茶角盲蝽（Helopeltis theivora Waterhouse）属半翅目（Hemiptera）盲蝽科（Miridae）,又名茶刺盲蝽、腰果角盲蝽,是多种热带作物的重要害虫,我国主要分布在海南、广东、广西、云南和台湾等热带地区。该虫寄主种类多,已报道的寄主植物超过60种,包括可可、茶叶、咖啡、香草兰和菠萝蜜等重要经济作物[1,2]。其成虫、若虫以刺吸式口器刺入寄主的嫩芽、叶、果和枝条吸食汁液,并在组织表面形成水渍状斑点,造成受害果实生长受阻、种子发育不良、干枯和脱落,显著降低作物的产量和品质[3,4]。茶角盲蝽在海南等热带地区一年发生10~12代,世代重叠且无越冬现象,其大暴发会对可可、茶树等产业造成毁灭性打击[5,6]。另外,茶角盲蝽的适应力极强,至少能通过对频繁使用的杀虫剂快速产生抗药性和转移寄主2个途径适应环境变化压力[1, 7],因此化学药剂的单一使用具有一定的局限性,致使该虫成为限制热作产业可持续发展的重要因素之一。
近年来,化学生态学成为生态学领域最活跃的分支学科之一,其通过研究昆虫与植物之间的化学通讯机制,从行为调控的角度为害虫防控提供了新技术。现已明确昆虫主要通过嗅觉感受系统识别寄主植物的挥发性物质[8,9],而这些挥发性化合物由一定的组分、按照严格比例组成化学指纹图才能被昆虫识别,从而影响昆虫取食、产卵、传粉等行为[10,11,12]。植食性昆虫易被寄主植物挥发物所引诱,如杨梅挥发物对樱桃果蝇（Drosophila suzukii）有明显的引诱作用[13],绿豆荚挥发物可作为绿豆象（Callosobruchus chinensis）定位寄主的线索[14],表明昆虫种类不同,其偏好的植物挥发物成分也不同。尽管茶角盲蝽寄主众多,但其对寄主的偏好性有显著差异,该虫优先选择偏好的寄主取食和产卵,当主要寄主缺乏或被喷施农药后,它再转移至附近其他寄主（包括杂草）上维持生活[1]。但该虫对寄主植物的选择机制尚不清楚,可可是该虫的重要偏好寄主之一,因此有必要研究可可挥发物对茶角盲蝽行为选择的影响。然而,同一寄主植物的不同品种,对昆虫的引诱作用差异显著,如Q型烟粉虱（Bemisia tabaci）对不同茄子和烟草品种及其挥发物的行为反应均存在显著性差异[8, 15],研究昆虫对不同品种的行为反应,有助于为抗虫品种的筛选提供优异资源。前人已经研究了茶角盲蝽对28个茶树品种的行为趋性,并发现该虫对茶树品种也存在偏好性差异[16],但茶角盲蝽对不同可可种质资源是否存在偏好性未见报道。目前国内外关于茶角盲蝽化学通讯机制方面的研究较少,仅Sachin等[17]研究发现茶角盲蝽雄成虫对雌成虫性信息物质具有行为和电生理反应,表明性信息物质显著影响该虫的趋性行为,王政等[2]通过扫描电镜明确了茶角盲蝽触角和前足感器种类及分布。鉴于此,本文研究了该虫对26份可可种质的选择性反应,并利用“Y”型嗅觉仪测定该虫对2份特异种质（相对易感2-7和相对抗性STS-17）及其挥发物的行为反应,探究茶角盲蝽对寄主的选择机制,以期为可可抗性品种筛选和茶角盲蝽行为调控技术研究提供基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试昆虫 茶角盲蝽采自中国热带农业科学院香料饮料研究所可可园,带回实验室后置于养虫笼中,在温度(26±1)℃,相对湿度(75±5)%,光周期L∶D=14∶10条件下用新鲜豆角饲养,待其第二代发育为成虫后进行试验。
1.1.2 供试植物 可可种质资源来自中国热带农业科学院香料饮料研究所农业农村部热带香料饮料作物种质资源圃。
1.1.3 仪器与设备 Aglient-7890A/5975气相色谱-质谱联用仪,美国Agilent公司;57330-U固相微萃取手动进样手柄,美国Supelco公司;DVB/CAR/PDMS 50/30 μm固相微萃取头,美国 Supelco公司。
1.2 方法
1.2.1 茶角盲蝽对26份可可种质果实的选择性 采集处于果实膨大初期（授粉30 d内）且大小均一的26份可可种质嫩果（果长6~8 cm）置于同一养虫笼中,各果实经标记后呈环形排列在笼底,并保持统一间距（两两间隔约13.8°）,形成一个完整的闭环。将茶角盲蝽成虫饥饿处理4 h后移入圆形保鲜盒中,保鲜盒的底部中央设置粘钩,将保鲜盒倒置悬挂于养虫笼顶部中央,悬挂点与笼底圆环中心位于同一垂直线上,使养虫盒中央与笼底环形排列的可可果距离一致,理论上成虫对各果实的选择机会均等。打开盖子,因茶角盲蝽成虫具有飞行能力,分散的成虫将选择性的取食不同的可可果实,每盒50头,3次重复。12 h后统计各种质果实上的取食斑个数,初步筛选出相对抗性、感性种质资源各1份。
1.2.2 茶角盲蝽对可可种质的趋性行为测定 根据1.2.1获得的相对感性和抗性种质资源,设置抗性/对照、感性/对照、抗性/感性3组试验,利用“Y”型嗅觉仪记录茶角盲蝽对不同处理的选择性,每次测定1头成虫,具有行为选择的有效重复为60次。行为测定装置：参考Honda等[18]和曹凤勤等[19]方法制作,“Y”型嗅觉仪由玻璃管制成,内径3 cm,主臂和两个侧臂长均为20 cm,侧臂夹角60°。两侧臂分别连接规格一致的味源广口瓶,进入管中的空气经过活性炭过滤和蒸馏水加湿,每臂空气流量调为500 mL/min。测试前,取大小相似的可可嫩果放入味源瓶,用封口膜封口,通气10 min,使味道充满管道。将处于活跃期的茶角盲蝽饥饿处理4 h后进行试验,每次测定接入1头虫于主臂,当其进入任一侧臂超过5 cm,并停留30 s即认为做出选择;5 min内不作选择则认为无反应。每测试10头虫后用乙醇冲洗“Y”型管,烘干后调换两臂与味源位置,以消除“Y”型管可能的不对称造成的误差。
1.2.3 可可挥发物成分收集与鉴定 利用顶空固相微萃取法分别收集相对感性和抗性可可果实挥发物,再用GC-MS鉴定各挥发物成分。
萃取条件：取可可果实样品置于20 mL顶空瓶中,加盖密封,置于35℃水浴锅中,插入萃取头萃取40 min。
GC-MS分析条件：色谱柱为DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）,进样口温度250 ℃,不分流模式,接口温度280 ℃。升温程序：初始柱温40℃,以2℃/min升至120℃,保持2 min;再以10℃/min升至280℃,保持4 min;载气为He,流速1.0 mL/min。电离方式为EI,电离能70 eV,各挥发物成分质谱图经与NIST 2014谱库检索比对进行定性,用峰面积归一化法进行各组分相对定量计算。
1.2.4 茶角盲蝽对挥发物标样的行为测定 测试的挥发物标准样品共11种,详见表1。将各挥发物标样用正己烷配制成100、10、1 mg/mL共3个浓度作为处理,以正己烷作为对照,每次取25 μL样品滴入味源瓶内的滤纸上,测试茶角盲蝽对各标样的行为反应,每测试20 min更换滤纸。行为测定装置与方法同1.2.2。
表1 标准样品的种类和纯度Tab. 1 Compounds and purity of standard chemical samples |
| 名称Compounds | 纯度Purity/% | CAS | 来源Source |
|---|---|---|---|
| 1-己醇 1-hexanol | 98 | 111-27-3 | TCI |
| β-石竹烯 β-caryophyllene | 90 | 87-44-5 | TCI |
| (+)-柠檬烯 D-limonene | 95 | 5989-27-5 | TCI |
| 顺-3-己烯-1-醇 (Z)-3-hexen-1-ol | 97 | 928-96-1 | TCI |
| 均三甲苯 mesitylene | 97 | 108-67-8 | TCI |
| 1-辛烯-3-醇 1-octen-3-ol | 98 | 3391-86-4 | TCI |
| (1R)-(+)-α-蒎烯 (1R)-(+)-α-pinene | 97 | 7785-70-8 | TCI |
| 八甲基环四硅氧烷 octamethyl-cyclotetrasiloxane | 98 | 556-67-2 | TCI |
| 丁酸顺式-3-己烯酯 butanoic acid, (Z)-3-hexenyl ester | 98 | 16491-36-4 | Sigma- Aldrich |
| 顺-3-壬烯-1-醇 (Z)-3-nonen-1-ol | 95 | 10340-23-5 | TCI |
| 六甲基环三硅氧烷 hexamethyl-cyclotrisiloxane | 98 | 541-05-9 | TCI |
1.3 数据处理
采用SPSS 20.0软件对数据进行分析,室内选择性试验数据用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验,趋性行为反应数据用χ2检验。
2 结果与分析
2.1 茶角盲蝽对26份可可种质的选择性反应
室内选择性试验结果表明,茶角盲蝽成虫对不同可可种质存在一定的选择趋性。由图1可知,处理12 h后,2-7可可种质果实上的取食斑数量显著高于其他资源,表现出对茶角盲蝽相对易感;而STS-17、BGL44-64、15-9种质果实上的取食斑数量明显低于其他资源,其中以STS-17果实上的取食斑数量最低,表现出对茶角盲蝽的相对抗性。
2.2 茶角盲蝽对初筛相对抗性种质的趋性行为反应
图2 茶角盲蝽成虫对不同可可种质的行为反应*和**分别表示差异显著（P<0.05）和差异极显著（P<0.01）;ns表示差异不显著（P>0.05）。 Fig. 2 Behavioral responses of H. theivora adults to odors from different cocoa germplasms * and ** indicates significant difference at P<0.05 level and P<0.01 level, respectively. ns indicates no significant difference (P>0.05). |
2.3 可可果实挥发物的成分
从STS-17和2-7可可种质果实中共检测出18种挥发物,包括醇类、萜烯类、苯类、烷烃类、呋喃类和脂类等6类,但2份种质间的挥发物种类与含量差异较大（表2）。STS-17果实中含有5类、11种挥发物,其中醇类相对含量为83.74%,萜烯类3.66%,烷烃类10.16%,呋喃类0.67%,脂类1.76%。2-7果实中含有4类、10种挥发物,其中萜烯类相对含量为31.53%,醇类30.43%,苯类9.31%,烷烃类28.73%。比较2份种质挥发物组分差异,2-7挥发物中萜烯类化合物含量最高,约为STS-17的8.61倍;二者共有成分为1-己醇、反-α-香柠檬烯和六甲基环三硅氧烷。
表2 STS-17和2-7可可种质的挥发物组分与相对含量Tab. 2 Components and relative contents of the volatiles of STS-17 and 2-7 germplasms |
| 序号 Order | 挥发物名称 Name of volatiles | 相对含量 Relative contents/% | |
|---|---|---|---|
| STS-17 | 2-7 | ||
| 1 | 1-己醇1-hexanol | 11.68 | 16.82 |
| 2 | 顺-3-己烯-1-醇(Z)-3-hexen-1-ol | — | 13.60 |
| 3 | 3-己烯-1-醇3-hexen-1-ol | 20.28 | — |
| 4 | 1-辛烯-3-醇1-octen-3-ol | 34.53 | — |
| 5 | 顺-3-壬烯-1-醇(Z)-3-nonen-1-ol | 17.25 | — |
| 6 | （1R)-(+)-α-蒎烯(1R)-(+)-α-pinene | — | 6.07 |
| 7 | (+)-柠檬烯D-limonene | — | 10.98 |
| 8 | β-石竹烯 β-caryophyllene | — | 11.85 |
| 9 | 佛术烯eremophilene | — | 1.19 |
| 10 | 反-α-香柠檬烯trans-α-bergamotene | 2.29 | 1.44 |
| 11 | (3E)-4,8-二甲基壬-1,3,7-三烯(3E)-4,8-dimethylnona-1,3,7-triene | 0.85 | — |
| 12 | β-杜松烯 β-cadinene | 0.52 | — |
| 13 | 联三甲苯1,2,3-trimethyl-benzene | — | 6.46 |
| 14 | 均三甲苯mesitylene | — | 2.85 |
| 15 | 八甲基环四硅氧烷octamethyl-cyclotetrasiloxane | 3.44 | — |
| 16 | 六甲基环三硅氧烷hexamethyl-cyclotrisiloxane | 6.72 | 28.73 |
| 17 | (E)-2-(2-戊烯基)-呋喃trans-2-(2-Pentenyl)furan | 0.67 | — |
| 18 | 丁酸顺式-3-己烯酯butanoic acid, (Z)-3-hexenyl ester | 1.76 | — |
注：—表示未检出。 | |
None: — means not detected. |
2.4 茶角盲蝽对可可挥发物标样的趋性行为反应
与对照相比,当浓度为100 mg/mL时,β-石竹烯、丁酸顺式-3-己烯酯和八甲基环四硅氧烷对茶角盲蝽成虫有明显的驱避作用;当浓度为10 mg/mL时,β-石竹烯对茶角盲蝽成虫有明显的引诱作用;当浓度为1 mg/mL时,六甲基环三硅氧烷对茶角盲蝽有明显的引诱作用,而(+)-柠檬烯对该虫有明显的驱避作用（图3）。由此可知,茶角盲蝽并非对所有单一挥发物有行为反应,同时随着浓度的变化,其对同一挥发物的行为反应也发生显著性改变。
3 讨论
昆虫对同一寄主不同品种的选择性存在明显差异,在农业生产上可以考虑利用不同作物及作物不同品种的合理布局,从而控制害虫的危害[20]。例如,花蓟马（Frankliniella intonsa）、黄胸蓟马（Thrips hawaiiensis）和茶黄蓟马（Scirtothrips dorsalis）等3种蓟马类害虫对不同品种芒果的选择性较一致,它们都在凯特芒果上发生严重,而在季芒上发生量较轻[21];烟粉虱分别对茄子、烟草和番茄的不同品种具有选择偏好性[8, 15, 20];二斑叶螨（Tetranychus urticae）对IVF58和IVF118这2个甜瓜品种的取食和产卵趋性最小,二者可用于甜瓜生产上的抗螨备选品种[22]。Roy等[16]已经证实了不同茶树品种对茶角盲蝽的取食偏好性影响显著,尽管未发现对该虫完全免疫的茶树品种,但筛选出5个相对抗性品种TV4、TV11、TV28、TV29和ST449。与上述结果基本一致,本研究发现茶角盲蝽对26份可可种质也存在选择偏好性,通过室内选择性试验筛选了对该虫有相对抗性的3份种质STS-17、BGL44-64和15-9,并利用“Y”型管试验进一步证实了STS-17是该虫的相对抗性种质,可为该虫抗性品种的选育提供特异资源。
寄主对昆虫选择行为的影响可能与多种因素有关,包括不同品种间易受害部位的物理性状、寄主的营养丰富度和次生代谢物质组成等[23,24]。其中寄主植物的挥发物是影响昆虫选择性的重要因素之一[19],王晶玲等[25]通过“Y”型嗅觉试验发现食芽象甲（Scythropus yasumatsui）对不同品种枣树枣芽的趋性行为反应差异显著,表明枣芽挥发物能影响该虫寄主选择;Piersanti等[26]研究发现菜蝽（Eurydema oleracea）对不同芸苔属植物的挥发物有不同的行为和电生理反应,并在其触角中发现多种嗅觉感受器,表明化学信号在该虫寄主选择中起关键作用。本研究结果表明,茶角盲蝽对11种可可挥发物的行为反应差异显著,其中β-石竹烯、(+)-柠檬烯、六甲基环三硅氧烷、丁酸顺式-3-己烯酯和八甲基环四硅氧烷等5种物质对该虫有引诱或驱避作用。结合前人研究结果,茶角盲蝽对茶树品种有偏好[16],同时其触角中分布大量的嗅觉感器[2],本研究进一步证实了寄主植物挥发物在茶角盲蝽寄主定位中具有重要的行为导向作用。另外,挥发物浓度也能影响昆虫行为,这可能是因为不同化合物具有不同的阈值效应。曹凤勤等[19]发现顺-3-己烯-1醇、α-蒎烯和正十二烷在高浓度时对烟粉虱有较强的排斥作用,而低浓度时无影响;丁子香酚、竺烯、里那醇和月桂烯在合适浓度时才对烟粉虱有引诱作用。本研究也发现茶角盲蝽对挥发物浓度反应敏感,β-石竹烯等5种物质仅在一定浓度下对该虫起作用,随着浓度的变化这种作用逐渐减弱,甚至变为反作用,这可能与不同化合物的挥发性强弱有关,其中八甲基环四硅氧烷和六甲基环三硅氧烷通常被认为是环境污染物,但二者在合适浓度下对茶角盲蝽有明显的引诱或驱避作用,因此可通过优化挥发物收集条件进一步验证。值得一提的是由于部分挥发物标样未商品化,本研究仅对18种可可挥发物中的11种进行趋性行为测试,其余7种挥发物是否影响茶角盲蝽的选择行为有待验证。另外,本研究仅证实了单一寄主挥发物可以影响茶角盲蝽的选择行为,但挥发物通常由一定组分和比例构成化学指纹图谱被昆虫识别,因此有必要进一步开展挥发物多组分配比试验;同时叶片等植物组织的厚度也会影响昆虫的取食选择[22, 27],该虫对不同品种可可的选择性是否与果荚表皮厚度有关,还需进一步研究。
应用抗虫品种是害虫综合治理的一部分,具有控制害虫数量、减少化学农药使用、降低环境污染等优点,前景广阔[21]。本研究初步筛选了对茶角盲蝽具有一定抗虫特性的3份可可种质资源STS-17、BGL44-64和15-9,但目前尚无可可抗虫品种或种质材料的报道,无法进行对照比较,因此上述3份抗性种质及抗虫程度是相对的,还需进一步开展新品种选育和田间种植后害虫系统性调查验证等工作。