橡胶树（Hevea brasiliensis）属大戟科三叶橡胶树属植物,是重要的热带经济作物。橡胶树产生的天然橡胶作为一种战略物资,在国民经济和国防建设中发挥着巨大作用[1]。乙烯利具有高效刺激橡胶树增产效果[2],常作为刺激剂用于橡胶树割胶以提高采胶效率,但是过度乙烯利刺激会产生一系列副作用,如死皮病增加、胶乳长流、干胶含量下降等[3,4]。为克服乙烯利的副作用,我国科学家开展了复方制剂的研究,通过添加了铵、钼等稀土元素的乙烯利喷施橡胶树割面,减少胶树长流,死皮病,促进再生生长[5]。
在农业上,施用稀土微肥对经济作物和粮食作物具有非常重要的作用。适宜的稀土浓度能够提高经济作物的产量和品质并能够提高植物抗逆性等[6]。其中最主要的原因是稀土能够提高作物体内各种保护酶的活性,缓解作物受外界胁迫刺激所引起的氧化胁迫[7,8,9,10,11]。在橡胶树中,傅金辉等[12]发现稀土显著提高巴西橡胶树减轻病情的能力。龚晶晶[13]发现硝酸镧能抑制巴西橡胶胶乳POD活性而增强SOD活性。范思伟等[14]发现硝酸稀土和硝酸镧能抑制巴西橡胶树皮组织乙烯的释放。杨少琼等[15]认为,稀土有抑制橡胶树树皮组织生成内源乙烯的功能。校现周等[16]发现,稀土中的硝酸镧可抑制离体黄色体膜上的氧化酶产生。上述研究表明稀土可以调控橡胶树的活性氧代谢,但对稀土的剂量与抗氧化能力的关系缺乏认识。本研究分析喷施不同浓度稀土橡胶树叶H2O2、MDA含量以及抗氧化酶活性,为橡胶树生理调节和刺激剂改良相关研究奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
试验地为中国热带农业科学院橡胶研究所试验基地,选择巴西橡胶树‘热研 7-33-97’无性系4年生组培苗作为材料,进行不同浓度稀土溶液喷施处理橡胶树叶面。稀土由中国热带农业科学院橡胶研究所提供,为混合硝酸稀土（稀土氧化物含量RE2O3为25.16%）配制5种浓度：0、0.05、0.10、0.20、0.40 g/L（按溶液中有效元素含量来配制所需的浓度,下同）。
1.2 方法
1.2.1 实验苗的处理和采集 橡胶树叶面稀土处理方法参考文献[17]。取长势一致的橡胶树苗15株,每3株1组,分为5组,每组叶片分别进行0（蒸馏水）、0.05、0.10、0.20、0.40 g/L浓度稀土的喷施处理,每天9：00和17：00各喷施1次,每次喷施到叶面快滴水为止,连续喷施3 d。第4天9：00开始采集样品（选取顶叶,以及顶蓬叶数起的第2、3蓬叶）,锡纸包裹置-80 ℃冰箱中备用。
1.2.2 橡胶树树叶和胶乳H2O2含量的测定 称取0.1 g树叶,加入1 mL丙酮进行冰浴匀浆;8000 g× 4 ℃离心10 min,取上清,置冰上待测。由于H2O2易分解,需要快速摘取叶片后迅速研磨。取180 μL丙酮放置冰上,在剪下树叶的同时迅速将流出胶乳的一端放置于丙酮中,最后使胶乳完全沉在离心管底部,置于冰上待测。H2O2含量采用丙酮-TiCl4法测定[18]。
1.2.3 橡胶树树叶MDA含量的测定 MDA含量采用硫代巴比妥酸（Thiobabicuacide,TBA）法[19]测定。
1.3 数据处理
采用Microsoft Excel 2010软件进行数据整理,分别利用SPSS软件Duncan’s新复极差法进行显著性分析和Pearson进行相关性分析。
2 结果分析
2.1 稀土对橡胶树树叶H2O2含量的影响
在橡胶树中,树叶H2O2含量随稀土处理浓度的增加呈先上升后下降的趋势（图1）。处理浓度为0.10 g/L时,达到最大值,为对照的168%,显著高于对照;处理浓度为0.05、0.40 g/L时,树叶中H2O2含量低于对照,且无显著性差异;处理浓度为0.20 g/L时,树叶中H2O2含量显著低于对照。相关性分析表明,稀土处理橡胶树叶面,树叶中H2O2含量与胶乳H2O2含量的相关系数为0.809,呈显著正相关。
图1 不同浓度稀土处理对橡胶树树叶H2O2含量的影响图中不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。 Fig. 1 Effect of different concentrations of rare earth on hydrogen peroxide content of rubber tree leaves Different lowercase letters in figure indicate variance analysis reached significant difference at the 0.05 level (P< 0.05). |
2.2 稀土对橡胶树胶乳H2O2含量的影响
在橡胶树中,胶乳H2O2含量随稀土浓度的增加呈先上升后下降的趋势（图2）。在低浓度稀土处理时（0.05 g/L）,与对照无显著差异;而处理浓度为0.10 g/L时,胶乳中H2O2含量显著增加,达到最大值,为对照组的156%;处理浓度为0.20 g/L时,胶乳中H2O2含量显著低于对照。
2.3 稀土对橡胶树树叶MDA含量的影响
稀土处理不同程度地影响树叶中MDA含量,随稀土浓度的增加,树叶中MDA含量出现先上升后下降的趋势,各处理MDA含量均高于对照（图3）。0.10、0.40 g/L稀土处理,树叶MDA含量显著增加,分别为对照组的5.18和2.71倍;其他浓度处理,树叶中MDA含量与对照差异不显著。说明较高浓度稀土处理能诱导橡胶幼苗MDA含量升高,MDA含量高表明细胞膜脂过氧化程度增加,植物细胞膜受到的伤害增大。相关性分析表明,稀土处理橡胶树叶面,树叶中H2O2含量与MDA含量的相关系数为0.754,呈显著正相关;胶乳H2O2含量与树叶MDA含量的相关系数为0.865,也呈显著正相关。
图3 不同浓度稀土处理对橡胶树树叶MDA含量影响图中不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。 Fig. 3 Effect of different concentrations of rare earth on content of malondialdehyde in rubber tree leaves Different lowercase letters in figure indicate variance analysis reached significant difference at the 0.05 level (P < 0.05). |
2.4 稀土对橡胶树树叶超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响
SOD主要功能是将O2-催化为较为稳定的H2O2来维护细胞活性氧的代谢平衡。稀土处理不同程度地影响SOD活性,随稀土浓度的增加,SOD活性出现先上升后下降的趋势（图4）。0.20 g/L稀土处理,树叶SOD活性显著增强,为对照的146.88%,而其他浓度稀土处理,树叶SOD活性与对照差异不显著。相关性分析表明,稀土处理橡胶树叶面,树叶SOD活性与胶乳H2O2含量的相关系数为-0.129,呈一定负相关,而与树叶H2O2含量无相关性。
图4 不同浓度稀土处理对橡胶树树叶超氧化物歧化酶活性的影响图中不同小写字母表示处理间差异显著（P<0.05）。 Fig. 4 Effect of different concentrations of rare earth on activity of superoxide dismutase in rubber tree leaves Different lowercase letters in figure indicate variance analysis reached significant difference at the 0.05 level (P < 0.05). |
2.5 稀土对橡胶树树叶过氧化氢酶（CAT）活性的影响
橡胶树树叶CAT活性随处理稀土浓度升高逐渐下降（图5）。不同浓度稀土处理橡胶树叶面,树叶CAT活性存在显著性差异。0.40 g/L稀土处理,树叶CAT活性仅为对照的3.5%。说明稀土处理会显著抑制橡胶树树叶CAT活性。相关性分析表明,稀土处理橡胶树叶面,树叶CAT活性与胶乳H2O2含量的相关系数为-0.216,呈一定负相关,而与树叶H2O2含量无相关性。
2.6 稀土对橡胶树树叶过氧化物酶（POD）活性的影响
随着稀土浓度的升高,橡胶树树叶POD活性出现快速升高快速下降之后又升高的现象（图6）。0.05、0.40 g/L稀土处理,树叶POD活性显著增强,分别为对照的7.35倍、9.43倍;0.10 g/L稀土处理,树叶POD活性下降,与对照无显著差异。相关性分析表明,稀土处理橡胶树叶面,树叶POD活性与树叶H2O2含量的相关系数为-0.450,呈显著负相关,与胶乳H2O2含量相关系数为-0.131,呈弱负相关。
3 讨论
稀土元素对植物的生理效应具有双面性,临界浓度范围的稀土元素对植物具有正面效应[22],超过耐受临界浓度范围时会对植物产生毒害作用[23]。本研究发现随叶面喷施稀土浓度的升高,橡胶树胶乳、树叶H2O2以及MDA含量呈现先升高后降低的趋势。0.10 g/L稀土处理,胶乳、树叶H2O2以及MDA含量显著升高,说明高浓度稀土处理,引起橡胶树树叶膜结构不稳定,增加细胞膜的透性,引起膜质过氧化。0.05 g/L稀土处理,胶乳、树叶H2O2以及MDA含量与对照无显著性差异,可能是由于低浓度的稀土处理,并未破坏体内的活性氧的动态平衡,当稀土浓度较高时打破体内活性氧动态平衡,产生大量活性氧,含量升高,该结果与王伟[24]、刘曦[25]的研究相似,说明稀土对橡胶树胶乳H2O2含量,树叶H2O2、MAD含量呈现出“低促高抑”的效应。
正常条件下,活性氧（ROS）的产生和清除处于动态平衡状态。当植物受到外界胁迫时,大量活性氧在细胞内积累[26],引起细胞膜脂严重过氧化产生丙二醛（MDA）[27]。SOD、CAT和POD是植物体内重要的酶促类抗氧化物质[28],它们协同作用减轻活性氧伤害,防止膜质过氧化,维持植物正常生长发育。维持较高浓度的抗氧化酶活性,能够抑制活性氧在植物组织中积累,减轻氧化损伤。如稀土镧处理小麦幼苗叶片,显著提高抗氧化酶POD、CAT的活性,加强清除活性氧的能力,从而缓解活性氧对小麦组织的毒害作用[29];稀土镧、稀土铈处理豌豆种子,能够显著提高豌豆幼苗抗氧化物酶活性[30];稀土镧和稀土铈处理谢花后菠萝叶面,能够显著提高SOD活性,降低了膜脂过氧化作用[31]。本研究发现随着稀土浓度的升高,橡胶树体内CAT的活性显著降低,可能与研究品种有关;SOD、POD活性总体上都呈现先上升后下降的趋势,可能因为自由基活性氧浓度未超过伤害“阈值”时,保护酶会表现出积极应对;而超过“阈值”后,保护酶则以被动忍耐为主,进一步促使膜脂过氧化,使MDA含量增加,MDA含量的积累又抑制了SOD、POD、CAT的活性,从而使保护酶系统功能丧失,膜系统受损被进一步加重[9]。0.05 g/L稀土处理橡胶树叶面,树叶活性氧防御系统主要保护酶POD、SOD比较活跃,发挥了主要的先锋作用,说明适宜浓度稀土处理橡胶树叶面会提高橡胶树树叶POD、SOD活性。该研究结果与杨少琼等[15]的结果不一致,可能因为不同品系橡胶树抗氧化酶系统激活的程度不同。综上表明,稀土可以维持橡胶树活性氧代谢平衡,减少自由基对细胞膜的损害,从而提高抵御外界刺激的能力。相关性分析表明,稀土处理橡胶树叶面,树叶H2O2含量与胶乳H2O2含量、树叶MDA含量呈显著正相关,胶乳H2O2含量与树叶MDA含量也呈显著正相关,该结果与毕会涛等[32]的研究结果相似。说明对于幼龄橡胶树,叶组织氧化损伤情况也能反映乳管细胞的氧化损伤情况;树叶MDA含量可以作为乳管细胞活性氧化损伤指标。稀土处理橡胶树叶面,抗氧化酶活性与胶乳H2O2含量呈显著负相关,POD活性与树叶H2O2含量存在显著负相关。说明橡胶树树叶中POD发挥非常重要的作用,但还需要SOD、CAT等酶协同作用来维持活性氧的代谢平衡,从而降低活性氧自由基对机体毒害。本研究初步分析了稀土处理幼龄橡胶树叶面,胶乳H2O2、树叶MDA、H2O2含量以及抗氧化能力,稀土处理不同品系橡胶树是否存在一定差异有待进一步研究。
4 结论
稀土处理橡胶树叶面,随稀土浓度的升高,树叶和胶乳H2O2含量、树叶MDA含量出现先上升后下降的趋势,体内SOD、POD活性也呈现类似的趋势,而对CAT活性则有明显的抑制作用。适宜浓度（0.05~0.10 g/L）的稀土处理能够提高橡胶树抗氧化酶的活性,清除活性氧自由基,缓解外界刺激对细胞膜氧化损伤,从而提高抵御外界刺激的能力。