同源异型盒基因（homeobox genes）广泛存在于真核生物中,编码一类含有保守同源异型盒结构域（homeodomain,HD）的转录因子,在生物个体形态建成、生殖发育、细胞命运、非生物胁迫等生命活动中发挥着重要的调控作用[1,2,3,4,5,6]。KNOX亚家族几乎存在于所有植物中,其编码蛋白N端至C端依次存在MEINOX、GSE、ELK、HD 4个保守结构域,MEINOX（包含KNOX1和KNOX2结构域）和ELK结构域与蛋白质间的相互作用有关,核定位信号位于ELK结构域,GSE结构域涉及泛素降解途径调节蛋白的稳定性,HD位于蛋白的C端[7]。由于在植物中的表达模式和基因中内含子位置存在差异,KNOX亚家族被进一步分为ClassⅠ和ClassⅡ 2大亚家族[8]。ClassⅠ类亚家族主要在分生组织中表达,是分生组织发生与维持所必需的关键转录基因,参与侧生器官的形态建成[9,10]、调控激素[11,12]和木质素合成[13,14];ClassⅡ类亚家族在所有植物组织均有表达,目前发现调控植物次生细胞壁形成和纤维的发育[15,16,17]。
现有研究发现KNOX成员可通过蛋白质相互作用,形成复合物调控植物细胞壁的形成、木质素的合成、细胞壁的扩张和加固[18,19,20,21]。Abraham- Juárez等[22]首次报道了剑麻中2个Ⅰ类KNOX基因。接着Zhou等[23]研究发现一个Ⅰ类KNOX基因在茎尖分生组织和幼龄的叶片中高表达。Gross等[24]的研究结果则表明剑麻Ⅰ类KNOX基因在叶片基部表达,在叶片中上部不表达。剑麻KNOX2调控珠芽的发育,在珠芽发育的起始阶段,剑麻KNOX2随着珠芽的增大,表达量逐渐增加;在拟南芥中过表达剑麻KNOX2,导致叶出现裂片的表型;进一步发现剑麻KNOX2能够回补拟南芥knat1突变表型[22]。植物KNOX基因参与叶片的形态建成和纤维的发育,初步推测剑麻KNOX2基因参与调控剑麻叶片和纤维的发育。因此,本课题组克隆了国内主栽品种H.11648（Agave hybrid No.11648）的AhKNOX2基因,构建剑麻叶片酵母双杂交cDNA表达文库,筛选与AhKNOX2相互作用的蛋白,从蛋白质相互作用的角度研究AhKNOX2基因在剑麻叶片中的功能和调控网络,结果为培育高纤维产量的剑麻新品种提供基因资源和理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
剑麻H.11648采自中国热带农业科学院南亚热带作物研究所剑麻种质保存圃;RNA提取试剂盒购自北京华越洋生物科技有限公司;反转录试剂盒、Hi-Fusion试剂盒、Nde I和BamH I购自江苏愚公生命科技有限公司;双链cDNA纯化、酵母转化和文库构建试剂盒购自Clontech公司;用于配制酵母培养基的试剂和其他试剂购自Sigma- Aldrich公司。
1.2 方法
1.2.1 总RNA的提取 采集H.11648品种5龄植株叶样品,液氮速冻。将样品研磨成粉,按照华越洋多糖多酚RNA提取试剂盒操作,取50~100 mg样品提取其总RNA。
1.2.2 RNA的反转录 反转录按照愚公生物M- MLV GIII First-Strand Synthesis Kit操作。反应体系中加入1.0 μL CDS Ⅲ和1.0 μL SMART Ⅲ引物,以提取的总RNA为模板,反转录获得带同源重组接头的单链cDNA。反转录程序为：55 ℃30 min;85 ℃ 1 min。CDS Ⅲ和1.0 μL SMART Ⅲ引物序列见表1。
表1 实验所用PCR引物Tab. 1 PCR primers used in the experiment |
| 名称 Name | 用途 Usage | 引物序列（5°-3°） Sequence of primer (5°-3°) | 酶切位点 Restriction site |
|---|---|---|---|
| SMART III Oligo | For first-strand cDNA synthesis | AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG | |
| CDS III Primer | ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN | ||
| 5°PCR Primer | For double-strand cDNA amplification | TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG | |
| 3°PCR Primer | GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA | ||
| PGAD-5° | For sequencing of insert fragments | CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC | |
| PGAD-3° | GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGAT | ||
| BK-AhKNOX2-F | For constructing of bait vector | ACACATATGGAGGAGATGTACGGCCTG | Nde I |
| BK-AhKNOX2-R | TGTGGATCCGTCGTCGTCATAGAATGGTGC | BamH I |
1.2.3 双链cDNA的合成 以反转录的单链cDNA为模板,加入5° PCR引物和3° PCR引物（表1）,利用Advantage 2 Polymerase Mix合成双链cDNA。PCR扩增条件为：95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s,68 ℃ 6 min,68 ℃ 5 min,26个循环。
1.2.4 双链cDNA的纯化 预先将CHROMA SPINTM TE-400纯化柱中胶体和缓冲液混合均匀,瞬时离心弃液体。将93 μL双链cDNA加入纯化柱胶体,700´g离心5 min。向收集液中加入2.5倍体积无水乙醇和1/10体积的3 mol/L乙酸钠,置于-20 ℃沉淀DNA。用20 μL无菌水溶解沉淀物,并测定双链cDNA浓度。
1.2.5 文库构建 按照YeastmakerTM Yeast Transformation System 2操作制备酵母感受态细胞。取纯化的双链cDNA（2~5 μg）与3 μg线性化pGADT7-Rec质粒共转化Y187酵母菌,转化菌体用6 mL生理盐水悬浮,每个平板100 μL,将悬浮液涂布于不含亮氨酸的综合培养基（SD/-Leu）平板上,于30 ℃培养5 d。将培养平板于4 ℃放置 4 h,向平板加入5 mL液体酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基（YPDA）（含25%的甘油）,用涂布棒刮离酵母菌,收集菌体悬浮液。浓缩文库体积,血球板计数法计算细胞密度,使文库细胞密度大于2×107/mL。按每管1 mL,将浓缩液分装于1.5 mL无菌管中,保存于-80 ℃。
1.2.6 文库质量检测 取100 μL悬浮液用生理盐水逐步稀释10倍和100倍,取100 μL稀释液涂布SD/-Leu平板,30 ℃培养5 d。采用ImageJ软件统计生长菌落数。按照如下公式分别计算文库容量和转化效率：
$文库总容量(CFU)=\frac{SD/-Leu平板上菌落数(CFU)×悬浮体积(mL)}{涂板体积(mL)}×稀释倍数$
$转化效率(CFU/μg)=\frac{SD/-Leu平板上菌落数(CFU)×悬浮体积(mL)}{涂板体积(mL)×DNA量(μg)}$
挑取SD/-Leu平板上的菌落,利用pGADT7- Rec的载体引物PCR鉴定插入片段。PCR扩增条件为：95 ℃ 10 min;95 ℃ 45 s,58 ℃ 45 s,72 ℃ 3 min,55 个循环;72 ℃ 5 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测。按照如下公式计算重组率：
$重组率=\frac{阳性克隆数}{检测菌落数}×100\%$
取10 μL文库保存液悬浮于1 mL YPDA液体培养基中,混合均匀得稀释液A（稀释度10-2）。从稀释液A中吸取10 μL悬浮液加入1 mL YPDA液体培养基中,混合均匀得稀释液B（稀释度10-4）。分别从稀释液A和稀释液B中取10 μL和50 μL悬浮液涂布于SD/-Leu平板,30 ℃培养5 d。采用ImageJ软件统计生长菌落数。按照如下公式计算文库滴度：
$滴度=\frac{SD/-Leu平板上菌落数(CFU)}{涂板体积(mL)×稀释倍数}$
1.2.7 诱饵载体构建 设计携带Nde I和BamH I酶切位点的特异引物（表1）,扩增AhKNOX2编码框。将AhKNOX2编码框插入pGBKT7载体,构建诱饵载体。诱饵载体双酶切检测并送测序。
1.2.8 诱饵载体自激活检测及3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）抑制浓度筛选 将pGBKT7-AhKNOX2载体转化Y2HGold酵母菌株,转化液分别涂布于不含色氨酸的综合培养基（SD/-Trp）、SD/-Leu、不含色氨酸和腺嘌呤的综合培养基（SD/-Trp/-Ade）和不含色氨酸和组氨酸的综合培养基（SD/-Trp/-His）平板,30 ℃培养5 d,以检测诱饵载体是否具有自激活性。将携带有诱饵载体的Y2HGold酵母菌株涂布于含不同浓度的3-AT的SD/-Trp/-His平板,30 ℃培养5 d,以确定3-AT的抑制浓度。
1.2.9 互作蛋白筛选 使用50 mL SD/-Trp液体培养基扩大含诱饵载体的Y2HGold酵母菌株,收集菌体与1 mL文库菌体混合于50 mL 2×YPDA液体培养基中,30 ℃培养20~24 h。收集菌体,使用10 mL 0.5×YPDA液体培养基悬浮共培养的菌体,并涂布于含3-AT的SD/-Trp/-Leu/-His平板,30 ℃培养5 d。筛选平板长出的菌落进行挑取,转接3次到SD/-Trp/-Leu/-His平板上。挑取剩下活的菌落,接种于SD/-Trp/-Leu液体培养基中,30 ℃、250 r/min培养20~24 h,收集菌体提取酵母质粒。质粒转化DH5α大肠杆菌并提取质粒送测序。
1.2.10 阳性克隆cDNA的注释 采用本地Blast的方式,将测序获得的阳性克隆cDNA序列与剑麻H.11648的转录组序列进行比对,根据转录组的注释信息,获得候选互作蛋白的功能等信息。
2 结果与分析
2.1 总RNA的提取
提取的剑麻总RNA经1%琼脂糖凝胶检测,结果显示28S和18S条带清晰,RNA未降解（图1A）;OD260/OD280比值为1.95,表明提取的总RNA纯度和质量较高,可用于后续实验。
图1 剑麻总RNA（A）及双链cDNA检测（B、C）图B中,21~26：PCR循环数;图C中,1：未纯化双链cDNA;2：纯化双链cDNA;M1：DL2000 DNA ladder;M2：DL5000 DNA Marker;M3：DL15 000 DNA ladder。 Fig. 1 Agarose gel electrophoresis analysis of total RNA (A) and double-strand cDNA (B,C) In figure B, 21-26: PCR cycles; In figure C, 1: Unpurified ds cDNA; 2: Purified ds cDNA; M1: DL2000 DNA ladder; M2: DL5000 DNA Marker; M3: DL15 000 DNA ladder. |
2.2 cDNA的合成及纯化
2.3 文库构建及质量检测
图2 文库质量检测A：转化效率检测,10-1和10-2倍文库稀释液在SD/-Leu平板上生长情况;B：滴度检测,10-2和10-4倍文库液稀释液在SD/-Leu平板上生长情况;C：插入片段PCR检测,1~24：菌落编号;M：DL2000 DNA ladder。 Fig. 2 Quality detection of library A: Transformation efficiency detection of library. Number of independent yeast colonies of 10-1-fold and 10-2-fold dilution on SD/-Leu; B: Titer detection of library. Number of independent yeast colonies of 10-2-fold and 10-4-fold dilution on SD/-Leu; C: Insert fragments detection of library by PCR. 1-24: Number of independent yeast colonies; M: DL2000 DNA ladder. |
2.4 诱饵载体构建
pGBKT7-AhKNOX2载体经Nde I和BamH I内切酶双酶切出现900 bp左右条带（图3A）,测序结果表明,插入片段即为AhKNOX2的编码框,双酶切和测序结果说明诱饵载体构建成功。
2.5 自激活检测
阳性对照可在4个培养基上生长（p53蛋白和T-antigen相互作用）。阴性对照仅在SD/-Trp和SD/-Leu培养基上生长（Lam和T-antigen不相互作用）。空载体对照（pGBKT7）仅能在SD/-Trp培养基上生长。含有pGBKT7-AhKNOX2载体的Y2HGold酵母可在SD/-Trp培养基生长,在SD/-Leu和SD/-Trp/-Ade培养基上不生长,但在SD/-Trp/- His培养基上生长了少量的菌落（图3B）,结果表明,诱饵载体没有激活报告基因ADE2的表达,但激活了报告基因HIS3的表达,存在自激活性。
2.6 3-AT抑制浓度筛选
由于KNOX2存在自激活性,能激活His的表达,使Y2HGold酵母能在缺His（组氨基酸）的培养基生长,因此,采用在培养基中加入3-AT来抑制自激活。含有pGBKT7-AhKNOX2载体的Y2HGold酵母能在不含3-AT的SD/-Trp/-His培养基上生长,而在加了5 mmol/L及更高浓度3-AT的SD/-Trp/-His培养基上不能生长（图4）。由此可知,5 mmol/L的3-AT就能抑制诱饵载体的自激活性。
2.7 互作蛋白筛选
经SD/-Trp/-Leu/-His/+5 mmol/L 3-AT培养基的筛选,获得16个与AhKNOX2相互作用的阳性克隆,将阳性克隆cDNA测序序列与剑麻转录组数据比对,获得与AhKNOX2相互作用蛋白的cDNA注释信息（表2）。根据候选蛋白的功能,可分为蛋白/DNA结合蛋白、蛋白/RNA结合蛋白、核苷酸结合蛋白、蛋白质代谢、蛋白质加工、碳水化合物代谢、光形态建成和未知蛋白8大类。
表2 与AhKNOX2相互作用蛋白Tab. 2 List of proteins interacted with AhKNOX2 |
| 编号 ID | 蛋白名称 Homologous protein | cDNA长度 cDNA length/bp | Score值 Score value | E-值 E-value | 功能 Function |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | MADS-box protein JOINTLESS | 1147 | 1229 | 0 | 蛋白/DNA结合蛋白 |
| 2 | Transcription factor VOZ1-like | 1204 | 1965 | 0 | 蛋白/DNA结合蛋白 |
| 3 | Transcription factor bHLH36-like isoform | 850 | 1431 | 0 | 蛋白/DNA结合蛋白 |
| 4 | TBP1 TATA-box-binding protein | 1497 | 1932 | 0 | 蛋白/DNA结合蛋白 |
| 5 | KH domain-containing protein | 937 | 1544 | 0 | 蛋白/RNA结合蛋白 |
| 6 | Extra-large guanine nucleotide-binding protein 3 isoform | 723 | 744 | 0 | 核苷酸结合蛋白 |
| 7 | RING-H2 finger protein | 1841 | 3180 | 0 | 蛋白质代谢 |
| 8 | DnaJ protein homolog | 996 | 895 | 0 | 蛋白质加工 |
| 9 | Beta-hexosaminidase 1 | 1521 | 2610 | 0 | 碳水化合物代谢 |
| 10 | Phosphoenolpyruvate carboxylase 2 | 693 | 1045 | 0 | 碳水化合物代谢 |
| 11 | 2-oxoglutarate-dependent dioxygenase AOP2-like | 608 | 704 | 0 | 碳水化合物代谢 |
| 12 | ENO1 enolase | 1682 | 2830 | 0 | 碳水化合物代谢 |
| 13 | Ribulose-phosphate 3-epimerase | 888 | 1036 | 0 | 碳水化合物代谢 |
| 14 | SPA1-RELATED 2-like protein | 958 | 946 | 0 | 光形态建成 |
| 15 | Hypothetical protein AXF42 | 520 | 663 | 0 | 未知蛋白 |
| 16 | Uncharacterized protein At4g10930 | 744 | 1249 | 0 | 未知蛋白 |
3 讨论
酵母双杂交是目前能够高通量筛选相互作用蛋白的技术之一。但大多数转录因子具备转录激活功能,这就导致构建的诱饵载体往往存在自激活,因此抑制诱饵载体的自激活是降低假阳性的关键之一。本研究采用的是Clontech公司的Matchmaker™ Gold酵母双杂交系统,该系统采用3个异源的Gal4响应启动子元件（G1、G2和M1）控制HIS3、ADE2、MEL1/AUR1-C 4个报告基因的表达,目的是通过增加报告基因来降低筛选结果的假阳性。3-AT是HIS3蛋白的竞争性抑制剂,能够抑制组氨酸的合成[25,26]。如果在实验过程中发现诱饵载体存在自激活,可通过在筛选培养基中增加3-AT来抑制由诱饵蛋白激活表达的HIS3蛋白的活性,减少自激活背景[27]。本实验发现构建的pGBKT7-AhKNOX2存在自激活性,启动了HIS3报告基因的表达,向SD/-Trp/-His培养基中添加5 mmol/L的3-AT能抑制其自激活能力,因此将SD/-Trp/-Leu/-His/+5 mmol/L 3-AT培养基作为文库筛选培养基。
KNOX蛋白能形成同源或者异源二聚体,通过改变亚细胞定位实现调控作用。从KNOX蛋白的结构域功能看,MEINOX结构域对形成二聚体起重要作用,ELK结构域参与蛋白质之间的相互作用,而HD结构域参与DNA的结合和同源二聚体的形成[7],表明KNOX蛋白能形成同源或者异源二聚体,而蛋白质相互作用往往会改变复合体的亚细胞定位。研究发现,KNOX与BELL相互作用形成异源二聚体,进入细胞核,从细胞质移动到细胞核依赖于二者形成复合物[28]。拟南芥OFPs（Arabidopsis thaliana ovate family proteins）与KNAT1蛋白相结合,将KNAT1蛋白从细胞核中移动至细胞质中的微管上[29]。KNATM与KNOX的结合,阻止了KNOX进入细胞核[30]。本研究通过酵母双杂交筛选获得16个与AhKNOX2相互作用的候选蛋白,16个候选蛋白中没有同源异型盒基因家族蛋白,表明AhKNOX2与候选蛋白形成异源二聚体发挥作用。
KNOX可通过蛋白质相互作用参与调控植物发育的多个事件,目前发现与KNOX相互作用的蛋白主要是转录因子,如与SH5相互作用抑制木质素的合成,调控落果[20];与OFP和MYB转录因子相互作用,调控纤维细胞和次生细胞壁发育[16-17, 19];与NAC直接相互作用,抑制其下游基因CESAs等的表达,调控细胞壁加厚[21];与水稻生长调控因子GRF4互作,抑制其下游基因Expansin等的表达,调控细胞扩展[21];与KNOX同源蛋白间相互作用,调控开花[31,32]。本研究通过筛选,一共获得16个阳性克隆,其中3个为转录因子（MADS、VOZ、bHLH）,AhKNOX2与这些蛋白的相互作用在剑麻中的具体功能还有待深入研究。