最有可能大规模应用于分子标记辅助育种的一种技术。唐源江等[28]应用SRAP标记技术对48个叶子花品种的遗传多样性及遗传关系进行了分析,将试验材料分为4个类群,认为SRAP标记可较好地反映叶子花种质间的遗传关系。张安世等[29]采用SRAP标记技术对18份皂荚种质资源的遗传多样性进行了分析,认为种质间的遗传多样性水平存在显著差异,具有丰富的遗传变异。
本研究利用SRAP标记对18份辣木品系进行分析,群体多态性条带百分率达62.50%,说明本试验筛选的引物可以有效地应用于辣木种质资源间遗传多样性分析。同样,基因多样性指数（H）、有效等位基因数（Ne）和Shannon信息指数（I）分别为0.2632、1.4777、0.3797,处于较高水平,说明供试材料间在分子水平上存在较为丰富的遗传多样性。本研究对常见种植的多油辣木和狭瓣辣木2个种共18份材料进行了分类。从聚类结果的整体来看,与传统的分类基本类似。不同种的辣木具有较远的亲缘关系,参试材料狭瓣辣木单独为一类,与其他17份属于多油辣木种的参试材料亲缘关系较远。聚类结果还显示,18份辣木种质资源的类型划分与其地域来源有一定的关联性,来源于非洲、印度、中国的辣木自成一类群。本研究同时发现,同一品系内出现嫩梢不同颜色、果荚变长和小叶片增大等形态学变异并不能与分子标记结果相对应。如多油辣木中S9和S10亲缘关系较近,均来源于印度,嫩叶分别表现为红色和绿色;S17和S18亲缘关系较近,均来源于海南,嫩叶分别表现为绿色和红色,未按性状特征聚类。‘PKM2’品系中表现出同样的现象。说明这些形态学变异可能是由于环境变化或体内营养成分不同引起。研究结果表明,来源于缅甸、泰国和中国台湾的3个未知品系与改良种‘PKM’系列具有较近的亲缘关系,这与笔者之前利用RAPD和ISSR分子标记分析的结果类似[26],这3个国家或地区在地理位置上靠近印度,其种源很可能来自印度。研究结果表明SRAP分子标记适用于辣木种质资源遗传多样性分析,研究结果为辣木种质资源杂交育种亲本选择提供了理论依据。