Pollen Germination and Pollen Tube Growth Characteristics of Succulent Plant <i>Echeveria nodulosa</i>

YANG Lan; ZHANG Chaojun; DU Zhihui; CHEN Zhilin

doi:10.3969/j.issn.1000-2561.2021.02.010

Chinese Journal of Tropical Crops >

2021 , Vol. 42 >Issue 2: 362 - 369

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2021.02.010

Germplasm Resources, Genetics & Breeding

Pollen Germination and Pollen Tube Growth Characteristics of Succulent Plant Echeveria nodulosa

YANG Lan ¹^,² ,
ZHANG Chaojun ¹^,² ,
DU Zhihui ¹ ,
CHEN Zhilin ^,¹^,^*

Expand

1. Institute of Horticulture,Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang, Guizhou 550006, China
2. Shanmao Garden Engineering Technology Co., Ltd., Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang, Guizhou 550006, China

*CHEN Zhilin,E-mail： chenzhilin@126.com。

Received date: 2020-03-05

Request revised date: 2020-04-15

Online published: 2021-02-25

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Abstract

Using the in vitro pollen germination method to study the effects of boric acid concentration, temperature and time on the pollen germination and pollen tube growth of succulent plant Echeveria nodulosa, 10% sucrose+0.5% agar was the basic medium. The effects of boric acid, culture temperature, culture time and interaction effects of the three factors on the pollen germination rate had significant differences. The effects of boric acid, culture temperature and interaction effects between them on the pollen tube elongation were significantly different. Culture temperature had no significant effect on pollen tube growth. 12-28 ℃ was good for improving the germination rate of pollen tube, and 20-36 ℃ was better for the elongation of pollen tube. The three-factor interaction effects showed that 60 mg/L boric acid+12 ℃+16 h was the best condition for the pollen germination of E. nodulosa, with a germination rate of 52.43%. 30 mg/L boric acid+36 ℃+16 h was the suitable condition for the pollen tube growth.

Key words： succulents; Echeveria nodulosa; culture temperature; pollen tube growth

Cite this article

YANG Lan , ZHANG Chaojun , DU Zhihui , CHEN Zhilin . Pollen Germination and Pollen Tube Growth Characteristics of Succulent Plant Echeveria nodulosa[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2021 , 42(2) : 362 -369 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.02.010

多肉植物红司（Echeveria nodulosa）属于景天科（Crassulaceae）拟石莲属（Echeveria）原生种,原产于墨西哥,叶片上分布着奇特的红色纹路,花粉量丰富,花期5—7月。红司能较好适应高低温环境,且观赏性较好,引进国内后进行大量的商品化生产。在育种方面,红司也是一种重要的育种父本材料,曾育出园艺品种E. shaviana× E. nodulosa和E.setosa var. ciliata×E. nodulosa。拟石莲属是景天科中最具有代表性的一个属,其种类比例占到景天科原种的97%,而分布在墨西哥的拟石莲属多肉植物拥有丰富的多样性,85%的物种生长在墨西哥^[1,2]。此外,拟石莲属多肉植物的形态特征具有较高的吸引力,被世界园艺家和收藏家认为是观赏价值很高的园艺植物。

González-Mancera等^[1]通过电镜扫描拟石莲属花粉,发现大多数品种花粉表现出相似的特征,大小为27~42 m,外形为球状或椭圆形,表面具有网状或条形纹饰,但有一些表现出不同的特征,如花粉表面具有孔沟或多个萌发孔。Jimeno-Sevilla等^[3]研究发现拟石莲属植物E. rosea具有一种特殊的蜂鸟授粉系统,在自然条件下可以获得较高的结果率。但实际上拟石莲属的多肉植物被园艺家引种栽培在室内,缺少有效的传粉者,自花授粉结实率普遍较低,只能采取人工辅助授粉方式对其进行遗传改良,形成具有较高观赏价值的园艺新品种。人工授粉的方式可有效提高育种成功率,Parra-Tabla等^[4]研究发现人工授粉E. gibbiflora产生的种子比自然授粉多1.74倍。花粉活力是影响人工授粉成功的关键因素之一,而植物的遗传起源是影响花粉活力的重要因素,突变体或种间杂交高度不育^[2]。低活力的花粉会影响杂交中可存活种子的数量,只有高活力的花粉在柱头上才有较高的萌发率,能快速伸长到达子房成功完成受精,是人工辅助授粉及杂交授粉的重要保障,因此,研究花粉的活力对育性和结实率具有重要意义^[5,6]。在研究花粉活力的过程中,离体萌发法被认为是检测花粉活力快速、可靠且稳定的方法,检测结果与在柱头上的花粉活力相似^[7]。本研究为了摸清多肉植物红司花粉活力及花粉管生长特性,以便育种上能更加高效地运用红司培育新品种,采用离体萌发法研究硼酸浓度、培养温度、培养时间三因素及其相互间的交互效应对于红司花粉萌发率及花粉管生长的影响,以期筛选出花粉萌发及花粉管生长的最佳培养条件,揭示红司花粉育性,从而提高育种效果和加速育种过程,并为多肉植物育种方提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料红司为2015年引种种植于贵州省农业科学院园艺研究所多肉种质资源保育棚。取样植株的种植年限为4年,选取发育正常、长势健壮、无病虫害且生长情况接近的红司5株,并分别编号为1~5号,插上标签。取材时间为2019年7月,晴天早上9：00—10：00之间,分别采集1~5号红司植株花朵,每株植株采集5朵,采集的花粉均为花朵刚开放且柱头出现粘液时期的花粉。

1.2 方法

1.2.1 花粉离体培养用镊子将花粉轻轻剥落至滴有蒸馏水的离心管中混匀制成悬浮液。以0.5%琼脂（Agar）+10%蔗糖（Sucrose）为基础培养基,添加不同浓度的硼酸,制成的培养基倒入玻璃培养皿中冷却凝固。分别取100 µL的花粉悬浮液滴入固体培养基中,置于恒温培养箱内进行不同处理的暗培养。将培养基置于显微镜进行观察,统计花粉萌发率和测量花粉管长度。空白对照CK为0.5%琼脂（Agar）+10%蔗糖（Sucrose）为基础培养基,滴入花粉悬浮液后不培养直接观察。

1.2.2 硼酸浓度设置变量因素A为硼酸。分别添加A1（0 mg/L）、A2（30 mg/L）、A3（60 mg/L）、A4（100 mg/L）4种浓度水平的硼酸。

1.2.3 培养温度设置变量因素B为培养温度,设定为5种水平,设计覆盖了低中高3个温区,分别是B1（12 ℃）、B2（20 ℃）、B3（28 ℃）、B4（36 ℃）、B5（44 ℃）。

1.2.4 培养时间设置变量因素C为培养时间,设定为4种水平,分别是C1（1 h）、C2（3 h）、C3（16 h）、C4（24 h）。

1.2.5 离体萌发率统计和花粉管长度的测量试验设计为三因素多水平处理,4×5×4共80个组合。在显微镜下随机观察,以花粉管长度大于花粉直径为花粉萌发标准^[8]。每个组合重复3次,每次的观察视野为3个。每个组合观察视野的花粉粒总数为350~780粒,统计花粉萌发率（花粉萌发率=萌发的花粉数/花粉粒总数×100%,结果取平均值）。同时,用显微镜微尺测量花粉管长度,每个组合观察视野的花粉管数量为30~80个,计算其平均值。

1.3 数据处理

利用Excel软件进行数据整理,用SAS 9.0软件对组合进行差异显著性、多元相关性及聚类分析。

2 结果与分析

2.1 三因素对红司花粉萌发率的影响

如表1所示,硼酸浓度、培养温度、培养时间对红司花粉萌发率均有极显著影响。空白对照CK的花粉萌发率仅为3.71%。从表2可见,60 mg/L硼酸浓度下花粉萌发率最高,为15.87%。12 ℃低温条件下花粉萌发率最高,为21.86%;花粉萌发率随着培养温度的升高而降低,44 ℃高温下会抑制花粉萌发。培养16 h,花粉萌发率达到最大值18.70%,显著高于其他3个时间点;培养时间增加至24 h时,观察视野中许多花粉管出现破裂,扭曲交缠,不利于统计萌发数量,导致萌发率在数据上出现下降。

表1 三因素对红司花粉萌发率影响的方差分析

Tab. 1 Variance analysis of three factors affecting pollen germination

变量因素Variable factor	自由度df	均方差 Mean square	F	P
A	3.00	920.66	27.42	<0.0001
B	4.00	9882.05	294.31	<0.0001
C	3.00	2325.34	69.25	<0.0001
A*B	12.00	2057.95	61.29	<0.0001
A*C	9.00	109.47	3.26	0.0007
B*C	12.00	827.01	24.63	<0.0001
ABC	36.00	179.55	5.35	<0.0001

表2 三因素对红司花粉萌发率的影响

Tab. 2 Effects of there factors on in vitro pollen germination

因素A Fator A				因素B Fator B			因素C Fator C
水平 Lever	硼酸浓度 Boric acid concentration/(mg·L^-1)	萌发率Germination rate/%		水平 Lever	培养温度 Culture temperature/℃	萌发率Germination rate/%	水平 Lever	培养时间 Culture time/h	萌发率Germination rate/%
A3	60	15.87^a	B1		12	21.86^a	C3	16	18.70^a
A4	100	15.64^a	B2		20	18.65^b	C2	3	16.11^b
A1	0	15.58^a	B3		28	18.20^c	C4	24	13.57^b
A2	30	11.44^b	B4		36	13.97^d	C1	1	10.43^c
			B5		44	0.84^e

	注：同列数据不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。
	Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference between different treatments (P<0.05).

从表3可见：60 mg/L硼酸+12 ℃培养3 h、16 h,花粉萌发率达到48.59%、52.43%;两因素的组合中,60 mg/L硼酸+12 ℃（A3B1）的培养条件下,萌发率为38.43%,显著高于其他水平组合;硼酸浓度与时间的最佳组合为60 mg/L硼酸+16 h（A3C3）,萌发率为20.67%;培养温度与时间的最佳组合为培养12 ℃+16 h（B1C3）,萌发率为31.43%。硼酸酸浓度、培养温度、培养时间三因素组合条件下花粉的萌发率大于双因素组合。

表3 三因素交互效应对红司花粉萌发率影响

Tab. 3 Effects of three-factor interaction on pollen germination rate

编号 Number	ABC组合abc combination		AB组合ab combination		AC组合ac combination		BC组合bc combination
编号 Number	组合 Combination	萌发率 Germination rate/%	组合 Combination	萌发率 Germination rate/%	组合 Combination	萌发率 Germination rate/%	组合 Combination	萌发率 Germination rate/%
1	A3B1C3	52.43	A3B1	38.43	A3C3	20.67	B1C3	31.43
2	A3B1C2	48.59	A1B3	26.78	A1C3	20.20	B1C2	25.98
3	A3B1C4	38.02	A4B1	23.65	A4C3	20.11	B2C3	25.13
4	A1B3C3	35.65	A1B2	23.10	A4C2	18.73	B3C3	23.38
5	A4B1C3	34.31	A4B3	20.70	A3C2	17.17	B1C4	23.15
6	A2B2C3	31.08	A2B2	20.32	A1C4	16.91	B4C2	18.68
7	A4B1C2	31.04	A4B2	18.97	A4C4	16.27	B2C2	18.32
8	A4B3C3	28.02	A4B4	18.97	A3C4	16.23	B3C4	18.04
9	A4B2C3	26.61	A1B4	15.93	A1C2	16.05	B2C4	17.12
10	A1B2C3	26.47	A3B2	14.30	A2C3	15.37	B3C2	15.18

	注：由于组合过多,仅展示前10组组合。
	Note: Because there are too many combination, only the first 10 groups of combination are displayed.

2.2 三因素对红司花粉管生长的影响

硼酸浓度和培养温度及二者间的交互效应对花粉管生长存在极显著影响（表4）。空白对照CK的红司花粉管平均长度仅为44.40 μm。培养基中加入不同浓度的硼酸可促进花粉管生长,30 mg/L硼酸浓度为最佳处理水平,花粉管平均长度达到223.22 μm（表5、图1）。低温对花粉管的伸长有抑制作用,12 ℃低温培养下花粉管生长过慢,平均长度值仅为100.2 μm,20~36 ℃为红司花粉管生长适宜温度区间（表5、图2）;培养时间对花粉管生长的影响并不显著（表4）,培养时间3~16 h为花粉管快速生长阶段,培养16 h时花粉管平均长度达到194.33 μm（表5）。

表4 三因素对红司花粉管生长影响的方差分析

Tab. 4 Variance analysis of three factors affecting pollen tube growth

变量因素Variable factor	自由度 df	均方差 Mean square	F	P
A	3	92 853.09	6.10	0.0007
B	4	67 046.42	4.40	0.0025
C	3	28 297.26	1.86	0.1411
A*B	12	52 053.77	3.42	0.0003
A*C	9	14 355.83	0.94	0.4917
B*C	12	111 130.29	0.61	0.8313
ABC	36	360 662.13	0.66	0.9238

表5 三因素对红司花粉管生长影响

Tab. 5 Effects of there factors on in vitro pollen tube growth

因素A Fator A				因素B Fator B			因素C Fator C
水平 Lever	硼酸浓度 Boric acid concentration/(mg·L^-1)	花粉管长度 Pollen tube length/μm		水平 Lever	培养温度 Culture temperature/℃	花粉管长度 Pollen tube length/μm	水平 Lever	培养时间 Culture time/h	花粉管长度 Pollen tube length/μm
A2	30	223.22^a	B3		28	215.44^a	C3	16	194.33^a
A3	60	157.14^b	B2		20	197.85^ab	C4	24	178.35^ab
A4	100	157.52^b	B4		36	169.65^ab	C2	3	148.14^ab
A1	0	113.37^b	B5		44	130.91^bc	C1	1	130.42^b
			B1		12	100.20^c

	注：同列不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。
	Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference between different treatments (P<0.05).

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图1 红司花粉管在不同硼酸浓度下的生长情况

A：CK对照;B~F：不同硼酸浓度培养基上20 ℃培养3 h的花粉管生长;B~D：硼酸30 mg·L^-1;E：硼酸60 mg·L^-1;F：硼酸100 mg·L^-1;A~F是在10倍物镜下拍摄的照片。

Fig. 1 Growth of E. nodulosa pollen tube under different boric acid concentration

A: CK control; B-F: Pollen tube growth at 20 ℃ for 3 h on different boric acid concentration medium; B-D: 30 mg·L^-1 boric acid concentration; E: 60 mg·L^-1 boric acid concentration; F: 100 mg·L^-1 boric acid concentration; A-F are taken at 10× objective image.

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图2 红司花粉管在不同培养温度下的生长情况

A~F：硼酸浓度为30 mg·L^-1,不同温度培养3 h的花粉管表现;A：12 ℃培养;B：20 ℃培养;C~D：28 ℃培养;E：36 ℃培养;F：44 ℃培养;A~D、M是在10倍物镜下拍摄的图片,E是在4倍物镜下拍摄的图片。

Fig. 2 Growth of E. nodulosa pollen tube under different culture temperatures

A-F: Pollen tube growth with boric acid concentration of 30 mg·L^-1 for 3 h at different temperatures; A: 12 ℃ culture; B: 20 ℃ culture; C-D: 28 ℃ culture; E: 36 ℃ culture; F: 44 ℃ culture; A-D, F are taken at 10× objective image and E are taken at 4× objective image.

低浓度硼酸在高温培养条件下对花粉管伸长有促进作用。30 mg/L硼酸在36 ℃条件下分别培养3、16、24 h,花粉管平均长度分别达到了453.16、527.74、571.52 μm（表6）,但培养24 h后400 μm以内花粉管数量明显减少（表7）,不利于授粉成功率提高,因此,花粉管生长最佳处理水平为A2B4C3。

表6 三因素交互效应对红司花粉管生长影响

Tab. 6 Effect of three factors interaction on pollen tube growth

编号Number	ABC组合ABC combination		AB组合AB combination		AC组合AC combination		BC组合BC combination
编号Number	组合Combination	花粉管长度 Pollen tube length/μm	组合Combination	花粉管长度 Pollen tube length/μm	组合Combination	花粉管长度 Pollen tube length/μm	组合Combination	花粉管长度 Pollen tube length/μm
1	A2B4C4	571.52	A2B4	382.61	A2C3	281.56	B3C3	228.66
2	A2B4C3	527.74	A4B3	265.18	A2C4	277.26	B4C4	219.04
3	A2B4C2	453.16	A3B2	229.13	A4C3	202.02	B4C2	215.41
4	A4B3C1	412.80	A2B3	192.74	A2C2	188.47	B4C3	211.22
5	A4B3C3	405.65	A2B2	184.46	A3C4	168.08	B2C4	204.74
6	A3B2C2	330.14	A4B2	180.11	A3C2	167.58	B3C4	201.46
7	A2B3C3	319.21	A3B5	160.14	A4C4	157.97	B2C3	199.08
8	A2B3C4	308.62	A2B5	140.18	A3C1	134.19	B2C2	166.16
9	A4B3C4	283.07	A3B3	133.36	A2C1	131.98	B2C1	150.38
10	A3B2C4	280.50	A1B3	126.68	A1C3	129.51	B3C1	144.59

	注：由于组合过多,仅展示前10组组合。
	Note: Because there are too many combination, only the first 10 groups of combination are displayed.

表7 不同处理下花粉管长度的聚类分析

Tab. 7 Cluster analysis of pollen tube length under different treatments

分类 Classification	编号 Number	硼酸浓度 Boric acid concentration /(mg·L^-1)	培养温度 Culture temperature /℃	培养时间 Culture time/h	200 μm以内的花粉管Number of pollen tubes <200 μm	200~400 μm以内的花粉管Number of pollen tubes 200-400 μm	400~1100 μm的花粉管Number of pollen tubes 400-1100 μm
第1类	OB34	30	36	3	15	12	38
	OB35	30	36	16	3	8	33
	OB36	30	36	24	1	4	35
第2类	OB25	30	20	1	57	22	9
	OB65	100	20	1	79	24	7
	OB66	100	20	3	67	15	5
	OB42	60	12	3	68	15	2
	OB26	30	20	3	76	12	0
	OB5	0	20	1	80	8	0
	OB21	30	12	1	78	6	0
	OB22	30	12	3	84	3	0
	OB4	0	12	24	87	0	0
第3类	其他组合

2.3 三因素的交互效应对花粉管生长影响的聚类分析

采用类平均法将OB1~OB80共80个组合聚为3类,阈值为1.3193。如表7所示：第1类中,花粉管长度在400~1100 μm的花粉比例最高,平均数量为35.3个,200~400 μm的花粉平均数量为8.0个,200 μm以内的花粉平均数量为6.3个;第2类中,200 μm以内的花粉比例最高,平均数量为75.1个;其次为200~400 μm,花粉平均数量为11.7个,400~1100 μm的花粉仅为2.6个。第3类中,花粉管长度主要在200 μm,平均数量为30.45个,其次为200~400 μm的花粉,平均数量为5.7个,400~1100 μm的花粉平均数量为2.9个。说明30 mg/L硼酸在36 ℃培养3~16 h后,对花粉管的伸长有明显的促进作用。

2.4 三因素与红司花粉萌发和花粉管生长的相关性

硼酸浓度、培养温度、培养时间多个变量对花粉萌发和花粉管生长影响的相关性分析发现（表8）：花粉萌发率与培养温度呈极显著负相关（P<0.01）,相关系数值为-0.6044;花粉萌发率、花粉管生长与硼酸浓度和培养时间均呈正相关关系,但相关性均不显著。两组变量的典型相关性分析也得到了相同结果,证实多个变量因素中培养温度（B）与花粉萌发率（y）极显著相关,逐步回归分析获得二者的最优方程y=31.06-0.58 B（R²=0.3773）,方程极显著（P<0.01）。说明温度是影响红司花粉萌发率最主要的因素,随着温度的增加,花粉萌发率表现为下降。此外,一定范围内硼酸浓度值对萌发和花粉管生长是有利的。

表8 三因素与红司花粉萌发率及花粉管长度间的相关系数

Tab. 8 Correlation coefficient of there factors on in vitro pollen germination and pollen tube growth

相关系数 Correlation coefficient	变量 Variable	硼酸浓度 Boric acid concentration	培养温度 Culture temperature	培养时间 Culture time
简单相关系数	萌发率	0.0642	-0.6044^**	0.0887
简单相关系数	花粉管长度	0.0598	0.0440	0.1985
偏相关系数	萌发率	0.0810	-0.6080^**	0.1116
偏相关系数	花粉管长度	0.0610	0.0450	0.1991
复相关系数	萌发率	y = 31.06-0.58B (R²=0.3773)
复相关系数	花粉管长度

	注：^**表示相关性极显著（P<0.01）。
	Note: ^** indicates extremely significant correlation (P<0.01).

3 讨论

影响花粉离体萌发率的因素除了培养基、温度、硼酸浓度等因素外,还应该考虑取材的一致性,应尽量减少取材的次数,取回的多个花朵制成花粉混合悬浮液,让每个处理都能在材料上保持基本一致。另外,较少的处理组合很难反应花粉萌发及花粉管生长的真实状况,应尽量采用多因素多水平组合处理。0.5%琼脂（Agar）+10%蔗糖（Sucrose）为基础培养基,滴入花粉悬浮液后不培养直接观察,可摸清楚花粉在培养前的萌发状态。本试验中,花粉在空白对照处理下花粉有3.71%极少量的萌发,花粉管平均长度仅为44.40 μm。

硼元素对花粉管生长具有调节作用,在构建花粉细胞壁方面发挥作用,同时可能作为一种相关因子影响关键酶活性,改变细胞壁多糖网状结构以至细胞壁的延展性^[9]。近年研究表明培养基中添加一定浓度硼酸有利于花粉萌发生长^[10,11,12]。杜纪红等^[13]认为不同植物种类的花粉萌发和花粉管生长所需的最适硼酸浓度不同：如培养黄薇花粉适宜硼酸浓度为500~1000 mg/L^[14];150 mg/L硼酸能显著提高福鼎大白茶花粉萌发率^[15];王玉林等^[16]发现添加100 mg/L硼酸可使火龙果花粉离体萌发率显著提高59.75%,而花粉管生长需要500 mg/L高浓度的硼酸;因此有必要对不同的植物开展研究。本研究结果表明,多肉植物红司花粉萌发适宜的硼酸为60~100 mg/L,而花粉管的伸长仅需要30 mg/L低浓度的硼酸,随着浓度的增加,花粉管生长受到抑制。

除了硼酸之外,温度是影响萌发率及花粉管生长的重要因素,本实验设置的处理温度范围为12~44 ℃,从低温区覆盖至高温区,数据分析结果显示不同水平的温度处理对花粉萌发和花粉管生长影响差异极显著（P<0.01）。不同植物种类适宜花粉萌发的温度有差异。地被菊的花粉适宜萌发温度只有10~15 ℃^[17],梅花等早春开花植物花粉萌发最佳温度20 ℃左右^[18],茉莉花粉最佳培养温度为25~30 ℃^[19],即使种内不同品种的花粉适宜萌发温度也有较大差异,实验室前期研究发现,拟石莲属一些早开花品种如‘花月夜’‘灵隐’的花粉在15 ℃低温离体培养下花粉活力较高,平均萌发率分别达到66.67%、29.51%。而品种‘莎维娜’的花粉在30 ℃高温培养下花粉萌发率达到26.67%。因此有必要针对重要的育种材料开展研究。红司花粉萌发的适宜温度范围较广,试验表明12~28 ℃温度下花粉萌发率均较高,其中12 ℃低温条件下花粉萌发效果最佳（21.86%）;12 ℃是本试验设置的低温,如果温度更低,萌发率有可能更高,因此可以在实际育种工作中,尝试更低温度处理红司花粉。相关性分析发现温度与萌发率呈负相关,与花粉管长度呈正相关,说明花粉萌发和花粉管生长可能需要不同的温度条件。本试验中,12~28 ℃培养有利于提高花粉管萌发率,20~36 ℃有利于花粉管的伸长,与蒿柳研究结果类似^[20]。这对多肉植物育种可能有很好的指导作用,可以尝试前期低温诱导花粉大量萌发后,提高培养温度促进花粉管伸长。

不同植物种类花粉管生长适宜观察的培养时间存在差异。海仙花花粉培养6 h花粉管生长最快,状态最好^[21];矾根‘红妆魅影’培养时间达到2 h时,矾根花粉管发生明显伸长^[22];野杏花粉离体培养最佳时间为6 h^[23]。本研究为了探明红司花粉在24 h内萌发及花粉管生长情况,同时基于试验的可操作性。从早上9点取新鲜花粉处理后,放在不同处理下分别培养1、3、16、24 h,取出观察拍片。数据分析结果表明：时间是影响红司花粉萌发率的极显著因素（P<0.01）,对花粉管长度影响则不显著（P>0.05）。空白对照中红司花粉有3.71%少量萌发,平均花粉长度为44.40 μm。处理1 h后花粉的平均萌发率升高至10.43%,花粉管长度为130.42 μm。随着培养时间的延长,3~16 h花粉萌发率迅速提高,花粉管生长加快。培养至16 h,平均萌发率（18.70%）与花粉管长度（194.33 μm）均达到最大值。培养时间的增加有利于花粉萌发率的上升及花粉管的伸长,但时间过长,部分已萌发的花粉出现花粉管破裂,扭曲交缠,不利于数据统计,这也是花粉在培养24 h之后萌发率在数据上出现下降原因之一。综上所述,红司花粉离体培养适宜的观察时间可能在3~16 h之间,需要在实际育种工作中进一步缩小变量范围,摸索最佳观察时间。

方差分析显示,硼酸浓度、培养温度、培养时间及交互效应对花粉萌发率的影响差异极显著,60 mg/L硼酸+12 ℃+16 h培养下,萌发率达到最大值52.43%,极大的提高了花粉萌发率。硼酸浓度、培养温度及交互效应对花粉管伸长的影响极显著。培养基中添加30 mg/L硼酸36 ℃培养3~24 h后,400~1100 μm长度的花粉管比例最高,平均数量为35个,平均花粉管长度为3 h：453.16 μm、16 h：527.74 μm、24 h：571.52 μm,培养24 h虽然花粉管平均长度值最大,但400 μm以内的花粉管数量仅为5个,不利于提高授粉成功率。综合分析认为60 mg/L硼酸+12 ℃+16 h （A3B1C3）为红司花粉萌发较理想条件,30 mg/L硼酸+36 ℃+16 h（A2B4C3）为红司花粉管生长的适宜条件。

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