百香果又称鸡蛋果、西番莲、热情果,属西番莲科西番莲属[1],其原产于巴西,适应性强,经济价值高,在我国广西、台湾、福建、海南、贵州、云南等地均有种植[2]。百香果的果汁味道鲜美、芳香怡人,具有极高的营养、保健和商品价值,享有“果汁之王”的美誉[3,4,5],除此之外,其种子、皮、根、茎、叶等部位的提取物具有抗氧化、抗炎、抗癌和降血压等功效[6,7,8]。目前,我国主要栽培品种有紫果、黄果和二者的杂交种[9],贵州因气候和海拔的影响多种植紫果,现已列入脱贫致富主要产业[10]。随着百香果种植面积的不断扩大,加之管理不当、技术欠缺等,百香果面临病毒病、炭疽病、茎基腐病和蚜虫等病虫害危害,严重影响百香果产业的健康发展[11]。
笔者于2018年调查发现贵州贞丰县百香果受炭疽病危害严重,果实发病后呈向内凹陷的褐色至黑褐色不规则或近圆形病斑,通过形态观察结合多基因序列分析明确其致病菌为喀斯特炭疽菌（Colletotrichum karstii）,是一种引起百香果炭疽病的新致病菌[12]。国内外对百香果炭疽病的研究主要集中于病原菌的鉴定,Bravo等[13]在1993年发现危害哥伦比亚百香果果实的炭疽病致病菌为Glomerella cingulata,2000年Wolcan等[14]明确发生于阿根廷百香果上的炭疽病同样是由G. cingulata所引起,2002年Peres等[15]发现侵染巴西百香果的炭疽病菌为C. gloeosporioides,2010年Tarnowski等[16]确定危害佛罗里达紫果和黄果的炭疽病菌有C. boninense、C. capsici和Glomerella sp.,2017年Du等[17]对福建百香果炭疽病进行了研究,明确其致病菌为C. brevisporum。但针对百香果炭疽病菌的生物学特性及药剂筛选方面的研究较少,仅谢美华等[18]对云南紫果西番莲叶片上的炭疽菌属进行了部分生物学特性测定及室内毒力试验,发现炭疽菌属最适生长温度为15~20 ℃,最适pH为8~9,最适培养基为PDA,最佳利用碳源为葡萄糖、氮源为硝酸钠,并发现福美双具有较好的抑菌效果。目前国内外对C. karstii的生物学特性及室内毒力研究还处于空白。而长期以来,化学防治一直作为有效控制植物病害的重要手段,甚至在病害大发生时期为唯一有效的防治措施[19]。为此,本研究采用菌丝生长速率法探明百香果喀斯特炭疽菌的生物学特性,同时测定9种常用化学杀菌剂对该病菌的室内毒力,以明确病菌生长习性并筛选出高效低毒化学杀菌剂,旨在为百香果炭疽病有效防治及高产、高品质提供一定的技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
供试菌种：喀斯特炭疽菌（Colletotrichum karstii）,经贵州大学作物保护研究所分离鉴定为一种百香果炭疽病菌,并保存于实验室。
供试药剂：见表1。
表1 供试药剂及处理浓度Tab. 1 Test fungicides and treatment concentrations |
| 编号 No. | 药剂名称 Fungicide | 生产厂家 Manufacturers | 处理浓度Concentration/(mg·L-1) | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| T1 | T2 | T3 | T4 | T5 | |||
| 1 | 17%苯甲·氟酰胺SC | 巴斯夫欧洲公司 | 1.06 | 2.13 | 4.25 | 8.50 | 17.00 |
| 2 | 75%肟菌·戊唑醇WG | 德国拜耳作物科学公司 | 0.0054 | 0.022 | 0.087 | 0.35 | 1.39 |
| 3 | 35%氟菌·戊唑醇SC | 德国拜耳作物科学公司 | 0.43 | 1.30 | 3.89 | 11.67 | 35.00 |
| 4 | 10%苯醚甲环唑WG | 先正达南通作物保护有限公司 | 0.12 | 0.37 | 1.11 | 3.33 | 10.00 |
| 5 | 18.7%丙环·醚菌酯SC | 先正达南通作物保护有限公司 | 0.08 | 0.23 | 0.69 | 2.08 | 6.23 |
| 6 | 42.4%唑醚·氟酰胺SC | 巴斯夫欧洲公司 | 0.06 | 0.17 | 0.52 | 1.57 | 4.17 |
| 7 | 25%丙环唑EC | 河南世诚生物科技有限公司 | 3.09 | 9.26 | 27.78 | 83.33 | 250.00 |
| 8 | 50%咪鲜胺锰盐WP | 江苏辉丰生物农业股份有限公司 | 0.15 | 0.46 | 1.39 | 4.17 | 12.50 |
| 9 | 25%吡唑醚菌酯SC | 山东康乔生物科技有限公司 | 0.08 | 0.23 | 0.69 | 2.08 | 6.25 |
1.2 方法
1.2.1 病原菌生物学特性测定 （1）温度对病原菌菌丝生长的影响。取0.5 cm适龄菌饼转接于PDA培养基中央,分别置于10、15、20、25、30、35、40 ℃下暗培养,培养6 d后采用十字交叉法测量菌落直径[23]。每处理4个皿,重复3次。
（2）pH对病原菌菌丝生长的影响。将菌丝块分别接种于利用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH调节pH为4、5、6、7、8、9、10、11的PDA培养基上,于25 ℃恒温培养箱中暗培养[24]。处理及观察方法同1.2.1-（1）。
（3）光照对病原菌菌丝生长的影响。将含菌PDA平板分别置于全黑暗、全光照和黑暗光照交替（12 h/12 h）3种不同光照条件下,25 ℃恒温培养[25]。处理及观察方法同1.2.1-（1）。
（4）不同碳源、氮源对病原菌菌丝生长的影响。以Czapek培养基为基础培养基,将培养基中的蔗糖分别替换成等量的淀粉、麦芽糖、乳糖、葡萄糖和果糖,制成不同碳源的培养基,采取同样的方法将培养基中的硝酸钠替换成等量的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硫酸胺、氯化胺、尿素和甘氨酸,制成不同氮源的培养基,分别以缺碳和缺氮培养基为对照（CK）[26]。再将活化菌饼接于不同碳源、氮源培养基中央,25 ℃暗培养。处理及观察方法同1.2.1-（1）。
（5）培养基对病原菌菌丝生长的影响。将活化0.5 cm菌饼分别转接于Czapek、PDA、CMA、OA、NA、SDAY、WA和高氏1号培养基中,25 ℃暗培养。处理及观察方法同1.2.1-（1）。
1.3 数据处理
采用Excel 2010和DPS 7.05软件进行数据处理,并利用Duncan’s新复极差法进行单因素方差分析。
2 结果与分析
2.1 病原菌生物学特性
2.1.1 不同温度对病原菌菌丝生长的影响 病原菌在15~35 ℃下均能有效生长,生长趋势为先升高后下降,在25 ℃下菌丝生长最快,培养6 d菌落直径为54.10 mm。病原菌在低于15 ℃和高于35 ℃下生长缓慢,在温度为10 ℃和40 ℃时甚至停止生长（图1）。由此可知,该病原菌适宜生长温度为20~30 ℃,最适生长温度为25 ℃,不耐低温和高温。
2.1.2 不同pH对病原菌菌丝生长的影响 病原菌在8个不同pH环境下均能生长,菌落生长速度不同,整体呈先升高后下降的趋势。在pH为6~9范围内,病原菌生长趋于缓慢,菌丝较发达,培养6 d菌落直径为54.93~58.73 mm,极显著（P<0.01）高于其余酸碱环境,而在pH小于5和大于10的条件下不适宜菌丝生长,由此表明该病原菌喜中性或偏碱性环境（图2）。
图1 不同温度对病原菌菌丝生长的影响不同小写字母表示差异显著（P<0.05）,不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。 Fig. 1 Effects of different temperature on mycelial growth of C. karstii Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05), different uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01). |
图3 不同光照条件对病原菌菌丝生长的影响不同小写字母表示差异显著（P<0.05）,不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。 Fig. 3 Effects of different light condition on mycelial growth of C. karstii Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05), different uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01). |
2.1.4 不同碳源对病原菌菌丝生长的影响 病原菌在供试6种碳源中均能有效生长,且生长速度具有明显差异。在以蔗糖、葡萄糖和麦芽糖为碳源的培养基中菌落生长速率较快,极显著高于缺碳源的对照,可作为培养该病菌较好的碳源。其中又以蔗糖为碳源的培养基菌落生长最快,菌丝发达,培养6 d观察菌落直径为52.20 mm,为病原菌最佳供试碳源（图4）。
图4 不同碳源对病原菌菌丝生长的影响不同小写字母表示差异显著（P<0.05）,不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。 Fig. 4 Effects of different carbon source on mycelial growth of C. karstii Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05), different uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01). |
2.1.5 不同氮源对病原菌菌丝生长的影响 由图5可知,病原菌在以甘氨酸为氮源的培养基中菌丝生长最快,培养相同时间菌落平均直径为60.17 mm,极显著高于其他不同氮源培养基,菌丝茂密,为病原菌高效利用氮源。在以酵母膏、硝酸钠和蛋白胨为氮源的培养基中菌落生长较快,与不加任何氮源的对照无显著差异,菌丝较为发达。而以尿素、牛肉膏、硫酸铵及氯化铵为氮源的培养基中菌丝生长缓慢,均极显著低于对照组,且菌丝极为稀薄,不适宜病原菌生长。
图5 不同氮源对病原菌菌丝生长的影响不同小写字母表示差异显著（P<0.05）,不同大写字母表示差异极显著（P<0.01）。 Fig. 5 Effects of different nitrogen source on mycelial growth of C. karstii Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05), different uppercase letters indicate extremely significant difference (P<0.01). |
2.1.6 不同培养基对病原菌菌丝生长的影响 病原菌在8种不同培养基中生长情况明显不同（图6）,在SDAY培养基中生长速率最快,菌丝紧密、发达,培养6 d菌落直径达62.23 mm,显著高于其余处理,为病原菌最适生长培养基。其次为OA培养基、高氏1号培养基和Czapek培养基,相互之间无显著差异,菌落直径分别为55.53、55.33、54.03 mm。病菌在CMA培养基和WA培养基上生长最为缓慢,菌丝极为稀疏,不适宜病原菌培养。
2.2 不同杀菌剂对病原菌的室内毒力测定
不同杀菌剂对百香果炭疽病菌菌丝生长的影响存在差异（表2）。其中,以75%肟菌·戊唑醇WG的毒力最强,EC50为0.0667 mg/L。18.7%丙环·嘧菌酯SE、42.4%唑醚·氟酰胺SC、25%吡唑醚菌酯SC和50%咪鲜胺锰盐WP对百香果炭疽病菌也有较好的抑菌活性,EC50分别为0.3335、0.4567、0.4630、0.8187 mg/L。35%氟菌·戊唑醇SC、10%苯醚甲环唑WG和17%苯甲·氟酰胺SC对百香果炭疽病菌的抑制效果相对较差,EC50均大于1.0 mg/L。在供试的9种杀菌剂中,25%丙环唑EC对该病菌的毒力效果最差,其EC50值高达为67.5018 mg/L。
表2 9种杀菌剂对百香果炭疽病菌的室内毒力测定结果Tab. 2 Indoor toxicity test results of 9 fungicides to C. karstii on passion fruit |
| 药剂名称 Fungicide | 毒力回归方程 Regression equation of toxicity | EC50 /(mg·L-1) | 相关系数r Correlation coefficient r |
|---|---|---|---|
| 75%肟菌·戊唑醇WG | y=5.6235+0.5302x | 0.0667 | 0.9922 |
| 18.7%丙环·嘧菌酯SE | y=5.5222+1.0949x | 0.3335 | 0.9941 |
| 42.4%唑醚·氟酰胺SC | y=5.3781+1.1109x | 0.4567 | 0.9925 |
| 25%吡唑醚菌酯SC | y=5.3522+1.0534x | 0.4630 | 0.9843 |
| 50%咪鲜胺锰盐WP | y=5.0861+0.9908x | 0.8187 | 0.9989 |
| 35%氟菌·戊唑醇SC | y=4.9716+0.7840x | 1.0870 | 0.9817 |
| 10%苯醚甲环唑WG | y=4.7522+0.8257x | 1.9960 | 0.9980 |
| 17%苯甲·氟酰胺SC | y=4.6025+0.9734x | 2.5607 | 0.9990 |
| 25%丙环唑EC | y=3.0814+1.0488x | 67.5018 | 0.9817 |
3 讨论
病原菌的生物学特性是监控病害发生的前提条件[28,29]。目前关于C. karstii的生物学特性研究国内外尚未见报道。本研究结果表明,C. karstii适宜在20~30 ℃下生长,最适生长温度为25 ℃,这与余贤美等[28]报道的同种属的柿树炭疽病菌（C. horri）结果一致;病原菌对供试的6种碳源和8种氮源均能有效利用,最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为甘氨酸,该病菌对碳源蔗糖的高效利用与刘倩丽等[30]对檀香炭疽病菌（C. fructicola）的研究结果相吻合;病原菌对酸碱环境适应性较广,在pH为4~11范围内均能生长,最适生长pH为6~9,喜中性或偏碱性环境,此结果与谢美华等[18]报道的紫果西番莲炭疽病菌（Colletotrichum sp.）适宜生长pH范围基本一致;该病原菌对光照要求并不严格,在全黑暗、黑暗光照交替和全光照3种不同培养条件下生长速率无显著差异,与赵杰等[31]对无花果炭疽病菌（C. gloeosporioides）的研究结果相符;病原菌可在PDA、Czapek、SDAY等多种培养基上生长,在SDAY培养基上生长最好,菌丝发达,该结果与前人[18, 32]相关研究结果不同,这可能与种间差异或不同寄主植物等因素有关。
化学药剂防治是植物炭疽病有效防控的重要手段,对于该病害的防治研究已有相关报道,杨成德等[33]研究发现,75%肟菌·戊唑醇WG和50%咪鲜胺锰盐WP对马铃薯炭疽病菌的防治效果较好,EC50分别为5.00 μg/mL和6.50 μg/mL;王妮等[34]研究表明,25%咪鲜胺EC和30%吡唑醚菌酯SC对辣椒炭疽病菌的抑制作用最强,EC50值分别为0.25 mg/L和0.72 mg/L;肖敏等[35]对节瓜炭疽病菌进行室内毒力测定发现,50%咪鲜胺锰盐WP和250 g/L嘧菌酯SC的毒力较好,EC50分别为0.0009、0.0127 μg/mL;谢美华等[18]研究表明,福美双对紫果西番莲炭疽菌具有较强的抑制效果。本研究采用菌丝生长速率法测定9种常用化学药剂对百香果喀斯特炭疽菌的室内毒力,结果显示75%肟菌·戊唑醇WG、42.4%唑醚·氟酰胺SC、18.7%丙环·嘧菌酯SE、25%吡唑醚菌酯SC和50%咪鲜胺锰盐WP室内毒力较强,其EC50值均小于1 mg/L,分别为0.0667、0.3335、0.4567、0.4630、0.8187 mg/L,可作为田间防治百香果炭疽病的首选杀菌剂。