椰心叶甲（Brontispa longissima Gestro）属鞘翅目铁甲科昆虫,2002年传入中国后,迅速爆发成灾,成为危害我国棕榈科植物的主要外来入侵害虫之一。椰子是海南的主要经济作物之一,椰心叶甲的成虫和幼虫主要取食危害椰子的心叶部分。受害心叶伸展后变为枯黄状,呈火烧状,受害严重时会导致植株死亡[1]。椰心叶甲入侵我国南方,爆发后对当地经济和生态环境产生了严重的影响。昆虫体内存在着许多微生物,而在其肠道中更是有许多与昆虫生长发育息息相关的共生菌。昆虫肠道系统受环境影响具有多样性,该多样性在一定程度上与昆虫种类、食性、杀虫剂抗性机制、宿主的生理功能密切相关[2,3]。随着社会高速发展,近年来,对环境保护高度重视,这促进了对昆虫肠道微生物的研究,同时测序技术、组学技术等分子检测手段不断发展,使得对于昆虫肠道微生态和肠道微生物的研究有了更完善的鉴定手段[4,5],这也使有关昆虫肠道共生菌和寄主昆虫的互作越来越成为国内外关注的热点之一。昆虫和其肠道微生物处在一个共生的关系中,大多数共生菌对于昆虫的生长发育、食物消化、免疫等方面具有一定的影响。而肠道作为昆虫消化系统的重要组成部分,其中的共生菌对于昆虫食性的选择、对食物的降解代谢起到重要的作用[6]。大部分植食性昆虫的肠道微生物可以参与昆虫取食时对细胞壁的降解。纤维素和半纤维素是植物细胞壁的重要组成部分,棕榈植物纤维含量高[7]。但大部分昆虫缺乏降解纤维素的酶,从而影响消化。在对昆虫肠道微生物的研究中发现象白蚁属（Nasutitermes）肠道共生菌能够降解木质纤维素[8]。果胶是植物细胞壁另一组成,而在意大利蜜蜂（Apis mellifera）肠道中也发现了能降解果胶的共生菌[9],这也说明了昆虫肠道共生菌可能在某种程度上影响了昆虫对于寄主的选择。目前针对昆虫肠道共生菌的研究已经越来越多,但有关椰心叶甲肠道共生菌却尚无涉猎,想要了解这些共生菌在肠道中的多样性及其和椰心叶甲之间的互作,需采用传统分离纯培养的方法进行初步的分析验证。本研究的重点是以传统分离培养和现代分子生物学方法相结合的方式,得到并鉴定出可培养肠道微生物的种类,开展其后续功能性分析[10]。
1 材料与方法
1.1 椰心叶甲的饲养
椰心叶甲以椰子叶片作为饲料,在温湿度分别为(25±2)℃、RH=75%±10%条件下大量饲养备用。
1.2 椰心叶甲肠道内含物的提取
取健康6龄幼虫50头,先用无菌水,再用75%酒精擦拭清洁幼虫体表,并用75%酒精浸泡3 min做体表消毒。无菌条件下解剖虫体,取其肠道,并放入无菌生理盐水中漂洗3次,再加入1 mL无菌水匀浆,备用。实验前使其饥饿24 h,排空体内食物残渣。
1.3 椰心叶甲和椰子织蛾肠道微生物的分离纯化
细菌：将上述提取的内含物按10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12梯度稀释,各取0.1 mL涂液,同时取0.1 mL无菌水作为对照组。采用LB培养基,涂布后将平板置于30 ℃培养箱中培养72 h,每24 h观察1次。用接种环或解剖针,按菌落的大小、颜色和形态挑选不同的单菌落在新的LB平板上划线培养,每个菌落在平板上至少纯化5次,得到单克隆菌株,纯化得到的菌株接种至斜面培养基置于4 ℃冰箱保存。
真菌：将上述提取的内含物制成稀释液,并以无菌水为对照,采用PDA平板,涂板后置于27 ℃培养箱中培养72 h,每24 h观察1次。用接种环或解剖针,按菌落的大小、颜色和形态,分离纯化单菌落并分别接种于相应的PDA斜面培养基进行富集培养备用,为后面提取DNA作准备。
1.4 椰心叶甲分离细菌16S rRNA和真菌ITS的扩增
将分离纯化得到的细菌和真菌送至青岛派森诺基因生物技术有限公司进行PCR扩增及DNA测序。
1.5 椰心叶甲肠道微生物的菌种测定
通过NCBI Blast程序将检测后的序列文件与NCBI数据库中的数据进行比对,得到与待测物种序列相似度最大的物种信息,即为鉴定结果。选取单克隆菌株的近缘序列,利用MEGA 7.0软件以邻位相连算法构建系统进化树[11]。
1.6 椰心叶甲肠道分离微生物对纤维素、果胶及木聚糖的降解功能分析
将上述纯化得到的菌株分别接种到CPS1（纤维素筛选平板）、PPS1（果胶素筛选平板）、XPS1（木聚糖筛选平板）上。各平板置于恒温箱培养,30 ℃,培养72 h,为后续进行产酶鉴定作准备。将能在上述CPS1、PPS1、XPS1平板上生长的菌株分别点至CPS2（纤维素酶鉴定平板）、PPS2（果胶酶鉴定平板）、XPS2（木聚糖酶鉴定平板）上。将各平板置于恒温箱培养,30 ℃,培养7 d,分别使用刚果红、溴酚蓝、卢戈式碘液进行染色,采用透明圈法,对3种酶的产生菌进行鉴定。
2 结果与分析
2.1 椰心叶甲肠道共生菌的分离纯化与克隆
将椰心叶甲的肠道内容物的稀释液涂布在LB和PDA培养基上,获得肠道原始菌株。分别从上述培养基中挑选形态、大小、颜色不一的菌落进行分离纯化,共得到24个细菌菌落,7个真菌菌落（依次编号A1-A31）。提取上述菌落的基因组DNA,以提取的细菌和真菌基因组DNA为模板扩增16S rDNA并进行测序,用NCBI Blast程序将检测后的序列文件与NCBI 16S数据库中的数据进行比对。结果显示,除模板不纯,可以得到细菌22株,真菌2株。分离后的细菌可能有粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）、伯克氏菌属（Burkholderia）、蜡样芽胞杆菌（Bacillu scereus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、带化红球菌（Rhodococcus fascians）、微杆菌（Microbacterium foliorum）。真菌有枝孢属（Gladaxporism）、曲霉属（Aspergillus）（表1）。
表1 椰心叶甲肠道微生物16S rRNA序列比对结果Tab. 1 Blast-based identification of the 16S rRNA from the gut bacteria of B. longissimi Gestro |
| 菌株编号 Strains No. | NCBI物种相似度比对结果 NCBI species similarity comparison results/% | 菌种名 Strains name |
|---|---|---|
| A1、A2、A3、A4、A6、A7、A8、A10、A21、A23 | 99 | 粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens） |
| A5、A11、A22 | 99 | 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） |
| A13、A19、A24 | 99 | 伯克氏菌属（Burkholderia） |
| A9、A14 | 99 | 微杆菌（Microbacterium foliorum） |
| A15、A16、A17 | 99 | 芽孢杆菌（Bacillus） |
| A12 | 99 | 带化红球菌（Rhodococcus fascians） |
| A27 | 99 | 枝孢属（Gladaxporism） |
| A28 | 99 | 曲霉属（Aspergillus） |
2.2 椰心叶甲可分离肠道细菌的构成分析
因部分菌株属于同一菌种,所以选择其中序列较完整的个别单克隆菌株（分别命名为SQD1906A1、SQD1906A9、SQD1906A5、SQD1906A12、SQD1906A13、SQD1906A17）的16S rDNA序列进行系统发育分析（图1）。结果表明,从椰心叶甲肠道分离的可培养细菌主要由变形菌 门（Proteobacteria）、厚壁 菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）组成。其中肠杆菌（Enterobacteraceae）和伯克氏菌（Burkholderia）属于变形菌门γ-变形菌纲的分枝,其中伯克氏菌属于伯克氏菌科,原属于假单胞菌科,沙雷氏菌属于肠杆菌目的肠杆菌科;芽孢杆菌（Bacillus）属于厚壁菌门的分枝,且属于芽孢杆菌纲,其中蜡样芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌属于芽孢杆菌目的芽孢杆菌科;微杆菌（Microbacterium）和红球菌（Rhodococcus）属于放线菌门的分枝,属于放线菌目的微球菌科。
2.3 椰心叶甲肠道共生菌的功能鉴定
3 讨论
昆虫体内通常存在着许多微生物,是昆虫生长发育不可或缺的一部分。这些微生物或轻或重地影响着昆虫的取食消化、生长发育或免疫能力。不同昆虫肠道内微生物的种类、数量、分布及功能等均不同[12]。目前发现变形菌门是存在于昆虫肠道中共生菌最大的一个门类,其中在很多昆虫肠道中均有发现肠杆菌、柠檬酸杆菌、粘质沙雷氏菌、假单胞菌和伯克氏菌等[13]。厚壁菌门和拟杆菌也在许多昆虫体内通过分离得到。这些微生物和昆虫处在一个共生的关系中,对昆虫的生长发育起到不可忽略的作用,如对昆虫免疫系统、抗药性、寿命等方面的互作关系。利用甲维盐喂食斜纹夜蛾（Spodoptera litura）发现其肠道菌群结构发生变化,从而可以起到防治作用[14]。同时肠道作为昆虫消化器官,其中大部分共生菌都对昆虫的营养代谢有一定的影响,包括对纤维素的降解、必要氨基酸的合成等方面。在木食性的松墨天牛（Monnochamus alternatus Hope）的肠道中,通过选择培养实验得到了多种具有木质纤维素降解能力的菌种[15]。
本研究通过利用传统微生物分离纯培养的方法,从椰心叶甲肠道中共分离出22株细菌和2株真菌。其中细菌分别属于变形菌门（13株）、厚壁菌门（6株）和放线菌门（3株）,变形菌门为优势菌群。真菌属于半知菌门（1株）和子囊菌门（1株）。其中芽孢杆菌具有降解纤维素和木聚糖的能力,带化红球菌具有降解木聚糖的能力。蒋宇[15]在对华美奥锹甲（Odontolabis fallaciosa）的肠道微生物多样性研究中发现厚壁菌门和变形菌门是丰度最高的,在家蚕（Bombyx mori）的研究中也发现同样的结果[16],而在本研究中,可培养的优势菌群也属于变形菌门,该结果与目前研究发现的大多数昆虫肠道优势菌相同。昆虫肠道内的微生物对植物细胞壁的降解和营养的供给起到重要的作用,而纤维素、果胶和木聚糖是植物细胞壁的主要组成部分[17]。孙博通等[18]在斜纹夜蛾（Spodoptera litura）的肠道中发现能够降解纤维素的肠杆菌,而在本研究中发现芽孢杆菌可能也具有对纤维素的降解能力,同时该芽孢杆菌也能够降解木聚糖,可能对椰心叶甲的营养吸收具有一定的影响。此外,在研究中还发现对木聚糖有降解能力的带化红球菌,并未发现对果胶具有降解能力的菌株。而夏晓峰等[19]在对小菜蛾（Plutellaxy lostella）中肠微生物的研究中发现,小菜蛾中肠细菌对纤维素和果胶的降解能力较强,对木聚糖的降解能力较弱,与椰心叶甲不同。推测是因为不同昆虫对降解物质的需求有差异而造成的[20]。棕榈科植物是椰心叶甲的主要寄生对象,而大部分棕榈科植物的叶片纤维素含量较高。椰心叶甲肠道共生菌具有降解纤维素和木聚糖的能力,且有相对优势,对于其选择棕榈植物为寄主可能有一定的影响,这类肠道共生菌的存在为椰心叶甲入侵海南危害棕榈植物提供了生理条件。对于昆虫体内微生物的研究主要集中于2种方式,一是通过传统分离培养法,但是由于培养环境或技术的限制,往往具有局限性;另一种是通过现代分子生物学的方法,基于对核酸序列的分析,鉴定和认识生态环境中还未了解的微生物种群[20]。椰心叶甲幼虫体型较小,在抽取肠道的过程中,不能保证完整地获得其肠道。且由于采用的是传统分离培养法,可能会存在因为培养条件和培养方法无法满足菌株的自然生态条件而出现不确定性,同时肠道中存有许多厌氧菌种,不能通过传统方法分离培养,所以获得的结果可能具有局限性,接下来可以通过测序技术来进行鉴定。本研究只是初步验证了分离菌株的功能,但并未对这些菌株的酶活力进行进一步测定,还需后续进一步研究分析。椰心叶甲肠道中的菌种丰富,除了已验证的功能外,还可以发现更多其他功能。
昆虫肠道是一个存在于昆虫体内的小型生态系统,肠道微生物与寄主大多处在一个共生环境中。椰心叶甲的幼虫和成虫主要取食椰子心叶,却极少取食叶片其他部分,可能与椰心叶甲肠道内微生物的组成有很大联系。研究结果显示椰心叶甲中肠微生物在一定程度上帮助其更好地取食消化,提高了椰心叶甲寄生的寄主适应度[21]。对于昆虫肠道微生物的研究已经有越来越多的学者介入,本研究为未来更深入地了解椰心叶甲提供了参考,可以进一步发现通过微生物对椰心叶甲进行生物防治的方法。