辣木（Moringa oleifera Lam.）属辣木科（Moringaceae）辣木属（Moringa）,是一种热带落叶树,原产于印度北部和非洲地区,现广泛分布于热带和亚热带地区,在中国广东、广西、云南、海南等省均有种植[1]。辣木喜光、耐干旱且耐贫瘠,对降雨量和土壤等自然条件具有很强的适应性,易存活且生长迅速,具有相当的生产规模[2]。辣木籽是辣木营养成分和经济价值较高的部位之一,具有高蛋白、高油脂的特点,含有丰富的维生素、甾醇、生育酚、氨基酸和微量元素[3,4],能起到抗衰老、美白、调节免疫功能、抗紫外线、抗肿瘤、降低血糖和降低心血管疾病风险等作用,具有较大的食用和药用的前景[5,6]。其中,辣木籽脂肪含量为35%~40%,高于常用的食用油加工原料大豆（约20%）[7]。有研究表明,辣木籽油含有丰富的油酸（约76%）和棕榈酸（约12%）,可作为橄榄油的替代品,或用于化妆品等领域[8]。此外,辣木籽中还含有约35%的蛋白质,远高于花生（约23%）、葵花子（约20%）、腰果（约21%）等坚果种子蛋白,且辣木籽蛋白富含人体所需的必需氨基酸,是一种较为优质的蛋白质[9]。目前,国内外对于辣木籽的研究主要集中在辣木籽油的提取工艺优化及组分分析[10]、辣木籽在净化污水中的应用[11]、辣木籽蛋白的提取工艺优化[12]、辣木籽的抗氧化活性[13]等,而对于食品工业中榨油后的含有丰富蛋白质的辣木籽渣研究甚少,导致辣木籽渣被废弃或停留在作为动物饲料等初级利用阶段。因此,为提高资源的综合利用,增加辣木籽渣的附加值,提取辣木籽渣中蛋白并对其基本性质进行表征具有重要的意义。
本研究主要采用Osborne四步法从辣木籽渣中提取清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白,并对各组分蛋白的理化性质和功能特性进行研究,为提高辣木籽渣的综合利用以及其组分蛋白的精深加工提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 辣木籽渣,由河南金辣木生物科技有限公司提供;纯净水,由德国达姆施塔特Millipore公司Milliq Integral 3系统生产;大豆油,购自本地超市;氯化钠、硫酸铵、无水乙醇、氢氧化钠、盐酸等化学试剂均为分析纯。
1.1.2 仪器与设备 UV1780紫外可见分光光度计,日本Shimadzu 公司;FJ200-SH高速分散机,上海沪析有限公司;LC-20A低温高速离心机,德国Sigma公司;Christ Alpha 1-4/2-4 LD plus冻干机,德国Marin Christ公司;FE20-Five Easy Plus™ pH计,瑞士Mettler Toledo 公司;KjeltecTM 8400自动凯氏定氮仪,福斯华（北京）科贸有限公司;HH.601恒温水浴锅,金坛市恒丰仪器制造有限公司;DF-101S集热式恒温磁力搅拌器,巩义市予华仪器有限责任公司。
1.2 方法
1.2.1 辣木籽渣脱脂粉的制备 将一定量色泽均匀的辣木籽渣在万能粉碎机中粉碎15 s,重复3次后过60目筛,放置于干燥器中,备用。将粉碎后的辣木籽渣与沸程30~60 ℃石油醚按1∶8的料液比混合,在室温下磁力搅拌8 h,过滤,重复脱脂3次,干燥,得到辣木籽渣脱脂粉。
1.2.2 辣木籽渣组分蛋白的提取 组分蛋白的提取参考Osborne四步法[14]。称量一定质量的辣木籽渣脱脂粉,与10倍体积0.15 mol/L NaCl溶液混合,在室温下磁力搅拌2 h,4800 r/min离心后收集上清液,重复提取1次,合并上清液。上清液用硫酸铵调至25%的饱和度,静置1 h后离心,去除沉淀,继续加入硫酸铵使溶液硫酸铵饱和度达到80%,静置1 h,离心,收集沉淀。沉淀在4 ℃下透析5 d,离心,上清液即为清蛋白,沉淀为球蛋白。氯化钠溶液提取后的残渣依次用70%乙醇溶液、0.1 mol/L NaOH溶液按照上述步骤提取,得到醇溶蛋白、谷蛋白。
1.2.3 提取率及营养成分的测定 蛋白质含量（蛋白质纯度）测定采用GB/T 5009.5—2010的凯氏定氮法（蛋白质换算系数F为6.25）;粗脂肪含量测定采用GB/T 14772—2008的索氏提取法;水分含量测定采用GB 5009.3—2010的直接干燥法。
蛋白质提取率按下式计算∶
$\text {提取率}=\frac{C_{1} \times m_{1}}{C_{0} \times m_{0}} \times 100 \%$
式中：C0为辣木籽渣的蛋白质含量,m0为提取辣木籽渣的质量,C1为提取蛋白的纯度,m1为提取得到的蛋白质质量。
1.2.4 SDS-PAGE SDS-PAGE参照Ma等[15]的方法稍加修改。在SDS-Tris-甘氨酸间断缓冲体系使用4%~20%梯度凝胶进行测定。蛋白样品用磷酸缓冲液稀释至1.5 mg/mL。用移液枪吸取30 μL蛋白质样品液与10 μL上样缓冲液混合,沸水浴7 min,离心,得到蛋白样品上清液。分别在凝胶道中加入10 μL蛋白样品上清液和SDS-PAGE标品,在恒压120 V下进行电泳,直到溴酚蓝染料的前沿迁移至距凝胶下端约1 cm时,结束电泳。用5 g/L考马斯亮蓝（R-250）染色2 h,在脱色液中脱色1 h。
1.2.5 溶解性的测定 溶解性的测定参考Adebiyi等[16]的方法稍加修改。分别称取一定质量的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白,配置浓度为1%的蛋白质溶液后,用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液调节pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,离心,得到样品溶液。以牛血清蛋白为标品,用考马斯亮蓝G-250法测定上清液中蛋白质的含量。
1.2.6 持油性的测定 持油性的测定参考李晓明等[17]的方法稍加修改。称取0.50 g清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白于10 mL离心管中,用移液枪加入2 mL大豆油,振荡1 min;分别置于5、25、45、65、85 ℃水浴锅水浴30 min,4800 r/min离心10 min,弃去上层大豆油,称重,根据以下公式计算蛋白质持油性。
$\text { 持油性 }(\mathrm{g} / \mathrm{g})=\frac{m_{1}-m_{0}}{m_{0}}$
式中：m0为样品干质量,m1为离心后残留物质量。
1.2.7 乳化性及乳化稳定性 乳化性及乳化稳定性参考Zhang等[18]的方法稍加修改。分别制备2%的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白,按20∶1的体积比加入大豆油,均质。立即吸取底部的乳状液50 μL,并用1% SDS溶液稀释100倍;10 min后,再一次取样。以0.1% SDS溶液为空白,在500 nm下测定吸光值。乳化性（emulsifying activity index,EAI）、乳化稳定性（emulsifying stability index,ESI）计算公式如下∶
$\mathrm{EAI}\left(\mathrm{m}^{2} / \mathrm{g}\right)=\frac{2 \times 2.303 \times A_{0} \times D}{C \times(1-\theta) \times L \times 10^{4}}$
$\mathrm{ESI}(\min )=\frac{10 \times A_{0}}{A_{0}-A_{10}}$
式中：D是稀释倍数（100）,C是初始蛋白浓度（g/mL）,L是光程（1 cm）,θ是形成乳液的油的体积分数（0.048）,A0和A10分别是在0 min和10 min时测的稀释后的乳化液的吸光值。
1.2.8 起泡性及泡沫稳定性 起泡性及泡沫稳定性的测定参考Kaushik等[19]的方法并稍加修改。分别称取0.1 g的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白于100 mL量筒中,加入30 mL蒸馏水溶解,磁力搅拌30 min,高速匀浆机搅打1 min,静置,分别读取0、5、10、30、60、90、120、180 min的泡沫体积。起泡性和泡沫稳定性的计算公式如下∶
$\text { 起泡性 }=\frac{V_{1}-V_{0}}{V_{0}} \times 100 \%$
$\text { 泡沫稳定性 }=\frac{V_{\mathrm{t}}-V_{0}}{V_{1}-V_{0}} \times 100 \%$
式中：V0为搅拌均质前溶液体积,V1为0 min时测得的体积,Vt为搅拌均质后不同时间点测得的体积。
1.3 数据处理
每组试验均进行了3次重复。采用SSPS17.0软件进行方差分析（P<0.05）,数据以平均值±标准差表示,采用Origin 8.5软件作图。
2 结果与分析
2.1 辣木籽渣组分蛋白的提取率及基本成分
辣木籽渣组分蛋白的提取率及基本成分分析结果见表1。清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白的提取率分别为10.34%、0.69%、3.40%、3.65%, 清蛋白是辣木籽渣蛋白的主要成分。辣木籽渣中各组分蛋白的粗脂肪含量均低于1%,说明使用石油醚能较好地去除辣木籽渣的脂肪,且蛋白纯度均高于82%,说明提取得到的辣木籽渣组分蛋白杂质较少。
表1 辣木籽渣组分蛋白提取率及基本成分Tab. 1 Determination of component proteins extraction rate and basic composition of moringa seed residue % |
| 组分蛋白 Component proteins | 提取率 Extraction rate | 纯度 Purity | 粗脂肪 Crude fat | 水分含量 Moisture content |
|---|---|---|---|---|
| 清蛋白 | 10.34±0.090a | 83.21±0.16a | 0.085±0.0060a | 8.20±0.51a |
| 球蛋白 | 0.69±0.005b | 84.01±0.30b | 0.020±0.0015b | 7.71±0.68ab |
| 谷蛋白 | 3.40±0.018c | 82.12±0.15c | 0.320±0.0091c | 4.46±0.34c |
| 醇溶蛋白 | 3.65±0.046d | 82.53±0.12c | 0.065±0.0035d | 7.15±0.41b |
注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference (P<0.05). |
2.2 SDS-PAGE
辣木籽渣中各组分蛋白在非还原条件下测定的SDS-PAGE图谱如图1所示。结果表明辣木籽渣中各组分蛋白的组成差异较大;球蛋白的分子量范围在15~20 kDa,谷蛋白的分子量集中在5~20 kDa,清蛋白的分子量范围在5~25 kDa,且清蛋白的蛋白条带的浓度最大,醇溶蛋白未检测出。
2.3 溶解性
辣木籽渣组分蛋白的溶解性如图2所示。在不同的pH条件下,4种蛋白的溶解曲线有明显的差异,且清蛋白均表现出了较好的溶解性（≥67.04%）。清蛋白在pH 4.0时溶解性最高,达到86.19%,随着pH的升高,溶解性变小;而谷蛋白则相反,在pH 4.0时,谷蛋白的溶解性最低（43.64%）。醇溶蛋白的溶解性曲线呈小U型,在pH 5.0时溶解性最低（17.08%）;球蛋白在pH 5.0时溶解性最高（28.17%）,在pH 8.0时溶解性最低（13.62%）。
2.4 持油性
辣木籽渣中各组分蛋白在不同温度下的持油性结果如图3所示,在常温下（25 ℃）球蛋白的持油性最好,其次是谷蛋白和清蛋白,醇溶蛋白的持油性最差。在低温（5 ℃）下,谷蛋白的持油性随着温度的升高稍微减少,在25 ℃达到最低点（8.15 g/g）,之后随着温度的升高持油性升高。球蛋白恰好与谷蛋白相反,在25 ℃时达到最高点（9.32 g/g）,且与其他组分蛋白相比,球蛋白受温度的影响较小。清蛋白的持油性先随着温度的升高而减少,在45 ℃时持油性达到最低点（6.72 g/g）;之后,随着温度的升高,清蛋白的持油性增加,在85 ℃时持油性达到10.69 g/g。醇溶蛋白在5 ℃的低温下,持油性最小,为4.14 g/g。
2.5 乳化性及乳化稳定性
表2 辣木籽渣组分蛋白的乳化性及乳化稳定性Tab. 2 Emulsifying activity index and emulsifying stability index of moringa seed residue component proteins |
| 组分蛋白 Component proteins | 乳化性 Emulsifying activity index/(m2·g-1) | 乳化稳定性 Emulsifying stability index/min |
|---|---|---|
| 清蛋白 | 10.12±0.69a | 24.54±0.70a |
| 球蛋白 | 8.22±0.66b | 16.51±0.23b |
| 谷蛋白 | 9.46±0.12a | 20.69±0.26c |
| 醇溶蛋白 | 1.74±0.17c | 15.96±0.69b |
注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 | |
Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant differences (P<0.05). |
2.6 起泡及泡沫稳定性
3 讨论
植物蛋白因具有持油性、乳化性、起泡性等性能,已成为食品工业加工中必不可少的部分。寻找新型的植物蛋白资源代替动物蛋白是现今研究的热点方向。辣木籽中含有较高的蛋白质（达35%）[9],但现有的加工方式主要是提取其油脂,蛋白在榨油后的籽渣中并未得到很好的利用。采用Osborne四步法可解析植物蛋白中各组分蛋白的功能性质,为针对性提取组分蛋白并加工利用提供技术指导。
蛋白质溶解性能反映蛋白溶解和聚集的情况,也是反映蛋白质在水油界面吸附和迁移速度的基本指标,因此探究蛋白质在不同pH下的溶解度对其在食品工业中的应用有一定的指导意义[22]。本研究结果显示,在不同的pH条件下,辣木籽渣中清蛋白表现出了良好的溶解性（≥67.04%）,高于其他3种组分蛋白,这一结果与非洲山药种子[23]相类似,也与澳洲坚果蛋白[14]在各pH下溶解度均大于60%相类似,但当pH<7时辣木籽渣清蛋白的溶解度（74.62%~86.19%）较澳洲坚果蛋白（60%~70%）要高,较为耐酸。蛋白质在等电点附近的相互作用会增强,静电斥力下降,导致蛋白质发生沉淀或聚集,出现较低的溶解性。4种辣木籽渣组分蛋白在不同的pH条件下出现最低溶解度,这可能是组分蛋白的等电点各不相同导致的。辣木籽谷蛋白的溶解性优于澳洲坚果谷蛋白的溶解性,而清蛋白的溶解性则与之相当[14]。球蛋白和醇溶蛋白的溶解性较差,可能是因为其疏水氨基酸的含量较高,限制了蛋白质分子与水的相互作用。
持油性表示蛋白质与油脂结合的能力,在食品加工中风味保留和改善口感等方面起到较为重要的作用[24]。4种组分蛋白的持油性均受温度的影响,其中球蛋白随着温度的改变持油性的波动较小,且在常温下辣木籽渣清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白的持油性分别为8.09、9.32、8.15、4.94 g/g,均高于杏鲍菇清蛋白（5.59 mL/g）[25]、玉米醇溶蛋白（约4.80 g/g）[26]和花生蛋白（1.255 g/g）[27],这一结果表明辣木籽渣组分蛋白在控制脂肪吸收具有一定的应用空间。辣木籽渣组分蛋白在不同温度下持油性的差异表明了这4种蛋白的分子结构及组成存在较大的差异性,这与蛋白质的SDS-PAGE相对应。在常温下,辣木籽渣组分蛋白的持油性均优于向日葵浓缩蛋白（3.00 g/g）[28]、椰子粕蛋白（2.60 g/g）[29]。这表明辣木籽渣组分蛋白能应用于食品工业中油脂含量高的食品（如素肉、烘培食品）中,起到较好的稳定作用。
乳化性及乳化稳定性是蛋白质可作为乳化剂的2个重要指标。蛋白质是两性物质,通过剧烈的搅打可形成具有良好稳定性的物理屏障油水界面,因而被作为乳化剂广泛应用于食品行业中[30]。本研究表明,清蛋白的乳化性及乳化稳定性（10.12 m2/g、24.54 min）、起泡性（21.11%）均较优,且其乳化性与菠萝蜜种子分离蛋白（乳化性9.72 m2/g）[31]相当,这表明清蛋白在冰淇淋、巧克力等食品加工方面具有较大的应用潜能。起泡性是反映蛋白质在溶液中被搅打产生泡沫能力的指标,泡沫稳定性是表示蛋白质维持泡沫以防止破裂和聚集的能力的指标[32]。谷蛋白的泡沫稳定性较优,在静置180 min后,泡沫稳定性为35.71%,优于黑茶蛋白（静置60 min后,泡沫稳定性为24.07%）[33],这表明谷蛋白可以较好地在烘培食品中维持产品地疏松结构或良好口感。泡沫稳定性与分子间的粘度有关,粘度越大,膜的强度越大,泡沫就越稳定。清蛋白的泡沫稳定性较差,表明清蛋白形成的泡沫强度不大,泡沫较易消散。
本研究通过对辣木籽渣各组分蛋白的理化和功能特性进行解析,结果表明辣木籽渣组分蛋白可在食品工业中作为乳化剂、持油剂、发泡剂等使用,可成为一种新的具有潜在应用价值的植物蛋白资源。同时,辣木籽渣蛋白质的解析研究也可为提高辣木籽的综合利用率,增加其附加值提供新思路。下一步,将就辣木籽渣组分蛋白的具体性能在食品工业中的应用开展深入研究,以期为辣木籽渣蛋白的应用方向提供技术指导。