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2021 , Vol. 42 >Issue 1: 182 - 187

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.025

Plant Protection & Bio-safety

Establishment and Application of a Loop-mediated Isothermal Amplification Assay for Detection of Ganoderma pseudoferreum on Hevea

  • HE Chunping 1 ,
  • DONG Wenmin 2 ,
  • WU Weihuai , 1, ** ,
  • LIANG Yanqiong 1 ,
  • LI Rui 1 ,
  • XIE Li 3 ,
  • HUANG Xing 1 ,
  • YI Kexian , 1, 2, **
Expand
  • 1. Environment and Plant Protection Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests, Haikou, Hainan 571101, China
  • 2. College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing, Jiangsu 210095, China
  • 3. Institute of Forestry, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China
*WU Weihuai,E-mail： ;
YI Kexian,E-mail： 。

Received date: 2020-01-08

  Request revised date: 2020-04-09

  Online published: 2021-01-25

Copyright

Copyright reserved © 2021.
Fold

Abstract

Rubber tree red root disease caused by Ganoderma pseudoferreum is proved to be a serious disease, which is the most widespread and harmful to rubber tree (Hevea brasiliensis) production. This study reports the development of a loop-mediated isothernal amplification (LAMP) assay targeting the mitochondria large rDNA for visual detection of G. pseudoferreum. The mitochondria large rDNA-LAMP assay efficiently amplified the target gene within 80 min at 64 ℃ (in 1 hour) and was evaluated for specificity and sensitivity. A positive color or (green) was only observed in the presence of G. pseudoferreum by SYBR Green I as an indicator reaction after amplification; however none of other pathogens changed color (still orange). The lower limit of detection of the LAMP assay was about 1×10 -5 ng/μL of genomic DNA, which was 1000 times more sensitive than the PCR method. Twenty strains of suspected samples in the field were tested by the LAMP system with the pathogen detection rate was 85%. This method would provide a new technology for the rapid identification of G. pseudoferreum.

Key words： Ganoderma pseudoferreum; loop-mediated isothermal amplification; molecular detection

Cite this article

HE Chunping , DONG Wenmin , WU Weihuai , LIANG Yanqiong , LI Rui , XIE Li , HUANG Xing , YI Kexian . Establishment and Application of a Loop-mediated Isothermal Amplification Assay for Detection of Ganoderma pseudoferreum on Hevea[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2021 , 42(1) : 182 -187 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.01.025

天然橡胶是全球重要的工业原料和战略物资,是国防工业和高端装备生产中不可替代的重要原料[1]。橡胶树根病是由植物病原真菌侵染橡胶树根部引起,常造成根颈部腐烂,严重时导致植株死亡。由橡胶灵芝菌（Ganoderma pseudoferreum）侵染引起的红根病是天然橡胶生产中危害面积最广、影响最大的世界性根部传染性病害,主要分布在东南亚从印度尼西亚到巴布亚新几内亚和新卡里多尼亚、马来西亚、菲律宾、科特迪瓦等热带地区。在中国所有种植橡胶的地区普遍发生红根病,发病严重林段发病率达40%,若未及时防治,死亡率可达100%[2]。红根病菌的寄主非常广泛,除危害橡胶树外,还侵染刀把木、厚皮树、三角枫、苦楝树、台湾相思、山枇杷、柑橘、可可、咖啡、荔枝、茶树、鸡血藤等多种植物[3]。红根病病菌生长缓慢,形态学鉴定困难。当植株地上部表现明显症状时,红根病菌可能已传染至其他邻近胶树,常错过最佳防治时机。因此建立一种快速鉴定橡胶树红根病菌的早期检测技术,对于生产上指导该病害防治和减少病害损失具有重要现实意义。
目前对橡胶树红根病菌的检测以病症识别和组织分离病原菌及形态鉴定为主,但传统方法耗时长、专业性强、灵敏度低,难以达到快速鉴别的目的。利用分子生物学技术检测该病病原菌的方法有普通PCR法[4,5,6],虽然能够较准确检测出病原菌,但需要PCR仪、电泳仪和凝胶成像系统等高价的专业仪器设备和分子生物学专业的实验操作人员,不适宜在田间以及基层大规模应用,使病情无法及时、准确地检测及有效防控。
环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是近年发展起来的应用微生物快速检测的分子生物学技术[7]。该技术可在恒温条件下,利用高活性的链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）对目的DNA片段进行特异性扩增[8],60~65 ℃恒温反应30~60 min便能达到109~1010个拷贝数量级。该技术不用进行变性、退火、延伸等一系列温度变化,无需特殊高端的仪器设备,恒温水浴锅即可满足实验需求,具有快速、简便、高效、灵敏、经济等特征。目前该技术已在植保等诸多领域得到广泛应用[9,10],极大地提高了鉴定效率和准确率。建立可视化、快速、灵敏、便捷的橡胶树红根病菌LAMP检测技术可为橡胶树红根病的发生和防治提供重要的技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 橡胶树红根病菌（G. pseudoferreum）菌株GP011、GP014、GP021、GP043,橡胶树褐根病菌（Phellinus noxius）菌株Pn008、Pn012、Pn020,橡胶树紫根病菌（Helicobasidium compactum）菌株HC001,橡胶树白根病菌（Rigidoporus lignosus）菌株RL004,橡胶树臭根病菌（Sphaerostilbe repens）菌株Sr001,橡胶树炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）菌株RC178,柱花草炭疽病菌（C. gloeosporioides）菌株CH008,芒果炭疽病菌（C. gloeosporioides）菌株MT1,橡胶树白粉病菌（Oidium heveae Steinm）菌株BF1和剑麻斑马纹病菌（Phytophora nicotianae）菌株BM1,均为中国热带农业科学院环境与植物保护研究所热带特色经济作物病害研究组分离、鉴定和保藏。
1.1.2 供试试剂 氨苄青霉素（Amp）、E. coli trans T1、pEASY-T1 Cloning vector、10 mmol/L dNTPs购于北京全式金生物技术有限公司;Plasmid Mini Kit I、Fungal DNA Kit、Gel extraction Kit均购于美国Omega公司;DL2000 Maker、10×rTaq Buffer、2.5 mmol/L dNTPs、rTaq DNA Polymerase均购自TaKaRa公司;甜菜碱Betaine（B8230）、SYBR Green I核酸染料、Golden View I核酸染色剂购自Solarbio公司;琼脂糖（Agarose）购自西班牙Biowest公司。NEB 3.0 Bst-DNA Polymerase、10×Bst-DNA Polymerase Buffer、100 mmol/L MgSO4均购自北京NEB生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌培养及核酸提取 将供试菌株的菌丝块分别转至马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）中,置于28 ℃、180 r/min摇床中振荡培养7~10 d后过滤,收集菌丝,冷冻干燥,提取总DNA。病原菌总DNA的提取参照试剂盒（Fungal DNA Kit）说明书进行。所提取的DNA保存在-20 ℃冰箱中备用。
1.2.2 引物设计与合成 参照文献[11]提供的通用线粒体Larage rDNA引物对提取的橡胶树红根病病菌橡胶灵芝菌（G. pseudoferreum）进行扩增测序。通过大量比对GenBank中下载不同种和属的同源性G. pseudoferreum的线粒体Larage rDNA基因的核酸序列,找到多态性丰富区段（特异序列）并应用在线软件Primer Explorer V4（http:// primerexplorer.jp/e/）设计用于LAMP的外引物F3和B3,内引物FIP和BIP（表1）。设计的引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。引物用ddH2O溶解后分装保存于-20℃备用。
表1 LAMP引物及其序列

Tab. 1 Primer and sequence of LAMP

LAMP引物
LAMP primer		 序列（5¢-3¢）
Sequence (5¢-3¢)
F3 TCGGAATGACATAAATTGATGA
B3 GGTGTAATATTCTATTGTTTAAGGC
FIP CTTGTTTCGTGTTCTCGGCTTCAGACTGCTCATGCGAA
BIP TATTGAATGCAGCTGTAAAGTGAGCGCTACGTTGTTACATTACGTTTA
1.2.3 LAMP反应体系及反应条件优化 参考吴家林等[12]的方法并略作改动,对LAMP反应体系中的各反应组分浓度进行优化。对引物配比进行优化,设定内外引物配比比例分别为2∶1、4∶1、6∶1、8∶1;dNTPs终浓度分别为0、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mmol/L;Mg2+终浓度分别为2、3、4、6、8 mmol/L;甜菜碱终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mol/L;反应温度分别设为57、58、59、60、61、63、64、65 ℃;反应时间分别为15、30、45、60、75、90 min。每个因子设置3个重复,以确定最佳反应体系及反应条件。扩增反应结束后,加入1 μL SYBR Green I进行荧光染色,观察反应管颜色变化,若反应管呈现亮绿色则反应呈阳性,若为橙色,则反应为阴性[13]。将反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测,如凝胶电泳图为瀑布状梯形条带即为阳性,反之则为阴性。
1.2.4 LAMP检测的特异性 利用1.2.3中优化的反应体系对1.1.1中所述供试菌株进行LAMP扩增,验证其特异性。反应产物分别经2%琼脂糖凝胶电泳和SYBR Green I染色观察。
1.2.5 LAMP检测的灵敏度 通过超微量分光光度计（NanoDrop 2000c）将橡胶树红根病菌菌株GP021基因组DNA初始浓度调整为100 ng/µL,并将其依次稀释为101、100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7 ng/μL 10个不同浓度梯度。每个梯度设3个重复,将3个重复混合,取1 μL不同浓度的模板用于LAMP反应,无菌水作为空白对照。2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果,并通过SYBR Green I显色验证。
为了比较LAMP和普通PCR间的灵敏度,使用LAMP外引物F3和B3（表1）进行PCR扩增,DNA初始浓度与LAMP灵敏度检测设置的浓度一致。PCR反应体系：10 mmol/L dNTPs 2 μL,10×Ex Taq buffer 2.5 μL,2.5 μmol/L引物F3/B3各1 μL,Ex Taq酶0.5 μL（2.5 U）,模板1 μL,补充ddH2O至25 μL。PCR反应程序为：94 ℃ 3 min,94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,扩增35个循环,72 ℃ 10 min。PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳检测。
1.2.6 田间样本检测 选用来自海南儋州、白沙等地样本共20份（表2）。样本有褐色坏死的茎基部、根组织,有病根表皮变枣红色或黑红色木质部,或木质部变海绵状湿腐,皮木间有白色至深黄色腐竹状菌膜,有半圆形或不规则形灰褐色、红褐色或黑褐色子实体。采用普通PCR法、基于环介导等温扩增技术（LAMP）方法对20份样品进行分析诊断。对发病的茎基部、根组织及子实体,取病/健交界处剪碎,将剪碎的样品利用天根植物组织基因组DNA试剂盒提取病部组织DNA。以橡胶树健康植株基因组DNA为对照,进行普通PCR和LAMP扩增。普通PCR扩增使用引物F3/B3,反应体系与方法如1.2.5所述;LAMP使用引物F3/B3和FIP/BIP,反应体系与方法如1.2.3所述。
表2 不同检测技术对田间疑似橡胶树红根病病样的检出频率

Tab. 2 Detection frequency of suspected rubber tree red root disease in different fields by different detection techniques

序号
Number		 菌株号
Isolate No.		 采集地点
Locality		 LAMP
验证
LAMP test		 普通PCR
验证
Normal PCR detection
1 GP1 海南儋州西培农场1 √ ×
2 GP2 海南儋州西培农场2 √ √
3 GP3 海南儋州西培农场3 √ √
4 GP4 海南儋州西培农场4 √ √
5 GP5 海南儋州西培农场5 √ √
6 GP6 海南儋州西培农场6 × √
7 GP7 海南儋州西流农场红
明队1		 √ √
8 GP8 海南儋州西流农场红
明队2		 √ √
9 GP9 海南儋州西流农场红
旗队1		 √ √
10 GP10 海南儋州西流农场红
旗队2		 √ ×
11 GP11 海南儋州试验场三队 √ √
12 GP12 海南儋州试验场六队1 √ √
13 GP13 海南儋州试验场六队2 √ √
14 GP14 海南白沙龙江农场雄
英二队1		 √ √
15 GP15 海南白沙龙江农场雄
英五队3		 × ×
16 GP16 海南白沙龙江农场雄
英五队1		 √ ×
17 GP17 海南白沙龙江农场雄
英七队1		 √ ×
18 GP18 海南白沙龙江农场雄
英二队2		 √ √
19 GP19 海南白沙龙江农场雄
英七队2		 √ √
20 GP20 海南儋州西流农场红
明队3		 × √

注：√：检出;×：未检出。

Note: √: Detected; ×: Not detected.

2 结果与分析

2.1 LAMP检测体系的优化

2.1.1 反应体系优化 通过对LAMP反应体系中各组分浓度的优化,确定用于检测橡胶树红根病菌的LAMP最佳反应体系为：F3和B3各为0.2 μmol/L,FIP和BIP各为1.2 μmol/L,dNTPs为1.4 mmol/L,Mg2+为4 mmol/L,甜菜碱为0.8 mol/L,Bst-DNA Polymerase为8 U/μL,模板DNA为1 μL,10×Bst-DNA Polymerase Buffer 2.5 μL,加ddH2O补足25 μL。
2.1.2 反应条件优化 采用上述最佳反应体系进行最适反应温度的筛选,结果表明,在57、58、59、60、61、63、64、65 ℃ 8个不同的反应温度下均有扩增,且产物经琼脂糖凝胶电泳检测后均可见梯状条带,当加入荧光染色剂SYBR Green I后反应液均由橙色变为绿色,但在64 ℃温度条件下,反应扩增效率高,颜色变化明显,故确定LAMP反应温度为64 ℃（图1A,图1B）。
图1 LAMP检测反应温度的优化

A：琼脂糖凝胶电泳图;B：SYBR Green I显色图;M：DL2000 DNA Marker;1：空白对照（ddH2O）;2：57 ℃;3：58 ℃;4：59 ℃;5：60 ℃;6：61 ℃;7：63 ℃;8：64 ℃;9：65 ℃。

Fig. 1 Optimization of temperature of the LAMP for detection of G. pseudoferreum

A: Agarose gel electrophoresis pattern; B: Visual detection of LAMP using SYBR Green I; M: DL2000 DNA Marker; 1: Negative control (dH2O); 2: 57 ℃; 3: 58 ℃; 4: 59 ℃; 5: 60 ℃; 6: 61 ℃; 7: 63 ℃; 8: 64 ℃; 9: 65 ℃.

如图2A、图2B所示,在所设置的6个反应时间下,15 min时不能进行扩增反应,在反应30、45 min时,条带较为暗淡,在60、75、90 min时均可以很好地扩增。在反应60 min时,条带较为清晰且加入染色液后产物颜色变化明显,故确定LAMP反应时间为60 min。
图2 LAMP检测反应时间优化

A：琼脂糖凝胶电泳图;B：SYBR Green I显色图;M：DL2000 DNA Marker;1：空白对照（ddH2O）;2：15 min;3：30 min;4：45 min;5：60 min;6：75 min;7：90 min。

Fig. 2 Optimization reaction time of LAMP for detection of G. pseudoferreum

A: Agarose gel electrophoresis pattern; B: Visual detection of LAMP using SYBR Green I. M: DL2000 DNA Marker; 1: Negative control (ddH2O); 2: 15 min; 3: 30 min; 4: 45 min; 5: 60 min; 6: 75 min; 7: 90 min.

2.2 LAMP特异性检测

用优化的LAMP反应体系对橡胶树红根病菌以及担子菌的其他属、其他真菌等15个菌株进行LAMP扩增,以ddH2O作为阴性对照以验证引物的特异性。凝胶电泳结果表明,4株橡胶树红根病菌菌株DNA扩增产物均出现梯状条带,而其余11个阴性菌株及空白对照均未出现任何条带（图3A）。LAMP扩增反应结束,反应管中加入SYBR Green I染料后,其中橡胶树红根病菌反应管呈现绿色,为阳性反应,而其他对照病原菌及空白对照反应管中反应液均保持橙色（图3B）。表明本LAMP引物对橡胶树红根病菌的检测具有很好的特异性。
图3 LAMP检测的特异性

A：琼脂糖凝胶电泳图;B：SYBR Green I显色图;M：DL2000 DNA Marker;1：空白对照（ddH2O）;2：橡胶树炭疽病菌RC178;3：橡胶树紫根病菌HC001;4：芒果炭疽病菌MT1;5：柱花草炭疽病菌CH008;6：剑麻斑马纹病菌BM1;7：橡胶树臭根病菌Sr001;8：橡胶树白根病菌RL004;9：橡胶树白粉病菌BF1;10~12：橡胶树褐根病菌Pn008、Pn012、Pn020;13~16：橡胶树红根病菌GP011、GP014、GP021、GP043。

Fig. 3 Specificity of LAMP for G. pseudoferreum

A: Agarose gel electrophoresis pattern; B: Visual detection of LAMP using SYBR Green I; M: DL2000 DNA Marker; 1: Negative control (ddH2O); 2: Strain RC178 of C. gloeosporioides; 3: Strain HC001 of H. compactum; 4: Strain MT1 of C. gloeosporioides; 5: Strain CH008 of C. gloeosporioides; 6: Strain BM1 of P. nicotianae; 7: Strain Sr001 of S. repens; 8: Strain RL004 of R. lignosus; 9: Strain BF1 of O. heveae; 10-12: Strains Pn008, Pn012 and Pn020 of P. noxius; 13-16: Strains GP011, GP014, GP021 and GP043 of G. pesudoferreum.

2.3 LAMP检测的灵敏度

以菌株GP021的DNA浓度稀释梯度(1× 102~1×10-7)ng/μL为模板,进行LAMP扩增反应,凝胶电泳检测表明：当模板浓度为1× 10-5 ng/μL时,可见明显的梯状条带（图4A）;加入SYBR Green I染料后显色结果表明,当模板浓度为1×10-5 ng/μL时,反应液颜色由橙色变为绿色（图4B）,与凝胶电泳结果一致。说明LAMP检测的最低检测限度为1×10-5 ng/μL,即10 fg/μL。
图4 LAMP及普通PCR灵敏度的检测

A：LAMP检测的琼脂糖凝胶电泳图;B：SYBR Green I显色图;C：PCR检测结果的琼脂糖凝胶电泳图;M：DL2000 DNA Marker;1：空白对照（ddH2O）;2：100 ng/μL;3：10 ng/μL;4：1 ng/μL;5：10-1 ng /μL;6：10-2 ng/μL;7：10-3ng/μL;8：10-4ng/μL;9：10-5ng/μL;10：10-6 ng/μL;11：10-7 ng/μL。

Fig. 4 Specificity of LAMP for detection of G. pseudoferreum

A: Agarose gel electrophoresis pattern by LAMP Detection; B: Visual detection of LAMP using SYBR Green I; C: Agarose gel electrophoresis pattern from PCR; M: DL2000 DNA Marker; 1: Negative control (ddH2O); 2: 100 ng/μL; 3: 10 ng/μL; 4: 1 ng/μL; 5: 10-1 ng/μL; 6: 10-2 ng/μL; 7: 10-3 ng/μL; 8: 10-4 ng/μL; 9: 10-5 ng/μL; 10: 10-6 ng/μL; 11: 10-7 ng/μL.

以菌株GP021的DNA浓度稀释梯度(1× 102~1×10-7)ng/μL为模板,以LAMP外引物F3和B3进行普通PCR扩增,结果表明：模板DNA含量为(1×102~1´10-2)ng/uL时均能检测到明显的目的条带,为阳性反应（图4C）;而1´10-2 ng/uL浓度下的DNA表现为阴性扩增。由此表明PCR检测的最低检测浓度为10 pg/uL。从图4对比中可以得出LAMP检测的灵敏度是普通PCR的1000倍。

2.4 田间样本检测

对田间采集的20份样本分别利用普通PCR法和LAMP法进行检测。结果显示,用所建立的LAMP方法进行扩增,有17份样本呈现明显的扩增片段,表明17份样本中有G. pseudoferreum,检出率为85%（表2）;利用LAMP特异性外引物的普通PCR进行检测,检出15份阳性,检出率75%（表2）。普通PCR法检测效率低于LAMP法。综上所述,LAMP法特异性强、灵敏度高,检测时间短,适合于田间或基层样品的快速检测。

3 讨论

LAMP是一种可以在恒温条件下,高效、特异、快速的核酸扩增技术。该技术具特异性强、灵敏度高、检测时间短（1.5 h）、无需高价仪器设备、检测结果可视化等优点,在植保等诸多领域有广泛报道。国外学者最初通过LAMP检测番茄花叶病毒病[14]。Shan等[15]利用LAMP于玉米秸秆内快速检测出镰刀菌,从而防止镰刀菌产生的毒素进入食物链。陆辰晨[13]建立的LAMP技术可以检测大豆根腐病等多种不同病原菌。王贤达等[16]利用环介导等温扩增技术检测柑橘黄龙病病原菌,检测灵敏度达10-6 ng/uL,是普通PCR的1000倍,为柑橘黄龙病早期诊断提供了快速检测的方法[16]。橡胶树红根病病菌生长极为缓慢,分离培养阶段易受其他微生物污染,分离成功率低;且不易产孢,病原鉴定困难。因此,相对于传统病原真菌分离来说,建立高效、灵敏、快速、简便的病原早期分子检测技术在病害防治中尤为重要。
LAMP检测方法的建立中,靶标基因筛选和引物设计是实验成功的关键因素。本研究最初利用G. pseudoferreum ITS、tef-1α、β-tublin基因设计引物均未能得到多态性丰富区域（特异区间）,后利用rDNA基因通用引物[11]进行序列扩增获得G. pseudoferreum的多态性丰富区域,设计了5组LAMP引物反复筛选,结果表明所设计的引物其特异性满足实验要求。内、外引物浓度比是影响LAMP成功扩增的重要因素之一,外引物浓度过低,将导致反应不完全,浓度过高将抑制内引物的起始扩增。外引物浓度一般是内引物浓度的1/4~ 1/10[12]。本研究通过优化确定适宜的内、外引物浓度比为6∶1,确定了G. pseudoferreum最优LAMP反应体系及反应条件,结合SYBR Green I的显色,建立了橡胶树红根病菌的可视化LAMP检测方法。
本文首次报道了应用LAMP技术检测G. pseudoferreum,相对于传统PCR技术,该方法具有特异性高（识别靶序列6个独立区域）、检测成本低（64 ℃恒温水浴锅完成,无需PCR等高价仪器）、反应时间短（扩增反应仅需1 h）、灵敏度高（最低检测限10 fg/μL）和结果判定简便（反应液加入SYBR Green I可视化）等优势;而普通PCR虽能较准确检测出病原菌,但耗时长,需要PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统等高价仪器和专业操作人员;传统的组织分离、病菌形态鉴定的方法耗时长、专业性强、灵敏度低,难以达到快速鉴定的目的。LAMP技术相比于传统组织分离培养的繁琐费时以及PCR仪器的检测高成本,其优势突显,适用于田间、基层样品的初筛和快速检测。本研究中通过对20份田间疑似病样进行分离、检测,其中利用LAMP检测出17份样品呈阳性,普通PCR检测出15份呈阳性,而病样组织分离培养仅4份样品分离出G. pseudoferreum。由于G. pseudoferreum分离培养耗时长、分离成功率低、鉴定专业性强,因此所建立的快速、灵敏、准确、高效、结果可视化的LAMP检测技术对G. pseudoferreum早期分子检测具有较大的优势,对及时、科学、有效防治橡胶树红根病和减少经济损失具有重要现实意义。

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