橡胶树（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）是典型的热带雨林乔木树种,生长和产胶的适宜温度为20~30 ℃,橡胶树能够正常生长和发育的临界温度为18 ℃,当下降至5 ℃时橡胶树开始出现不同程度的寒害症状,温度低于0 ℃时树梢和树干枯死,发生严重寒害甚至导致部分不耐寒品系死亡[1]。低温胁迫是限制橡胶树生长发育、产量和地理分布的主要环境胁迫因素[2,3]。因此,研究橡胶树的耐寒机制,提高耐寒适应性,推进橡胶树抗寒品种的选育,是非传统植胶区迫切需要解决的问题。
关于植物的抗寒性研究已有许多报道,在低温胁迫下,植物的叶和茎等形态指标以及一系列生理生化指标将发生变化[4,5],低温下电解质渗透率的变化大小常用来反映植物抗寒能力的强弱[6,7,8],而电导法与恢复生长法结合鉴定植物抗寒性,结果准确度较高[9,10]。目前,橡胶树抗寒性研究主要利用冬春季田间低温寒害调查[11,12],室内人工模拟低温寒害处理对其生理生化指标进行测定分析[13,14,15],随着分子生物学等新技术的迅速发展,橡胶树抗寒机制研究进入了一个新的阶段。研究表明,植物的根、茎和叶等不同组织器官对低温胁迫的生理响应及转录调控机制具有明显差异[16]。到目前为止,橡胶树的生理生化测定材料主要集中于离体枝条[13, 17]或叶片[15, 18],耐寒分子机制研究材料集中于叶片[19,20,21],然而橡胶树不同品种、部位对低温的反应各不相同,且同一品种对不同类型低温的抗寒力也不尽相同,寒害程度与低温类型密切相关[1, 22]。因此,本研究选取2个橡胶树无性系幼苗为试验材料,进行不同低温类型的室内低温胁迫处理,对橡胶树不同叶片和茎杆组织进行电导率测定分析,并结合恢复生长法对不同组织器官及无性系间抗寒情况进行比较,探讨在低温逆境下橡胶树幼苗不同组织器官、不同低温类型的抗寒力情况,分析其抗寒性,为研究橡胶树抗寒胁迫的生理响应机制和分子机理提供材料选择和低温处理参考方法,并为进一步研究橡胶树的冷敏感性或耐受机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.1 不同低温处理及对幼苗形态的影响 选取生长至两蓬叶稳定期长势基本一致的‘云研77-4’和‘热研8-79’幼苗置于低温人工气候箱（LRG-1000-LT）中进行低温胁迫处理,18 ℃为橡胶树正常生长的临界温度,≤5 ℃出现不同程度的寒害症状[1],本试验选取首先从常温预冷至18 ℃,之后以4 ℃/h的降温速率降至4 ℃,在4 ℃下进行2、6、20 h的连续低温胁迫处理。分别降温至4、0、-2 ℃后进行不同温度胁迫处理,每个预定温度处理2 h。以28 ℃常温培养为对照（0 h）,光照昼夜时长12 h / 12 h,光照强度设10 000 lx,空气相对湿度75%。2个无性系每处理分别取5株幼苗的叶片和茎杆进行电导率测定,每处理3次重复,处理结束后取出3株未取样的完整幼苗,置于28 ℃下进行恢复培养7 d,并观测幼苗在4 ℃连续低温胁迫后幼苗叶片和茎杆的形态变化。
1.2.2 不同低温处理叶片和茎秆组织相对电导率测定分析 参照郝建军等[25]、杨爱国等[26]的采用电导率仪法测定叶片和茎杆组织相对电导率。低温胁迫处理前用去离子水擦洗幼苗,不同低温类型胁迫处理后分别取第1蓬和第2蓬新鲜叶片,采集叶片的位置基本相同,用直径0.5 cm的圆孔打孔器避开主叶脉切成圆片,每处理3次重复,每重复取80个圆片置于100 mL带盖试管中,加入超纯水20 mL,浸泡24 h,定时振荡。取离叶蓬10 cm处的第1节茎杆和第2节茎杆,避开芽眼,分别剪成3 mm左右的小段,每重复20段置于100 mL带盖试管中,加入超纯水25 mL,浸泡24 h,定时振荡。用雷磁DDS-307型电导率仪测定叶片和茎杆浸出液的电导值（C1）,然后将试管放置于沸水中煮沸30 min,冷却后测定终电导值（C2）。以相对电导率（relative electrical conductivity,REC）表示细胞膜透性的大小。相对电导率REC = C1 / C2×100%。
1.3 数据处理
Excel 2010软件用于进行数据处理及图表绘制,SPSS 20.0统计分析软件用于数据分析,并运用Duncan’s新复极差法对实验数据进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 低温胁迫对橡胶树幼苗形态的影响
不同低温胁迫处理的‘云研77-4’和‘热研8-79’橡胶树幼苗恢复培养7 d后,对幼苗形态变化进行观察,比较2种橡胶树幼苗低温处理后的表型差异（图1）。在4 ℃下连续处理2、6、20 h后观察发现,低温处理2 h后,2个品种植株的叶色和茎杆形态与28 ℃常温培养（对照）相比未见明显差异。处理6 h后（图1A）,‘云研77-4’第1蓬和第2蓬叶仍叶片挺立,未见任何受害症状（图1B）,而‘热研8-79’第1蓬叶失水干枯、冻斑褐变,并伴有叶片脱落现象（图1C）。低温胁迫20 h后（图1D）,2个品种的幼苗生长受到显著影响,‘云研77-4’第2蓬叶与对照相比未见明显差异,第1蓬叶症状明显,叶柄下垂,叶片失绿,冻斑褐变,并有叶片脱落现象（图1E）;‘热研8-79’整株受害症状明显,第1蓬和第2蓬叶叶片完全萎蔫卷曲下垂,失水干枯（图1F）,第2节茎杆失水变褐。
图1 低温胁迫处理对橡胶树幼苗形态的影响A：4 ℃处理6 h;B：‘云研77-4’4 ℃处理6 h的第1蓬叶表型;C：‘热研8-79’4 ℃处理6 h的第1蓬叶表型;D：4 ℃处理20 h;E：‘云研77-4’4 ℃处理20 h的第1蓬叶表型;F：‘热研8-79’4 ℃处理20 h的第1蓬叶表型;G: -2 ℃处理2 h;H：-2 ℃处理2 h恢复培养2周。 Fig. 1 Effects of low temperature stress on morphology of rubber tree seedlings A: Treated at 4 ℃ for 6 h; B: Phenotype of the first-whirl of leaves of ‘Yunyan 77-4’ treated at 4 ℃ for 6 h; C: Phenotype of the first-whirl of leaves of ‘Reyan8-79’ treated at 4 ℃ for 6 h; D: 4 ℃ for 20 h; E: Phenotype of the first-whirl of leaves of ‘Yunyan 77-4’ treated at 4 ℃ for 20 h; F: Phenotype of the first-whirl of leaves of ‘Reyan8-79’ treated at 4 ℃ for 20 h; G: Treated at -2 ℃ for 2 h; H: Treated at -2 ℃ for 2 hours and restored to culture for 2 weeks. |
2.2 4 ℃连续低温胁迫对叶片相对电导率的影响
植物细胞内电解质外渗率的大小即相对电导率,其变化反映了细胞膜透性的改变,相对电导率常用来作为植物细胞膜破坏程度的重要鉴定指标[27],并且与植物的抗寒能力呈负相关[28]。4 ℃连续低温胁迫下橡胶树叶片的相对电导率变化情况见图2,随着处理时间的延长,橡胶树叶片相对电导率逐渐增大,变化规律基本一致。由图2A可见,在整个连续低温胁迫过程中,2个品种间的第1蓬叶相对电导率差异显著。在4 ℃低温胁迫处理2 h时,与对照相比,同一品种的第1蓬叶相对电导率变化均不显著,且处理0 h和2 h时‘云研77-4’相对电导率高于‘热研8-79’。处理时间由2 h延长至6 h时,同一品种叶片相对电导率的变化呈显著差异,‘热研8-79’达到51.65%,‘云研77-4’为33.71%,品种间在表型上亦出现差别,说明‘热研8-79’的电解质渗出率增加幅度大,细胞膜受损大,‘云研77-4’电解质渗出率增加幅度小,细胞膜受损小。处理20 h时,2个品种的相对电导率均急剧上升,‘热研8-79’相对电导率增长速率高于‘云研77-4’,表明随处理时间的延长,‘热研8-79’叶片的反应更加迅速,在此处理时间下叶片细胞膜已受到明显的破坏,与表型结果一致。
由图2B可见,2个品种间的第2蓬叶相对电导率差异显著。低温胁迫处理2 h和6 h时,与对照相比,同一品种的第2蓬叶相对电导率的变化差异均不显著,且处理0 h、2 h和6 h时,‘云研77-4’相对电导率均高于‘热研8-79’。当处理时间延长至20 h时,2个品种叶片相对电导率的变化差异均达到显著水平,‘云研77-4’相对电导率缓慢上升,而‘热研8-79’相对电导率急剧增加,表明‘热研8-79’第2蓬叶片耐寒性弱于‘云研77-4’。
2.3 不同温度胁迫对叶片相对电导率的影响
由图3A和图3B可见,在4 ℃以上的温度处理2 h,相同品种的第1和第2蓬叶片相对电导率与28 ℃（CK）相比均无显著差异,由此说明4 ℃以上温度短时间冷害对橡胶树生长影响较小,叶片细胞膜的破坏不明显。随处理温度的下降,0 ℃低温胁迫下,2个品种的第1蓬叶相对电导率均逐渐升高,品种间第1蓬叶相对电导率的变化差异显著,‘云研77-4’第2蓬叶相对电导率略微下降但差异不显著且品种间无显著差异。-2 ℃处理2 h时,2个品种的叶片相对电导率均急剧增大,叶片组织受到严重伤害,相对电导率均达到90%左右,叶片全部冻死。比较同一品种不同叶蓬间相对电导率的变化（图3C和图3D）,‘云研77-4’第1蓬叶和第2蓬叶在4 ℃以上温度处理时存在显著差异,温度降至0 ℃后,叶蓬间相对电导率的变化差异不显著。‘热研8-79’叶蓬间相对电导率仅在-2 ℃处理2 h时无显著差异。
2.4 4 ℃连续低温胁迫对茎杆相对电导率的影响
从图4可见,2个橡胶树品种的茎杆在4 ℃连续低温胁迫下的相对电导率变化呈缓慢上升趋势。其中,第1节茎杆间差异不显著（图4A）,且在整个连续低温处理中,每个处理时间点的2个品种间电导率变化均无显著差异,与自身对照相比,同一品种在处理6 h和20 h时,相对电导率的变化差异达到显著水平。由图4B可见,2个品种的第2节茎杆在未经低温处理0 h（CK）和处理20 h时,品种之间相对电导率存在显著差异。图4C和图4D显示4 ℃连续低温胁迫下同一品种不同茎秆间相对电导率的变化,在各时间处理下‘云研77-4’不同茎秆间相对电导率无显著差异,处理2 h、6 h和20 h相对电导率与对照相比差异显著。‘热研8-79’处理6 h时不同茎秆间的相对电导率差异显著。
2.5 不同温度胁迫对茎杆相对电导率的影响
从图5可见,不同温度胁迫下2个品种茎杆的相对电导率变化规律基本一致。在各个处理温度下,品种间第1节茎杆的相对电导率无显著差异（图5A）,第2节茎杆在28 ℃（CK）未经低温胁迫时2个品种之间相对电导率差异显著,其余处理温度均无显著差异（图5B）。28 ℃（CK）未经低温胁迫的茎杆本身的相对电导率较高,均在45%以上,0 ℃以上温度处理时,茎杆相对电导率变化在50%左右,电导率的增加幅度较小,当温度由0 ℃降至-2 ℃时,茎杆的相对电导率大幅度增加,均达到90%左右,说明0 ℃以下低温对橡胶树茎杆组织已经造成严重伤害。由图5C和图5D可知,在各处理温度下,‘云研77-4’和‘热研8-79’仅在-2 ℃处理时,不同茎秆间相对电导率变化差异达到显著水平。
3 讨论
本研究结果显示,经不同低温胁迫处理后,橡胶树幼苗叶片和茎杆的膜透性发生变化,随着处理时间的延长和处理温度的下降,细胞内物质外渗率增加,叶片和茎杆组织的伤害程度不断加深,‘热研8-79’和‘云研77-4’幼苗之间的细胞膜稳定性存在明显差异,‘云研77-4’幼苗表现出低温胁迫下细胞膜更好的保护性,恢复培养后‘热研8-79’植株受害程度重于‘云研77-4’,这些结果均说明恢复生长法实验结果与电导法测定橡胶树幼苗抗寒性强弱的结论一致,恢复培养后的寒害症状为通过相对电导率的变化鉴定抗寒性强弱的方法提供了表征依据。田间自然鉴定法显示‘云研77-4’的抗寒性强于‘热研8-79’[11,37],本试验人工低温胁迫比较鉴定结果与其冬春季田间自然低温调查结果高度一致。早期研究表明,在室内低温胁迫中测定出的橡胶树幼苗耐寒力与其田间多年生树抗寒性一致[13,38],但田间自然低温鉴定极易受外界环境的干扰,并且费时费力,此外,橡胶树的寒害程度还与降温类型有着极其密切的关系[22]。本研究将电导法和恢复生长法2种方式相结合,并对不同组织器官进行不同低温类型的人工模拟低温寒害处理抗寒性分析,消除结果的单一片面性,能够缩短常规的田间筛选年限。
植物寒害会产生各种症状,包括发育迟滞,枝条干枯、叶片枯萎、变黄和组织死亡等[39],原产于热带的红果风铃木,经0 ℃和-2 ℃低温处理的幼苗植株在复培中无法恢复,植株死亡[40]。本试验中连续低温胁迫和不同温度胁迫下2种低温类型处理后发现,橡胶树幼苗不同组织器官对低温胁迫响应的敏感度不同,表现为叶片受害早于茎杆,4 ℃处理6 h时幼苗叶片形态及相对电导率发生显著变化,而茎杆组织在处理20 h时,表型及相对电导率变化差异达显著水平。这可能与茎杆在未经低温处理情况下（对照）本身的REC较高有关,且叶片的接触面大于茎杆。此外,幼苗对0 ℃以下的低温耐受力差,不同组织器官细胞内物质外渗率大幅增加,幼苗的生理代谢受到严重影响,-2 ℃时无法恢复生长,整株死亡。两蓬叶稳定期的幼苗第2蓬叶耐寒性强于第1蓬叶,第1蓬叶相对电导率增幅大于第2蓬叶,不同处理间植株的表型差异主要区别于第1蓬叶,经恢复培养后,第1蓬叶大部分干枯脱落。
本研究中选用的橡胶树生长时期为幼苗期,低温胁迫处理温度为4 ℃,研究材料为具有一定抗寒性差异的2个品种,在生长时期、处理温度和品种选择上有一定的针对性和局限性,对于不同抗性的多个品种,其他胁迫温度或胁迫时间及幼苗期以外的生长阶段是否能够得出同样的研究结果还有待进一步探索。此外,人工低温胁迫不能完全反映出自然条件下的寒害情况,自然环境复杂多变,植物生理生化受低温胁迫的影响,因种类、温度、时长以及温度降幅等不同而不同,橡胶树与低温之间亦有着极其错综复杂的关系,针对橡胶树在应对多复合环境因子胁迫的响应还有待深入研究。植物根、茎、叶等不同组织器官的抗寒机制有着很大差异[16],而且橡胶树作为落叶植物,枝条和茎杆的抗寒性强弱决定了越冬的成败,目前对于橡胶树低温应答机制的解析材料主要集中于橡胶树叶片组织[19,20,21],未见对枝条和茎杆等组织器官的研究,因此,在橡胶树抗寒育种研究中,加强对不同组织器官材料的低温应答机制研究,这将有助于进一步丰富橡胶树响应低温的生理和分子调控机制,为橡胶树的抗寒性遗传改良奠定基础。