油茶（Camellia oleifera Abel.）,属于山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia）的常绿小乔木或大灌木[1],是世界四大木本植物油源树种之一[2]。据统计,我国年产油茶籽油约26万t,占全国木本食用油料作物的80%以上[3]。油茶果实成熟后为椭圆形、桃形、卵圆形和橄榄形等,由油茶果壳（油茶蒲）和油茶籽（种子）两部分构成,其中油茶果壳占整个油茶果鲜重的60%以上[4]。油茶籽（种子）由种皮（31.84%）和种仁（68.16%）组成（图1）。种仁因其含有约13.70%~42.84%的粗脂肪而主要用于榨取油茶籽油[5],而种皮含油仅0.5%左右,纤维素、木质素含量较多,一般榨油时都要先剥去种皮[6]。因而,在制备油茶籽油的过程会产生油茶果壳和种皮等废弃物。目前,国内外关于油茶果废弃物利用的研究主要集中于果壳成分分析[7]以及一些功能性研究和化工产品的研发[8,9,10],而关于油茶籽种皮的研究则相对较少[11]。
对于纤维素、木质素含量高的原料常采用酸法或碱法处理,优点是操作简单,但是普遍存在的问题是污染重、能耗高、回收率低、易产生毒性物质以及半纤维素降解等[12]。亚临界水是在压力下加热至100 ℃（沸点,0.1 MPa）至374 ℃（水的临界点,22.4 MPa）之间温度的水,可以通过形成高温和高压水来改变纤维素和木质素[13],具有清洁无毒、反应速率快、转化率高的优势,是环境友好型新技术[14]。离子液体具有低蒸汽压、不易燃、热稳定性好等优点,可代替传统有机溶剂避免环境污染问题。近年来大量研究表明,离子液体（ILs）作为木质纤维素溶剂的研究已取得了重要进展[15]。鉴于此,本文通过对比分析酸法、碱法、亚临界水和离子液体4种预处理方法对油茶籽种皮成分、结构和抗氧化活性影响,以便为油茶籽种皮废弃物的综合利用提供理论基础和依据,实现变废为宝、减轻环境污染,并提高油茶籽壳深加工产品的附加值和油茶籽的综合利用率。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 油茶籽种皮,取自海南省琼海市,在55 ℃条件下经热风干燥后粉碎,过40目筛,备用。
浓硫酸、氢氧化钠,均为分析纯,广州化学试剂厂;[C4mim]Cl-AS（分析纯）,上海奉贤南桥研究开发公司;DPPH（优级纯）,Sigma试剂公司;ABTS（优级纯）,Sigma试剂公司;BHT（分析纯）,麦克林试剂公司;福林酚（分析纯）,麦克林试剂公司。
1.1.2 仪器与设备 300Y型多功能粉碎机,常州市金坛友联仪器研究所;SX-300全自动高压蒸汽灭菌器,日本三洋;EL204型电子天平,中国梅特勒-托利多仪器有限公司;754NPC型紫外可见分光光度计,上海奥谱勒仪器有限公司;亚临界水提取实验装置由实验室自行设计, 并由正规仪器厂定做而成;DHG-9070A电热鼓风干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司;Tensor 27傅里叶变换红外光谱仪,德国Bruker公司;AVANCE III 500核磁共振仪,德国Bruker公司;S-3000N扫描电子显微镜,日本Hitachi公司;Q600热重分析仪,美国TA仪器公司。
1.2 方法
1.2.1 预处理方法 （1）酸法预处理。称取3 g物料,加入30 mL的4%硫酸溶液中,置于灭菌锅中,调整反应温度为115 ℃,在此条件下反应2.25 h[16]。
（2）碱法预处理。称取3 g物料,加入66.6 mL的1.24%氢氧化钠溶液,置于灭菌锅中,调整反应温度为64 ℃,在此条件下反应26.5 h[17]。
（3）亚临界水预处理。称取1 g物料,加入35 mL水中,在144 ℃的提取温度下于水合反应器中反应43 min[18]。
（4）离子液体预处理。称取1 g物料和19 g离子液体（[C4mim]Cl-AS）于锥形瓶中,混匀,置于100 ℃恒温振荡水浴锅中反应1 h,反应结束后加入30 mL蒸馏水,冷却搅拌使纤维素析出,混合液于4000 r/min离心20 min,取沉淀物料,上清液用于回收离子液体。将沉淀物料重复上述步骤处理1次,处理后的物料,均经自来水洗涤干燥后,置于4 ℃冰箱备用[19]。
1.2.2 基本组分分析 参照田维亮等[20]的方法对样品中的纤维素、半纤维素及木质素含量进行测定。
1.2.3 结构表征 （1）扫描电子显微镜（SEM）分析。采用扫描电子显微镜,于20 kV电压下获取样品微观形貌图像。
（2）X-射线衍射（XRD）分析。样品扫描范围10°~70°,扫描步长0.02°,跃迁时间1 s,室温条件下加速电压40 kV,加速电流100 mA,获得不同处理条件下的X射线衍射图谱[21]。结晶指数（CrI）利用下面公式计算：
$\text{CrI}=\frac{I002-I\text{am}}{I002}\times 100%$
式中：CrI是相对结晶度,I002是002晶格衍射角的极大强度,Iam为非结晶散射强度。
（3）傅里叶变换红外光谱（FTIR）测定。准确称取样品与溴化钾混合研磨均匀并压成透明的锭片,在分辨率2 cm-1、扫描范围500~4000 cm-1的条件下进行扫描[22]。
（4）核磁共振氢谱（1H NMR）分析。参照刘祝兰[23]的方法进行。
（5）热重分析。采用热重分析法,样品量约为10 mg,空气气氛的条件下,气流速度20 mL/min,升温速率10 ℃/min,由30 ℃升温至800 ℃,检测样品的热稳定性[24]。
1.2.4 单宁、多酚含量测定与抗氧化活性分析 （1）提取液的制备。分别取4种样品适量,按1∶10（W/V）的比例加入70%乙醇溶液,冷浸24 h,过滤后得滤液,所得的滤渣再按1∶15（W/V）的比例加入70%乙醇溶液,冷浸12 h,过滤,将2次所得的滤液合并,即为乙醇提取液。
$多酚含量(\text{mg/mL})=\frac{CVn}{W}$
式中：C为多酚浓度,mg/mL;V为多酚提取定容体积,mL;n为稀释倍数;W为样品质量,g。
（3）DPPH自由基清除能力的测定。精确称量4 mg的DPPH,用95%的甲醇溶液溶解并定容至100 mL。总反应体积4.0 mL,将10~2.5 mg/mL的浓度范围内的待测溶液与3 mL DPPH溶液分别加入试管中,混匀后在室温下静置20 min,于517 nm处测定其吸光度A1（以95%甲醇溶液调零）[23]。测定1 mL 95%甲醇溶液与3 mL的DPPH甲醇溶液混合后的吸光度A0作为阴性对照,以BHT作为阳性对照。根据以下公式计算其清除率：
$清除率=\frac{{{A}_{0}}-{{A}_{1}}}{{{A}_{0}}}\times 100\%$
式中：A0为无样品的阴性对照吸光度,A1为待测样品的吸光度。
（4）ABTS自由基清除能力的测定。将0.0384 g ABTS定容至10 mL,0.134 g过硫酸钾定容至10 mL,将2种溶液混合,避光放置12 h后得ABTS工作液,使用之前用乙醇稀释一定倍数,使其在734 nm的吸光度为0.7000± 0.001。取乙醇提取物0.3 mL与2.7 mL ABTS工作液反应30 min后,在波长为734 nm处测定吸光度[27]。根据以下公式计算其清除率：
$清除率=\frac{A_{0}-A_{1}}{A_{0}} \times 100\%$
式中：A0为溶剂吸光度,A1为待测液吸光度。
（5）总还原力的测定。将2.5 mL的3种不同溶剂提取物（0~2.5 mg/mL）分别与2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸盐缓冲溶液混合,再加入1.0 mL 1%铁氰化钾溶液在50 ℃下水浴30 min。然后加入2.5 mL 10%三氯乙酸,混匀后在3000 r/min下离心10 min,取上清液2.5 mL与2.5 mL蒸馏水、0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液混合,静置10 min后在700 nm下测量其吸光度[28]。
1.3 数据处理
所有实验均重复3次。运用Origin 8.0及GraphPad Prism 5.0软件进行数据分析及作图。用SPSS 12.0软件进行差异显著性分析,P<0.05为差异显著,P>0.05表示差异不显著。
2 结果与分析
2.1 组分分析
不同预处理方法对油茶籽种皮得率和基本组分含量的影响见表1。由表1可知,油茶籽种皮经酸法、碱法、亚临界水和离子液体预处理后所得样品得率分别为(62.42±0.99)%、(70.13±0.90)%、(80.07±0.01)%和(75.89±0.66)%。这可能与不同预处理方法对油茶籽种皮中纤维素、半纤维素与木质素的降解程度大小有关系。一般而言,高pH条件（碱法）对于木质素的去除效果显著,低pH条件（酸法）可以降解半纤维素。而中性条件下,如离子液体法和亚临界水法,破坏的是物料的结构,通过纤维素的溶出与析出过程,实现纤维素的再生过程,因而对原料质量的影响不大[27]。对油茶籽种皮纤维素、半纤维素和木质素含量分析的结果表明,酸法能够显著降低半纤维素的含量（表1）,这主要是由于酸法可将半纤维素降解为可溶性糖并改变木质素的结构,从而使半纤维素和木质素被部分除去。碱法预处理可导致物料中天然木质素转化为碱木质素溶解在碱里,使得木质素含量降低。亚临界水法处理过程降低了油茶籽种皮中半纤维素的含量,这可能是由于高温水蒸气导致原料中的木质素被溶解、半纤维素中的乙酰基发生水解,进而除去原料中的木质素和半纤维素,从而降低种皮中木质素与半纤维的含量。离子液体对纤维素与半纤维素的影响显著,而对木质素组分无显著影响,这可能与其中性并且反应条件温和有关,也可能与木质素的特殊化学结构导致其在一般的离子液体中溶解度相对较低有关,上述结果与Zhao等[29]研究一致。
表1 不同预处理方法所得油茶籽种皮得率和基本组分Tab. 1 The yield and proximate compositions content of camellia episperm obtained from different pretreatment methods % |
| 项目 Items | 酸法 Acid treatment | 碱法 Alkali treatment | 亚临界水法 Subcritical water treatment | 离子液体法 Ionic liquid | 原料 Raw material |
|---|---|---|---|---|---|
| 得率 | 62.42±0.99e | 70.13±0.90d | 80.07±0.01b | 75.89±0.66c | 100.00±0.00a |
| 纤维素含量 | 39.36±0.40a | 36.67±0.74ab | 32.05±4.38b | 21.29±0.98c | 38.83±3.81ab |
| 半纤维素含量 | 3.95±0.10c | 26.99±0.87a | 29.70±0.53a | 13.44±0.14b | 31.21±0.23a |
| 木质素含量 | 17.74±1.18b | 7.51±0.86c | 18.87±1.60b | 23.52±1.12a | 24.67±0.68a |
注：同行不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Different lowercase letters in the same row represent significant difference (P<0.05). |
2.2 结构表征
2.2.1 扫描电子显微镜（SEM）分析 不同预处理方法对油茶籽种皮微观结构影响测定结果如图2所示,由图可以看出,未经预处理的原料表面光滑、质构紧密,而经4种方法预处理后的油茶籽种皮表面变得粗糙不平整,油茶籽种皮纤维比表面积增大、表面孔洞增加。酸法和碱法预处理后的原料表面褶皱增多,其主要原因为原料中的半纤维素被降解,木质素结构被改变,使半纤维素和木质素被部分除去。亚临界水处理的原料纤维束分离,主要原因是亚临界条件下随温度升高,水分子间的相互作用越强烈,从而加速催化降解反应速率。而离子液体处理之后物料出现孔隙及褶皱,结构明显变得松散,说明在离子液体处理过程中,由纤维素、半纤维素及木质素等构成的纤维结构遭到破坏,使纤维分子内和分子间的氢键断裂,此结果与杨利娜[30]关于栓皮栎壳斗木质素的研究结果类似。
2.2.2 傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析 不同预处理方法及原料油茶籽种皮的傅里叶红外光谱分析结果见图3,由图可知,经4种预处理方法处理后所得油茶籽种皮没有新的吸收峰产生,而主要是发生了部分吸收峰消失以及吸收峰强度的变化。其中3435.77 cm-1左右有一个明显的吸收峰为O-H的伸缩振动峰,是所有高纤维农作物共有的峰,2923.43 cm-1为纤维素、半纤维素-CH3、-CH2的C-H伸缩振动峰,其主要是碳水化合物和脂肪族化合物;1739.29 cm-1左右的吸收峰为乙酰基的C=O的伸缩振动峰,该处为半纤维素的特征吸收峰,1600~1200 cm-1范围内为木质素的特征吸收峰,由吸收峰强度来看,酸法预处理和亚临界水法预处理能更好的除去木质素和半纤维素;1623.43 cm-1、1513.12 cm-1处是芳香环的伸缩振动峰,1378.72 cm-1处是O-H的弯曲振动峰,1056.90 cm-1是纤维素、半纤维素的C=O的伸缩振动峰,814.97 cm-1左右是纤维素β-D-葡萄糖苷键连接的吸收特征峰,由碱处理后油茶籽种皮的吸收峰峰值看出,碱法处理比其他3种处理方法更能有效除去木质素和半纤维素。此外,酸法和碱法处理后,油茶籽种皮1739.29 cm-1处的吸收峰消失,说明这2种方法可去除乙酰基。离子液体处理后并未出现新的吸收峰,表明该处理过程没有发生化学反应,只是溶解再生的过程,但吸收峰的强度发生变化,说明分子结构遭到了一定程度的破坏[31]。
2.2.3 核磁共振氢谱（1H NMR）分析 不同方法预处理后油茶籽种皮的1H NMR分析结果见图4。按照相关文献对1H NMR谱图化学位移进行归属可知,δ 0.75~1.50范围内的化学位移主要代表饱和脂肪族侧链上的甲基和亚甲基质子;δ 2.17~1.70范围内的化学位移主要代表脂肪族乙酰基上的质子;δ 4.10~3.10范围内的化学位移主要代表甲氧基上的质子;δ 4.6~4.7范围内的化学位移主要代表β-O-4'结构中Hβ的信号[21]。由图4A可知,5种样品的化学位移均在δ 4.5~5.0之间的4.70处有较强信号峰,其中原料、酸法和亚临界水处理所得油茶籽壳的1H NMR 谱相似,而碱法和离子液体处理所得油茶籽壳的1H NMR谱则与其他3种样品有明显差异。由图4B可知,碱法所得油茶籽壳的1H NMR谱主要体现在化学位移δ 1.5~2.0处的1.77处有较强的信号峰,而离子液体所得油茶籽种皮的1HNMR谱主要体现在化学位移δ 0.5~2.0处（0.78和1.77）的微弱信号峰和δ 4.10~3.10（3.74）处较强的信号峰。表明碱法和离子液体所得油茶籽壳纤维素中可能存在少量的脂肪酸类物质。
2.2.4 X-射线衍射（XRD）分析 不同预处理方法对油茶籽种皮结晶性影响的分析结果见图5。由图可以看出,原料油茶籽种皮在16.2°、22.6°处出现明显的衍射峰,在34.9°处出现较弱的衍射峰,其中16.2°信号峰来自于晶面101,22.6°的衍射峰对应的晶面是002,而34.9°弱峰来自004晶面,从晶面衍射峰可得出油茶籽种皮的结晶结构是纤维素Ⅰ型;油茶籽种皮经预处理后,衍射图的基本形状没有改变,说明预处理前后油茶籽种皮的晶型结构没有发生变化。此外,油茶籽种皮在16.2°、22.6°处的衍射峰的强度都有所升高,说明预处理对油茶籽种皮的纤维部分处理效果较好,纤维中的无定形区及结晶区表面经预处理后大量溶出,而将结晶区暴露在外使其吸收强度变大。通过结晶指数的计算证实了这一点,由计算可知,未经处理的油茶籽种皮原料强度较大,结晶指数为41.67,其次是酸法、碱法、亚临界水和离子液体所得油茶籽种皮结晶指数,分别为28.37、28.69、27.34和25.17。
2.3 热重分析（TGA）
不同预处理方法及原料油茶籽种皮的热重分析曲线见图6,由图可以得出,不同预处理方法所得的油茶籽种皮质量损失的趋势与原料基本一致,但初始降解温度不同,说明其热稳定性发生了改变。从质量损失发生的阶段来看,质量损失主要发生在200~600 ℃,而在30~200 ℃发生的质量损失很小,这说明油茶籽种皮具有较好的热稳定性,在30~200 ℃阶段主要以游离水分的蒸发为主。而在200~600 ℃则主要以热降解反应为主。此外,由图分析得出,原料、酸法、碱法、亚临界水和离子液体处理的油茶籽种皮初始降解温度分别为276、264、244、257、225 ℃,表明预处理方法均能够降低油茶籽种皮的起始降解温度和热稳定性;但不同的预处理方法对油茶籽种皮热稳定性的影响不同,热稳定性的大小依次为原料>酸法>亚临界水>碱法>离子液体,尤其是离子液体所得样品的起始降解温度最低,表明离子液体处理使油茶籽种皮的中纤维素含量溶解最多（表1）,使得离子液体处理所得油茶籽种皮的热稳定最差。
2.4 总酚、单宁含量测定和抗氧化活性分析
不同预处理方法的油茶籽种皮多酚含量与抗氧化活性的测定结果见表2。由表可知,原料、碱法、酸法、亚临界水和离子液体预处理方法所得油茶籽种皮的多酚含量分别是15.77、14.39、0.78、7.92、0.79 mg/g,单宁的含量分别是1.94%、0.05%、0.09%、0.21%和0.05%,说明原料中含有最高的多酚和单宁含量,酸法和亚临界水预处理次之,而碱法和离子液体处理法最低,同时不同预处理方法有助于降低油茶籽种皮中单宁的含量。通过对比分析原料和4种方法预处理后油茶籽种皮抗氧化活性,发现原料对DPPH自由基清除能力最强,酸法、亚临界法和离子液体法次之,而碱法所得油茶籽种皮对DPPH清除能力最弱;原料对ABTS自由基清除能力最好,酸法、碱法和亚临界水次之,而离子液体预处理所得油茶籽种皮对ABTS自由基清除能力最差;原料的还原能力最大,酸法、亚临界水和离子液体预处理次之,而碱法预处理所得油茶籽种皮对还原能力最小。由此可以得出,原料抗氧化活性最好、酸法和亚临界法次之、而碱法和离子液体法最差,这与油茶籽种皮中多酚和单宁含量高低基本一致,表明油茶籽种皮抗氧化活性可能与其所含有的多酚和单宁有关;同时还可以分析得出不同预处理方法降低了油茶籽种皮中单宁的含量和抗氧化活性,而具体降解产物和降低抗氧化活性机制有待进一步分析。
表2 不同预处理方法所得油茶籽种皮多酚含量与抗氧化活性Tab. 2 Polyphenols content and antioxidant activities of camellia episperm from different pretreatment methods |
| 处理 Treatments | 多酚含量 Polyphenols content/(mg·g-1) | 单宁 Tannin content/% | IC50/(µg·mL-1) | ||
|---|---|---|---|---|---|
| DPPH | ABTS | 还原能力Reducing power | |||
| 原料 | 15.77±0.49a | 1.94±0.03a | 16.80 | 1.60 | 44.18 |
| 酸法 | 14.39±0.34b | 0.05±0.00c | 34.09 | 2.90 | 168.95 |
| 碱法 | 0.78±0.01d | 0.09±0.01c | - | 9.74 | - |
| 亚临界 | 7.92±0.05c | 0.21±0.00b | 41.34 | 7.50 | 79.80 |
| 离子液体 | 0.79±0.01d | 0.05±0.01c | 864.12 | 187.16 | 2081.00 |
注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。-表示不在清除自由基范围内。 | |
Note: Different lowercase letters in the same column represent significant difference (P<0.05). - indicates not in the range of free radical scavenging. |
3 讨论
不同预处理方法降低油茶籽种皮得率、半纤维素和木质素含量不同,酸法能够显著降低半纤维素的含量,而碱法对木质素组分的去除效果显著,亚临界水处理主要破坏的是半纤维素和木质素,而离子液体对木质素组分影响不大。结构对比分析表明,不同预处理方法可使油茶籽种皮的纤维束结构变得松散、比表面积增大、表面孔洞增加;纤维结构的无定型区比例升高、结晶度下降;半纤维素和木质素被降解。不同预处理方法有助于降低油茶籽种皮中多酚与单宁的含量和抗氧化活性,其中原料抗氧化活性最好、酸法和亚临界水预处理次之、而碱法和离子液体预处理最差,该结果与油茶籽种皮中总酚和单宁含量高低基本一致,表明油茶籽种皮抗氧化活性可能与其所含有的总酚和单宁有关。在综合考虑油茶籽种皮成分变化、抗氧化活性以及环境污染问题的情况下,本研究认为亚临界水预处理能更好的提高油茶籽仁种皮深加工产品的附加值和油茶籽的综合利用率。
油茶籽油具有很好的保健作用,从而使油茶产业逐渐发展起来。随着油茶种植面积的增长和产量增大,油茶籽油生产的副产物油茶籽种皮也越来越多,那么如何利用业已成为亟待解决的问题。有关油茶果的研究主要针对于油茶的种植、油茶果壳和油茶籽油的提取,而针对油茶籽种皮的研究甚少[31]。截止目前,国内对油茶籽种皮的研究主要是利用油茶籽种皮的一些功能性成分,包括抗氧化活性成分提取、原花青素提取、多糖与黄酮提取等。但是这些物质不是油茶籽种皮的主要成分,其提取和利用成本也比较高,并不能解决副产物油茶籽种皮的浪费问题。通过成分分析,不同预处理方法处理后的原料半纤维素、纤维素与木质素,结构表征中离子液体处理更能促进纤维素溶解、破坏结晶结构和降低结晶程度,从而增加纤维素酶的反应位点,提高酶的活性,有助于油茶籽种皮容易被进一步开发利用[33]。油茶籽种皮中的纤维素、半纤维素进行微生物发酵可以生产乙醇[34]、乳酸[35]等一系列产品;不同处理方式可以提纯纤维素,或者预处理除去其他物质后通过提纯木质素和对木质素进行改性来生产改性木质素产品;将油茶籽种皮经过一定的处理提取膳食纤维[12]加入到保健食品中等,从而达到油茶籽种皮废物高质化和高值化利用的目的。