近年来,重金属镉（cadmium, Cd）污染问题日益严重,镉具有高度移动性和毒害性,且半衰期达20~30年之久[1]。镉与汞、砷、铅、铬一起被称为环境污染的“五毒元素”[2],镉并被列为“五毒之首”[3]。镉不是植物所必须的营养元素,但非常容易被植物吸收富集,进而进入植物体内累积,破坏植物细胞膜透性,抑制蛋白质、核酸、碳水化合物等代谢及水分和矿物质的吸收和运输,从而影响植物生长发育、品质和产量,甚至造成植物死亡[4]。植物耐受镉的机制较为复杂,不同的植物在不同的生长发育期对镉胁迫的响应机制都可能不同[5]。目前研究表明,植物的耐镉机制主要包括螯合作用、区隔化作用、抗氧化作用、排外作用、固定钝化作用和应急作用[6]。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究使用的23份海雀稗种质资源,其中6份来自海南省文昌、万宁、三亚、临高,17份引自美国（表1）,此23份材料均种植于海南大学儋州校区农科基地。试验材料按编号顺序分别种植在1 m2的小区内,每2周对长出小区边缘的匍匐茎进行修剪,以防止不同材料间的混淆。对田间材料进行常规灌溉和施肥,以保持其健康生长。
表1 23份海雀稗种质资源信息Tab. 1 Information of 23 P. vaginatum Sw.germplasm resources |
| 编号Code | 来源Origin | 编号Code | 来源Origin |
|---|---|---|---|
| HN17-02 | 中国海南文昌 | USA17-22 | 美国 |
| HN17-35 | 中国海南万宁 | USA17-24 | 美国 |
| HN17-42 | 中国海南三亚 | USA17-30 | 美国 |
| HN17-52 | 中国海南临高 | USA17-35 | 美国 |
| HN17-53 | 中国海南临高 | USA17-36 | 美国 |
| HN17-54 | 中国海南临高 | USA17-37 | 美国 |
| USA17-01 | 美国 | USA17-38 | 美国 |
| USA17-02 | 美国 | USA17-41 | 美国 |
| USA17-06 | 美国 | USA17-42 | 美国 |
| USA17-07 | 美国 | USA17-45 | 美国 |
| USA17-16 | 美国 | USA17-47 | 美国 |
| USA17-17 | 美国 |
1.2 方法
1.2.1 耐镉评价体系优化 本试验参照陈静波等[11]的方法对材料进行水培法培养,并略作修改。选取田间草坪质量较高的海雀稗（HN17-02）进行预培养,从试验地取大小、生长一致的匍匐茎,种植于装好石英砂的塑料杯中,每4个塑料杯置于一块泡沫板上,将泡沫板放于6 L的塑料桶上,桶里装满霍格兰营养液。待海雀稗生长良好后每周修剪一次,留茬8 cm。3个月后修剪一致并进行镉胁迫,设置镉浓度梯度为0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mmol/L。胁迫3周后,测定叶片枯黄率、坪用质量和叶片质膜透性。
采用目测打分法[12]记录各材料叶片枯黄率（LF）,采用百分制,单位为%,5%以下表示草坪草基本上没有黄叶出现,50%表示草坪草有一半枯黄,95%以上表示草坪草基本上没有绿叶而死亡。坪用质量参照美国NTEP评分法[13]：用9分制评分法,1~2分为休眠或半休眠草坪;2~4分为质量很差;4~5分为质量较差;6~7分为良好;7~8分为优质草坪;8~9分为质量极佳。坪用质量与枯黄率均3人以上打分,求平均值。参考陈静波等[11]的方法,计算叶片枯黄率上升到50%时的镉浓度作为海雀稗镉胁迫半致死阈值[14],用于后面海雀稗资源耐镉性评价的处理浓度。参考刘宁等[15]方法,测定叶片质膜透性,以相对电导率的大小来表示质膜受伤害的程度。
1.2.2 23份海雀稗资源的耐镉性评价 从试验基地小区内分别取23份海雀稗的匍匐茎,分别剪成长短一样的茎节,种植于底部有孔的塑料杯中,用洗过的石英砂固定。每份实验材料种植8杯,每杯中种植3个茎节,放在泡沫板孔中放置小桶上在大棚内进行培养。每份材料（2桶）随机排列在大棚台子上,每个小桶内装有霍格兰营养液6 L,镉处理前需要先进行3个月左右的预培养。预培养期间每周进行1次修剪,留茬8 cm。最后一次修剪后进行镉处理。根据前面得出的海雀稗镉胁迫半致死阈值,设定处理镉浓度为1.50 mmol/L,对照为不加镉的霍格兰营养液。镉处理3周后测定叶片枯黄率、坪用质量、地上及地下部分镉离子含量,对其中3份耐镉型（USA17- 02、USA17-30和USA17-37）和4份敏镉型（USA17-24、USA17-42、USA17-47和HN17-35）材料测定脯氨酸和叶绿素含量。
1.3 数据处理
用Excel和SPSS软件进行数据统计及分析处理,通过ANOVA来计算每个处理的数据平均值和误差,平均值之间的显著差异性采用LSD法进行检验。相对坪用质量=（处理坪用质量/对照坪用质量）×100%;镉转移系数=地上部分镉含量/地下部分镉含量。
2 结果与分析
2.1 海雀稗种质资源耐镉体系优化
2.1.1 不同浓度镉胁迫对海雀稗坪用质量与枯黄率的影响 对不同浓度镉处理的海雀稗测定坪用质量与枯黄率,结果表明,不同浓度镉处理对海雀稗坪用质量及枯黄率的影响较大,各浓度下差异显著（P<0.05）（表2）。随处理镉浓度增加,海雀稗坪用质量呈现逐渐降低趋势,0.50 mmol/L与1.00 mmol/L、1.00 mmol/L与1.50 mmol/L镉浓度下处理间坪用质量无显著差异（P>0.05）,但1.50 mmol/L与2.00 mmol/L镉浓度下坪用质量出现显著差异（P<0.05）,2.00 mmol/L与2.50 mmol/L、2.50 mmol/L与3.00 mmol/L镉浓度下处理间坪用质量无显著差异（P>0.05）,在3.00 mmol/L时,草坪大面积死亡,坪用质量仅有1.67分。低浓度镉（0.50~1.50 mmol/L）处理时,海雀稗叶片枯黄率较低,均在45.00%以下,镉浓度为1.0~3.0 mmol/L处理时,叶片枯黄率差异显著（P<0.05）,在3.00 mmol/L时,草坪叶片枯黄率均值达到83.33%。坪用质量及枯黄率结果表明,高浓度（2.0~3.0 mmol/L）镉胁迫对海雀稗生长产生明显抑制作用。
表2 不同浓度镉胁迫对海雀稗坪用质量、叶片枯黄率的影响Tab. 2 Effect of Cd stress on turf quality and leaf firing percentage of P. vaginatum Sw. |
| 镉浓度 Cd concentration /(mmol·L-1) | 坪用质量 Turf quality | 叶片枯黄率 Leaf firing percentage/% |
|---|---|---|
| 0.00 | 6.67±0.29a | 16.67±2.89f |
| 0.50 | 5.33±0.50b | 20.00±5.00f |
| 1.00 | 4.83±0.50bc | 31.67±2.89e |
| 1.50 | 4.17±0.58c | 41.67±2.89d |
| 2.00 | 2.67±0.29d | 63.33±1.53c |
| 2.50 | 2.00±0.00de | 75.00±0.00b |
| 3.00 | 1.67±0.29e | 83.33±5.77a |
注：同列不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05). |
2.1.2 不同浓度镉胁迫对海雀稗质膜透性的影响 测定不同镉浓度处理的海雀稗叶片质膜透性,结果表明（图1）,质膜透性随着镉浓度的增加而变大,但在0 mmol/L与0.5 mmol/L、1.0 mmol/L与1.5 mmol/L的浓度处理间,质膜透性无显著差异（P>0.05）,当镉浓度超过1.5 mmol/L时,各个处理间差异显著（P<0.05）。
2.1.3 镉胁迫半致死阈值计算 分别以不同镉浓度处理3周的叶片枯黄率为自变量,以镉浓度为因变量建立回归方程,得到一元二次回归方程Y=-0.21+0.1X-0.000265X2,R2=0.96300。以叶片枯黄率上升到50%的镉浓度为海雀稗镉胁迫半致死阈值,得出海雀稗半致死浓度为1.5 mmol/L。本试验选用1.5 mmol/L的镉浓度作为海雀稗种质资源评价的胁迫条件。
2.2 23份海雀稗种质资源耐镉性评价
2.3 耐镉指标与镉含量之间的相关性
通过对耐镉指标和镉含量的相关性分析（表3）,得到了各指标的相关系数,地上镉含量与转移系数存在极显著正相关（P<0.01）,地上镉含量与地下镉含量之间、地下镉含量与转移系数之间以及相对坪用质量与枯黄率之间存在极显著负相关（P<0.01）;镉含量与相对坪用质量和枯黄率之间无明显相关（P>0.05）。
表3 耐镉指标与镉含量的相关性Tab. 3 Correlation between cadmium tolerance index and cadmium content |
| 项目 Items | 地上镉含量 Cadmium content of aboveground | 地下镉含量 Cadmium content of underground | 转移系数 Transfer coefficient | 相对坪用质量 Turf quality | 枯黄率 Leaf firing |
|---|---|---|---|---|---|
| 地上镉含量 | 1 | ||||
| 地下镉含量 | -0.598** | 1 | |||
| 转移系数 | 0.767** | -0.786** | 1 | ||
| 相对坪用质量 | -0.349 | 0.286 | -0.360 | 1 | |
| 枯黄率 | 0.359 | -0.206 | 0.255 | -0.824** | 1 |
注：**表示在0.01水平（双侧）上显著相关。 | |
Note: ** indicates significant correlation at the 0.01 level. |
2.4 镉胁迫条件下海雀稗叶绿素和脯氨酸含量变化
为分析海雀稗耐镉生理机制,对海雀稗极端种质镉胁迫前后的叶绿素含量和脯氨酸含量进行了测定。结果表明,镉处理后各材料叶绿素含量均下降,脯氨酸含量升高,其中耐镉种质USA17-30镉胁迫前叶绿素含量显著低于其余种质（除HN17-35）,但镉胁迫后显著高于敏镉种质叶绿素含量;耐镉种质USA17-02与敏镉种质USA17-42和USA17-47镉胁迫前叶绿素含量无显著差异,但镉胁迫后USA17-02叶绿素含量显著高于USA17-42和USA17-47（表4）。镉胁迫前后耐镉种质脯氨酸含量均显著高于敏镉种质。
表4 海雀稗种质镉胁迫后叶绿素及脯氨酸含量Tab. 4 Chlorophyll and proline content in P. vaginatum Sw after cadmium stress |
| 抗性类型 Type of tolerance | 编号 Code | 叶绿素Chl/(mg·kg-1) | 脯氨酸Pro/(µg·g-1) | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| CK | 镉处理 Cadmium stress | 相对值 Relative value | CK | 镉处理 Cadmium stress | 相对值 Relative value | ||
| 耐镉型 | USA17-02 | 1189.70±18.61b | 782.72±23.15a | 0.66 | 79.06±23.04a | 1976.56±576.02a | 25.00 |
| USA17-30 | 892.27±43.19de | 748.18±20.81a | 0.84 | 74.58±6.37a | 1864.59±159.36a | 25.00 | |
| 敏镉型 | USA17-37 | 1322.55±13.64a | 795.73±12.82a | 0.60 | 83.50±2.83a | 2087.38±70.70a | 25.00 |
| USA17-24 | 1071.22±34.65c | 600.30±62.64bc | 0.56 | 50.39±2.91b | 1259.84±72.80b | 25.00 | |
| USA17-42 | 1182.54±11.53b | 544.64±51.93c | 0.46 | 20.42±1.51c | 510.42±37.84c | 25.00 | |
| USA17-47 | 1222.32±15.22b | 483.86±7.28cd | 0.40 | 20.21±0.52c | 505.21±13.02c | 25.00 | |
| HN17-35 | 875.98±66.53e | 440.17±48.59d | 0.50 | 38.44±1.04b | 960.94±26.04b | 25.00 | |
注：同列不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05). |
3 讨论
3.1 不同镉浓度与海雀稗耐镉性
镉对植物胁迫达到一定程度时,会破坏细胞膜系统,细胞质膜透性增加,生长受到抑制,表现出相应的症状[5],也会影响叶绿素及相关酶的合成,使植物光合受到抑制,导致植物叶片枯黄[19,20]。本研究对海雀稗HN17-02进行不同浓度镉胁迫发现,镉胁迫后海雀稗表现出植株叶片枯黄,根系褐化,导致坪用质量下降。质膜透性结果表明,高浓度镉胁迫造成海雀稗细胞膜系统破坏,膜透性增大,细胞内可溶物外渗,导致电导率增加,与王正秋等[21]通过镉对芦苇的胁迫结果一致。悦飞雪等[22]在盆栽条件下研究结果表明,高浓度镉胁迫显著抑制烟草生长。侯定基等[23]对不同浓度镉胁迫下麻疯树幼苗生长、生理影响研究发现,低浓度的镉对麻疯树生长无明显毒害作用,但随着镉浓度增加,麻疯树生长受到抑制。本研究中不同浓度镉胁迫海雀稗叶片均呈现不同程度的枯黄现象,相对坪用质量下降,当镉浓度1.50~3.00 mmol/L时,叶片枯黄严重,海雀稗生长抑制严重,与悦飞雪等[22]、侯定基等[23]研究结果相似。筛选海雀稗存活临界镉浓度,为后续海雀稗种质资源耐镉评价与机理研究提供可靠依据。
3.2 海雀稗种质资源耐镉性评价
不同植物耐镉性有差异,相同植物不同部位对镉的耐性也有很大差异[24]。岳松青等[25]对6种苹果砧木耐镉能力综合性评价,结果显示6种苹果砧木对耐镉能力存在差异。胡冰钰等[26]对14份能源植物柳枝稷品种进行耐镉性综合评价,发现14份柳枝稷可分为3组不同耐镉型材料。本研究对23份海雀稗种质资源进行耐镉性综合评价,不同材料耐镉能力差异较大,其中USA17-02、USA17-30、USA17-37、USA17-41和USA17-45耐镉能力较强,USA17-22、USA17-24、USA17- 42、USA17-47和HN17-35耐镉能力较弱。与吴朝波[10]、段瑞军等[18]关于镉胁迫的研究相比,本研究种质资源数量较大,来源更加广泛,通过测定海雀稗在镉胁迫下的形态变化,能较为系统地筛选出耐镉性较强的海雀稗种质,为后续海雀稗耐镉机制研究提供可靠的试验材料。
在海雀稗的耐镉性差异评价中,并不是所有指标都能反映海雀稗耐镉的能力,各指标间存在相互影响。本研究对枯黄率、相对坪用质量、地上镉含量、地下镉含量和转移系数5个指标进行相关性分析,为后续海雀稗耐镉试验提供最适宜的评价指标。相关性分析结果表明枯黄率与相对坪用质量呈极显著负相关,相关系数为-0.824,这是由于坪用质量得分以NTEP为标准,草坪颜色为评分标准之一,叶色对草坪坪用质量有着直观影响。叶片枯黄率增大,在很大程度上降低了草坪草的坪用价值,因此二者之间呈显著负相关。本研究发现海雀稗地上部分镉含量变化范围为44.26~432.21 mg/kg,地下部镉含量变化范围为485.57~1098.84 mg/kg,镉转移系数变化范围为0.05~0.87,也就是说大多数的海雀稗资源具有较强的把镉隔离在根部,限制其往地上部分运输的能力。这与吴朝波等[10, 16]、Leita等[27]和张芳等[28]研究结论一致,张芳等[28]研究认为草类作物中吸收的65%~90%镉积累在根部。但是镉胁迫下,植物可以通过螯合作用、区隔化作用、抗氧化作用、排外作用、固定钝化作用和应急作用等不同的途径来抵抗镉毒害[6, 16]。因此,本研究中采用的海雀稗资源间可能存在多途径的耐镉机制,导致其组织镉含量或转移系数等指标与叶片枯黄率和草坪质量没有显著的相关性,即这些指标不能用来作为评价其耐镉能力强弱的指标
3.3 海雀稗耐镉生理机制
4 结论
对海雀稗耐镉体系进行优化,以叶片枯黄率50%的镉浓度为海雀稗镉胁迫半致死阈值,得出水培环境中镉处理3周的条件下,海雀稗临界存活镉浓度为1.5 mmol/L。对23份海雀稗种质资源进行耐镉性差异评价,在1.50 mmol/L镉胁迫下获得5份耐镉种质（包括USA17-02、USA17-30、USA17-37、USA17-41和USA17-45）和5份敏镉种质（包括USA17-22、USA17-24、USA17-42、USA17-47和HN17-35）。对海雀稗耐镉极端种质测定叶绿素及脯氨酸含量,初步阐述了海雀稗耐镉生理机制。