显微操作分离技术是利用倒置显微镜、显微操作器,结合电动机械控制的毛细玻璃针进行分离单个细胞或者单染色体的技术[1,2],操作具有灵活取样、目标明确、操作简单、成本低等优点,是一种较常用的分离技术。据统计,自显微分离技术建立以来,就因其优势在动物遗传学[3,4,5]、医学[6,7]、微生物学[8,9,10]等诸多领域得到广泛应用。然而,由于植物细胞的特异性,这项技术在植物中的应用受到限制,技术进展缓慢。随着植物细胞遗传学的发展及研究者在技术上的不断追求与创新,植物显微操作分离技术被日益完善,也相继实现了植物染色体[10,11]、体细胞[12,13]等的分离。在植物中的单细胞分离技术是实现植物单细胞水平研究的基础[14],可为构建SNP细胞遗传图谱、植物分子育种等研究提供技术基础。近年来,在测序时,研究者采用的样品多是细胞群体或是大量细胞的混合DNA,这样获得的全基因组序列信息,仅是多数占优势的细胞所表达的某些明显的序列信息,而忽视了少数细胞表达的差异性[15,16,17,18]。世界上不可能存在2个完全相同的细胞,单个细胞间的表达调控同样存在差异[19],为了获得细胞异质性表达的微量序列信息,单细胞全基因组测序应运而生。目前,关于植物单细胞的分离研究已有少量报道,如2015年李响[20]利用显微分离技术成功分离出玉米小孢子单细胞,解析了玉米减数分裂重组机制,构建了玉米SNP图谱;Kubo等[21]利用显微分离技术成功分离出小立碗藓叶片的单细胞,建立了单细胞数字基因表达,完成单细胞测序。
巴西橡胶树（Hevea Brasiliensis）原产于巴西亚马逊河流域,现广泛种植于我国云南、海南、广东等地区,是我国重要的热带经济作物和经济建设、国防建设的重要战略物资。研究者们在染色体水平上对橡胶树进行核型分析、功能基因定位、构建遗传图谱等,为橡胶树分子育种提供了基础性资料[22,23,24]。巴西橡胶树属于常异花授粉,雌雄同序异花,在遗传上基因型高度杂合[25],因此在减数分裂、花粉发育、合子发育以及受精过程均可能会受遗传或环境因素的影响,使得在全基因组测序时可能会缺少某种基因型的个体。鉴于此,我们选择直接利用橡胶树小孢子单细胞,在单个细胞水平上进行高通量测序,这是解决上述缺陷的有效措施。单细胞测序的首要前提是成功获得橡胶树小孢子单细胞,而目前成功分离橡胶树小孢子单细胞以及利用单细胞测序来构建遗传图谱的研究却未见报道。本研究以巴西橡胶树‘热研7-33-97’幼嫩雄花为试验材料,建立一套适合巴西橡胶树小孢子单细胞的显微分离技术体系,成功分离出品质优良的小孢子单细胞,为解析橡胶树在减数分裂过程中的变异情况,以及构建巴西橡胶树高分辨SNP遗传图谱、研究遗传多样性和橡胶树分子育种的研究提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
以巴西橡胶树‘热研7-33-97’幼嫩雄花为试验材料,采自国家农作物种质资源共享服务平台-国家橡胶树种质资源子平台。
1.2 方法
1.2.1 四分体标本的制备 在参考常规压片法[26]与细胞悬液法[27]的基础上,探索制备巴西橡胶树雄花四分体标本的方法。在天气明朗的8：00—10：00时,采集巴西橡胶树幼嫩花序,室温下FAA固定液进行预处理,ddH2O清洗2~3次,于75%乙醇保存。根据常规压片法,取一朵幼嫩雄花,置于洁净、无菌的载玻片上,用ddH2O清洗掉75%乙醇,滤纸吸取表面残留ddH2O,剥去花萼分离出花药,滴加改卡宝品红染色液室温染色1 min后,轻敲盖玻片将花药压碎,普通光学显微镜下观察细胞时期;根据细胞悬液法,取选定的雄花材料,在无菌的载玻片上,对雄花进行简单的裂隙处理,转置于含有改卡宝品红染色液的PCR管内,染色1~7 h后取出雄花,置于载玻片上进行雄花剥离获得花药,于27%山梨醇缓冲液中保存,初步得到橡胶树四分体细胞悬液。
1.2.2 四分体的显微分离 参照陈学俊等[28]巴西橡胶树单染色体显微分离体系与李响[20]玉米单细胞显微分离体系,略有改动,建立适用分离巴西橡胶树‘热研7-33-97’单个四分体的显微分离技术体系。（1）制备显微玻璃针。将内径0.5 mm、管长100 mm的毛细玻璃针管在NARISHIGE PN-30拉针仪上拉制成针尖直径约为1 μm的细长玻璃针,再在NARISHIGE EG-400磨针仪上将针尖部位磨成适宜大小的平滑斜口。（2）单个四分体的显微分离。用乙醇脱脂棉球将整个显微操作系统进行消毒。将磨好的微针斜口向上放置于显微操作机械臂中,10×20倍视野下,小心吸取悬浮在液滴中的目标细胞,转移至含有10 μL 27%山梨醇缓冲液的PCR管内,保存于4℃冰箱中备用。
1.2.3 酶解四分体 本研究采用5%纤维素酶、5%果胶酶、5% β-葡聚糖酶、5%纤维素酶与4%果胶酶混合酶等4种酶液酶解四分体胼胝质,以释放小孢子单细胞。取24个PCR管,每管内装有3个四分体,随机均分为4组,每组随机加入一种酶液后再均分为2个小组,分别将其置于37、50℃条件下,于1、3、6 h时观察四分体胼胝质的酶解情况,设置3次重复。巴西橡胶树‘热研7-33-97’雄花四分体胼胝质的酶解因素水平见表1。
表1 ‘热研7-33-97’四分体胼胝质的酶解因素Tab. 1 Factors of enzymatic hydrolysis of tetrad callose of Hevea brasiliensis ‘Reyan 7-33-97’ |
| 水平 Level | 因素Factor | ||
|---|---|---|---|
| 酶Enzyme | 温度Temperature/℃ | 时间Time/h | |
| 1 | 5%纤维素酶 | 37 | 1 |
| 2 | 5%果胶酶 | 50 | 3 |
| 3 | 5% β-葡聚糖酶 | 6 | |
| 4 | 5%纤维素酶与4%果胶酶混合酶 | ||
1.2.4 单细胞的显微分离 橡胶树小孢子单细胞的显微分离除所分离对象不同外,与四分体的显微分离体系大致相同。在10×20倍视野下,吸取目标小孢子单细胞,将来自同一四分体的4个小孢子单细胞全部保存于含有2 μL 27%山梨醇缓冲液的PCR管中,于4℃冰箱中保存。
2 结果与分析
2.1 试验材料的选取以及四分体标本制备
表2 ‘热研7-33-97’雄配子发育时期与 雄花大小的对应关系Tab. 2 Size of male flowers during male gametogenesis H. brasiliensis ‘Reyan 7-33-97’ |
| 花长度 Length of flower/mm | 花直径 Diameter of flower/mm | 雄配子发育时期 Period of male gamete development |
|---|---|---|
| 1.7~1.8 | 0.6~0.7 | 小孢子母细胞早期 |
| 1.8~1.9 | 0.7~0.9 | 小孢子母细胞中后期 |
| 1.9~2.1 | 0.9~1.2 | 四分体时期 |
| 2.2~2.4 | 1.2~1.4 | 单核小孢子时期 |
| 2.5~3.0 | 1.4~1.7 | 花粉成熟期 |
利用细胞悬液法制备标本。在不破坏花药的前提下,用镊子小心地将雄花划出1~2条缝隙,再置于改卡宝品红染色液中放置6 h,这是在最短时间内清晰观察到四分体形态与时期的最佳试验方案。制备四分体标本的具体步骤如下：取保存于75%乙醇、确定处于减数分裂四分体后期的雄花,用ddH2O清洗掉乙醇溶液,滤纸吸取表面残留的ddH2O,室温下改卡宝品红染色6 h,再次用ddH2O清洗2~3次,除去染液,用镊子快速剥离花药,放入含有27%山梨醇缓冲液的PCR管中,取一滴细胞悬液在倒置显微镜10×20倍镜下进行观察,结果发现四分体数量多、形态完整、背景干净,初步获得品质良好、形态清晰的巴西橡胶树雄花四分体细胞标本悬液,于4℃冰箱中保存备用。
2.2 巴西橡胶树单个四分体的显微分离技术体系
本研究通过对拉针、磨针以及显微分离步骤等的探索,达到熟练操作显微分离技术水平,成功建立一套应用分离巴西橡胶树‘热研7-33-97’单个四分体的显微分离技术体系。构建体系如下：（1）拉针。设置NARISHIGE PN-30拉针仪的参数：热值80℃,主磁力50,副磁力30,将毛细玻璃针管拉制成针尖直径约为1 μm的细长型玻璃针。（2）设置NARISHIGE EG-400磨针仪量角器角度为40°,磨出斜口直径需>60 μm。（3）调整显微操作仪机械臂的刻度全部归零,将磨好的玻璃针斜口向上放置于机械杆中。（4）吸取5 μL含有多个四分体细胞的悬液,小心滴于载玻片上,于倒置显微镜下寻找目标四分体。（5）控制操作杆,缓慢移动玻璃针到目标四分体,微微转动显微注射仪,吸取悬浮于液滴中的四分体,使其进入玻璃针内。（6）缓慢上移玻璃针至最高,微微转动显微注射仪,将单个四分体吹打于含有10 μL 27%山梨醇缓冲液的PCR管内,4℃冰箱中保存备用。（7）控制操作杆缓慢下移玻璃针至液面,反复吹打,确定吸入玻璃针内的四分体于PCR管内。利用该技术体系,先后对150个雄花花药制备的四分体标本进行显微操作,成功分离出2000个四分体,在此过程中分离单个四分体的成功率为100%。巴西橡胶树‘热研7-33-97’单个四分体的显微分离过程,如图2所示。
2.3 4种酶液对巴西橡胶树雄花四分体胼胝质的酶解效果
小孢子母细胞发育到减数分裂后期,胼胝质包裹着四分体。试验发现若要得到小孢子单细胞,通过物理手段难以实现。本研究对4种酶液在不同温度及时间条件下的巴西橡胶树雄花四分体胼胝质的酶解效果进行探索,结果见表3和图3。从表3可见,同种酶液在相同的酶解时间内,温度对四分体胼胝质的酶解情况影响不大。图3展示的是37℃条件下4种酶液在不同时间内对四分体胼胝质的酶解情况。综合分析表3和图3可知,（1）酶解1 h时,5%纤维素酶与4%果胶酶混合酶完全酶解四分体胼胝质,释放出小孢子单细胞,酶解率为100%（图3A）,其余3种酶液均未释放出小孢子单细胞;其中,5%纤维素酶开始酶解四分体外围胼胝质,酶解率约为65%~75%（图3B）,而5%果胶酶、5%β-葡聚糖酶均未酶解胼胝质,酶解率为0（图3C、D）。（2）酶解3 h时,5%纤维素酶基本酶解四分体外围胼胝质,酶解率约为88%~90%;5%果胶酶开始起作用,出现释放小孢子单细胞现象,酶解率约为25%~ 32%;5% β-葡聚糖酶未酶解胼胝质,酶解率为0（图3E~G）。（3）酶解6 h时,5%纤维素酶完全酶解掉外围胼胝质,酶解率达到95%~98%,但四分体的4个小孢子单细胞仍然相连;5%果胶酶酶解释放出多个小孢子单细胞,但仍有胼胝质残留,酶解率约80%~85%;5% β-葡聚糖酶的酶解率仅有20%~25%,可使胼胝质层变薄,但不能释放出小孢子单细胞（图3H~J）。研究结果表明：在37℃条件下,采用5%纤维素酶与4%果胶酶混合酶,酶解时间为1 h时是酶解巴西橡胶树雄花四分体胼胝质的最佳方案。在适宜温度内,橡胶树四分体胼胝质的酶解效果与酶液种类与酶解时间有关,其酶解效率见表3。
表3 不同酶种类和酶解时间条件下四分体胼胝质的酶解效率Tab. 3 Enzymatic efficiency of tetrad callose under different enzyme types and enzymatic hydrolysis time |
| 酶 Enzyme | 时间 Time/h | 37℃下酶解率 Enzymolysis rate at 37℃/% | 50℃下酶解率 Enzymolysis rate at 50℃/% |
|---|---|---|---|
| 5%纤维 素酶 | 1 | 75 | 65 |
| 3 | 90 | 88 | |
| 6 | 98 | 95 | |
| 5%果胶酶 | 1 | 0 | 0 |
| 3 | 25 | 32 | |
| 6 | 80 | 85 | |
| 5% β-葡聚糖酶 | 1 | 0 | 0 |
| 3 | 0 | 0 | |
| 6 | 20 | 25 | |
| 5%纤维素酶与4%果胶酶混合酶 | 1 | 100 | 100 |
| 3 | 100 | 100 | |
| 6 | 100 | 100 |
图3 4种酶液酶解‘热研7-33-97’四分体胼胝质的情况A：5%纤维素酶与4%果胶酶混合酶酶解1 h;B：5%纤维素酶酶解1 h;C：5%果胶酶酶解1 h;D：5% β-葡聚糖酶酶解1 h;E：5%纤维素酶酶解3 h;F：5%果胶酶酶解3 h;G：5% β-葡聚糖酶酶解3 h;H：5%纤维素酶酶解6 h;I：5%果胶酶酶解6 h;J：5% β-葡聚糖酶酶解6 h。 Fig. 3 Degradation of tetrad callose of H. brasiliensis ‘Reyan 7-33-97’ by four enzymes A: 5% cellulase and 4% pectinase mixed enzyme solution for 1 h; B: 5% cellulase for 1 h; C: 5% pectinase for 1 h; D: 5% β-glucanase for 1 h; E: 5% cellulase for 3 h; F: 5% pectinase for 3 h; G: 5% β-glucanase for 3 h; H: 5% cellulase for 6 h; I: 5% pectinase for 6 h; J: 5% β-glucanase for 6 h. |
2.4 巴西橡胶树小孢子单细胞的显微分离技术体系
借助已建立的巴西橡胶树‘热研7-33-97’单个四分体的显微分离技术体系,分离出单个四分体,利用酶解四分体释放出的4个小孢子单细胞,建立适合于分离巴西橡胶树‘热研7-33-97’小孢子单细胞的显微分离技术体系。具体体系如下：（1）37℃条件下,采用5%纤维素酶与4%果胶酶混合酶酶解1 h,释放出4个小孢子单细胞;步骤（2）~（8）参照已建立的巴西橡胶树‘热研7-33-97’单个四分体的显微分离技术体系（1）~（7）,其中步骤（3）因为分离材料的不同,略有改动,磨出的斜口直径调整为30~40 μm;（9）重复步骤（6）~（8）,直至将4个小孢子单细胞全部转移于含有10 μL 27%山梨醇缓冲液的PCR管内,4℃冰箱中保存。利用该技术体系,先后成功分离出582个小孢子单细胞,成功率约为90%,其中完整的来自同一个四分体的4个单细胞的成功率为70%~80%。巴西橡胶树‘热研7-33-97’小孢子单细胞的显微分离过程如图4所示。
图4 ‘热研7-33-97’小孢子单细胞的显微分离过程A：液相工作室下的单个四分体;B：液相工作室下同一四分体的4个单细胞;C~F：同一四分体的4个单细胞的逐一分离。 Fig. 4 Microscopic separation process of single single microspore of H. brasiliensis ‘Reyan-7-33-97’ A: Single tetrad in the liquid; B: Four single cells of the same tetrad in the liquid; C-F: Separation of four single cells of the same tetrad one by one. |
3 讨论
本研究发现在制备巴西橡胶树雄花的四分体标本时,未经染色的巴西橡胶树雄花在相差显微镜下无法观察到四分体细胞,所以需要在制备四分体悬液前对雄花进行染色。改卡宝品红主要应用于减数分裂、染色体染色,具有染色效果好、时间短、染色稳定等优点,是很好的细胞染色剂[30],故采用改卡宝品红染色液对橡胶树雄花进行染色处理。在制备标本过程中,为了尽量避免外源污染,对试验中所用试剂、载玻片、镊子等试验器具进行严格的灭菌处理,整个制备过程在超净工作台中进行。在标本制备中,笔者发现初制备的细胞悬液在一定程度上含有花药壁等杂质,因此我们利用移液器对其进行简单的细胞稀释与挑选,有利于后期利用显微分离获得干净、无杂质的橡胶树单个四分体。
胼胝质是一种以β-1,3键结合形成的线性葡聚糖[31,32],广泛存在于高等植物的细胞壁中[33],在植物的筛管代谢、配子体发育等生命活动中具有重要的调节作用,其合成与分解可直接影响植物正常的生长代谢过程。四分体是花粉母细胞经减数分裂后形成的产物,花粉母细胞减数分裂前期开始形成胼胝质,在早四分体时期达到最厚,形成雄配子体前胼胝质未解体[34]。本研究为了得到来源于同一四分体的4个小孢子单细胞,笔者利用显微分离得到的单个四分体,对其进行酶解因素的探索,结果发现在37℃条件下酶解1 h,利用5%纤维素酶与4%果胶酶混合酶降解四分体胼胝质的效果最佳,这与高和琼等[27]在制备橡胶树染色体标本时所达到的试验结果类似。同时,本研究还发现5%纤维素酶和5%果胶酶也具备酶解胼胝质作用,但2种酶液的酶解方式有所不同,纤维素酶从四分体外部逐渐溶解胼胝质,但不具备释放4个单细胞的作用,5%果胶酶则直接作用于小孢子单细胞所在部位的胼胝质,逐一释放小孢子单细胞,虽可达到试验目的,但所需时间过长,建议不采用,纤维素酶与果胶酶酶解四分体胼胝质的方式与邓秀新等[35]报道的酶解柑桔四分体原生质体的方式相同。
本研究利用显微操作技术分离单个四分体和小孢子单细胞。在操作前使用乙醇脱脂棉对拉针仪、磨针仪以及倒置显微镜等仪器设备进行酒精消毒,试验所用试剂、工具等进行严格灭菌处理,尽量减少在试验过程中可能产生的外源污染,这与王发明等[36]、殷卉等[37]在显微分离植物单染色体试验中减少污染的方法相同。为了建立一套适合分离橡胶树单个四分体和小孢子单细胞的显微分离技术体系,笔者对试验体系进行了严格的分析与摸索。笔者发现,拉针时,拉针仪的热值越高,针尖越长,口径越细,为保证针尖部位的细长,设置80℃高温,以避免毛细玻璃针在磨取针尖部位后,管壁口径太大,影响视野;分离单个四分体时,因四分体直径大小约60 μm,毛细玻璃针磨取的斜口直径需>60 μm,分离小孢子单细胞时,考虑到小孢子单细胞直径大小过小约30 μm,因此在磨制玻璃针时,调整斜口直径为30~40 μm;利用5%纤维素酶与4%果胶酶混合酶获得的小孢子单细胞,为避免有酶液残留,在分离过程中需要多次更换27%山梨醇缓冲液的液体环境,反复进行吸取与吹打,保证最终分离保存的小孢子单细胞无酶液残留。通过总结显微分离经验,笔者发现分离单个四分体的成功率可达100%,但分离小孢子单细胞的成功率约为90%,其中来自同一个四分体的4个单细胞的成功率仅为70%~80%。分析出现这种情况的原因：一方面是小孢子单细胞过小,在分离过程中会丢失;另一方面是操作者的分离技术。因此,操作者应熟练掌握分离技术,提高操作水平,是保证试验成功的基础。