睡莲是睡莲科（Nymphaeaceae）睡莲属（Ny- mphaea）植物的总称,属于多年生草本植物[1],花色丰富,花态多样,群体花期长,极具观赏价值,在水生园林景观中应用广泛。睡莲属植物主要以生态学为基础进行分类,可分为Anecphya、Brachyceras、Hydrocallis、Lotos、Nymphaea（or Castakua）5个亚属[2,3,4,5]。Anecphya亚属睡莲俗称为澳系睡莲,因原种主要分布于澳大利亚而得名,澳系睡莲适宜广西地区种植,群体花期长达8~9个月。澳系睡莲花态独特,花瓣形似荷花,与其他亚属的睡莲形态有明显差异,是重要的杂交育种材料[6]。
花粉生活力的强弱是影响杂交育种成败的重要因素[7],授粉前对植株的花粉生活力进行评价,选择花粉生活力较高的亲本可以提高育种效率。花粉离体萌发法评价花粉生活力是目前较为准确和直观的方法,在杜鹃、山茶、月季、海棠等植物的育种研究中均有应用[8,9,10,11]。关于睡莲花粉的研究较少,杨梦飞等[12]与毛立彦等[13]的研究均表明,睡莲花粉离体培养4 h后,萌发率趋于稳定;张慧会等[14]研究证明,30 ℃是睡莲花粉离体萌发的最佳温度。不同亚属的睡莲广泛分布在暖温带至热带地区[15],单朵花期约4~5 d,杂交育种经常受地域、花期等因素制约。延长睡莲花粉的生活力能有效解决花期不遇、异地授粉等问题,而低温保存是延长花粉生活力的主要手段[16],因此低温保存研究对于睡莲的杂交育种有重要意义。目前,关于睡莲花粉低温保存方面的研究还未见报道,本研究以澳系睡莲为试验材料,进行花粉离体萌发试验,筛选较佳的花粉离体萌发培养基,研究适宜的花粉保存温度,为杂交育种的亲本选择、种质资源的保存提供参考依据[17]。
1 材料与方法
1.1 材料
试验地点位于广西壮族自治区南宁市兴宁区亚热带作物研究所睡莲种质资源圃（108.38° E,22.87°N）,属于亚热带季风气候,年平均气温21.6 ℃,年平均降水量约1300 mm。试验地为睡莲种质资源圃,水体无浮萍、藻类等污染,水位平稳,水深约40 cm。
以4种澳系睡莲为试验材料,在花蕾时期做套袋处理,避免昆虫携带花粉干扰试验。随机选取长势良好、无病虫害的植株,在花药散粉时,采摘睡莲花朵带回实验室内,将成熟花药中的花粉均匀抖落在干燥培养皿中混匀（4种睡莲花粉分别置于4个培养皿中）,再将花粉分装到若干支2 mL离心管中密封保存,用于花粉培养基筛选与花粉保存试验。
表1 4种澳系睡莲花粉的采集Tab. 1 Collection of pollens of four Nymphaea Anecphya |
| 编号 Number | 品种名或种名 Cultivate name or protospecies name | 学名 Scientific name | 采集时间 Time of collection | 备注 Note |
|---|---|---|---|---|
| 152 | 默笙 | Nymphaea ‘Moshen’ | 2018-08-09 | |
| 177 | 白巨睡莲 | Nymphaea ‘Gigantea Albertde Lestang’ | 2018-08-14 | 原种 |
| 179 | 澳洲原生浅色睡莲 | Nymphaea immutabilis subsp. immutabilis blue form | 2018-08-10 | 原种 |
| 223 | 澳洲原生深色睡莲 | Nymphaea immutabilis subsp. immutabilis purple form | 2018-08-15 | 原种 |
1.2 方法
1.2.1 花粉离体萌发法 取出保存花粉的2 mL离心管,使用移液枪向离心管加入700 μL培养液,置于30 ℃培养室,500 lx的光照条件下自然培养,每隔1 h观察一次,直至花粉萌发率稳定为止。将离心管轻轻摇匀,用移液枪吸取50 μL花粉液滴在载玻片上,使用Leica DM 2500显微镜进行镜检,使用Image-Pro Plus 6.0软件统计视野内的花粉总数、萌发花粉数,每个玻片随机选取5个不重复的视野,每个视野花粉数量不少于40粒,以花粉管长度大于花粉粒直径视为萌发。培养基用水为双蒸馏水,试验重复3次。
花粉萌发率=(视野内萌发花粉数/视野内花粉总数)×100%
蔗糖设6个浓度梯度：50、100、150、200、250、300 g/L;MgSO4设6个浓度梯度：100、200、300、400、500、600 mg/L;H3BO3设6个浓度梯度：50、75、100、125、150、175 mg/L;KH2PO4设6个浓度梯度：100、200、300、400、500、600 mg/L;CaCl2·2H2O设6个浓度梯度：100、200、300、400、500、600 mg/L。以双蒸馏水为培养基作阴性对照,以‘默笙’睡莲花露[19]作阳性对照（睡莲花朵第1天盛开时,柱头上会分泌花露,以接收昆虫所携带的花粉）。
在单因素试验的基础上,以蔗糖（25、50、75、100 g/L）、MgSO4（150、200、250、300 mg/L）、H3BO3（75、100、125、150 mg/L）、KH2PO4（100、200、300、400 mg/L）、CaCl2·2H2O（300、400、500、600 mg/L）进行5因素4水平共16个组合L16(45)的正交试验。参试材料进一步扩增至4种,每种材料进行3次重复试验,依据花粉萌发率筛选出澳系睡莲花粉的最佳萌发培养基。
1.2.3 花粉保存 以上述干燥的花粉作为试验材料,每1 g分装于2 mL离心管内密封保存,分别置于常温（CK）、4、-20、-40、-70 ℃的密闭黑暗条件下保存。每隔24、48、72 h,取1支离心管的花粉进行离体培养萌发。分别选用4种澳系睡莲对应的最佳培养基,观测花粉的离体萌发率。试验操作步骤、培养时间与条件、统计方法与上述方法相同。每种澳系睡莲进行3次重复试验。
1.3 数据处理
采用Image-Pro Plus 6.0软件统计每个视野睡莲花粉的萌发率,采用Excel 2013 软件进行数据统计与制图,采用SPSS 18.0软件进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 不同培养基组分对花粉萌发率的影响
2.1.1 蔗糖浓度对花粉萌发的影响 阴性对照（双蒸馏水处理）的花粉萌发率为0;阳性对照（睡莲花露处理）的萌发率为14.33%。从图1A可以看出,低浓度的蔗糖更适宜‘默笙’睡莲花粉的萌发,浓度在50 g/L时,花粉萌发率达到试验范围内最高值20.12%,高于阳性对照。随着蔗糖浓度的提高,花粉萌发率显著下降。方差分析结果表明,当蔗糖浓度达到200 g/L以上时,花粉萌发率较低,且无显著差异。依据单因素试验的结果,可将蔗糖浓度进一步精确调整至25、50、75、100 g/L进行正交试验。
2.1.2 其余因子的浓度对花粉萌发的影响 与不同浓度的蔗糖处理相比,H3BO3、MgSO4、KH2PO4、CaCl2·2H2O的浓度对‘默笙’花粉萌发的影响规律不明显,不同浓度范围表现出不同的结果。
由图1B可知,H3BO3浓度为50 mg/L时,花粉萌发率最低（8.59%）,当浓度上升至75 mg/L时,萌发率显著提升至最高（21.59%）,之后随着H3BO3浓度的提高,萌发率缓慢下降。方差分析结果表明：当H3BO3浓度为75 mg/L时,花粉萌发率显著高于50、150、175 mg/L的H3BO3处理。
由图1C可知,MgSO4的浓度从100 mg/L提升至200 mg/L时,花粉萌发率显著提升,从10.57%提升至最高（16.11%）。当浓度超过200 mg/L以上时,‘默笙’的花粉萌发率随着浓度的提高呈缓慢下降的趋势。方差分析表明：当MgSO4浓度为200 mg/L时,‘默笙’花粉的萌发率显著高于100、600 mg/L MgSO4的处理。
由图1D可知,当KH2PO4的浓度在200~600 mg/L时,花粉萌发率呈现中间高、两头低的分布趋势。方差分析结果表明：当KH2PO4浓度为400 mg/L时,‘默笙’睡莲花粉的萌发率显著高于其他处理,而100 mg/L处理的花粉萌发率与300、500、600 mg/L处理无显著差异。
由图1E可知,300、600 mg/L的CaCl2·2H2O适宜‘默笙’花粉的萌发,萌发率分别为16.11%、13.52%。方差分析显示：300、600 mg/L CaCl2·2H2O的2个处理之间无显著差异,且花粉萌发率显著高于其他处理。
2.2 正交试验各处理对澳系睡莲花粉萌发的影响
表2 影响澳系睡莲花粉萌发的L16(45)正交试验结果Tab. 2 Result of L16 (45) orthogonal test of Anecphya pollen germination |
| 编号 No. | 蔗糖 Sucrose /(g·L-1) | MgSO4 /(mg·L-1) | H3BO3 /(mg·L-1) | KH2PO4 /(mg·L-1) | CaCl2·2H2O /(mg·L-1) | 花粉萌发率Pollen germination rate/% | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 默笙 N. ‘Moshen’ | 澳洲原生浅色 N. immutabilis subsp. immutabilis blue form | 澳洲原生深色 N. immutabilis subsp. immutabilis purple form | 白巨睡莲 N. ‘Gigantea Albertde Lestang’ | ||||||
| 1 | 25(1) | 150(1) | 75(1) | 100(1) | 300(1) | 11.83±1.95de | 8.14±.143de | 21.43±1.68b | 5.98±.988abc |
| 2 | 25(1) | 200(2) | 100(2) | 200(2) | 400(2) | 9.48±1.81de | 9.82±.82±de | 24.81±4.81b | 4.10±.101bcd |
| 3 | 25(1) | 250(3) | 125(3) | 300(3) | 500(3) | 9.45±1.98de | 11.39±1.39d | 22.20±2.20b | 3.73±.730bcd |
| 4 | 25(1) | 300(4) | 150(4) | 400(4) | 600(4) | 21.09±3.88bc | 10.12±0.12de | 17.64±7.64bc | 7.63±.634ab |
| 5 | 50(2) | 150(1) | 100(2) | 300(3) | 600(4) | 22.52±5.73bc | 11.91±1.91d | 11.18±1.18cd | 9.73±.738a |
| 6 | 50(2) | 200(2) | 75(1) | 400(4) | 500(3) | 17.43±1.65bcd | 8.04±.043de | 25.15±5.15b | 3.59±.595bcd |
| 7 | 50(2) | 250(3) | 150(4) | 100(1) | 400(2) | 10.90±2.22de | 9.09±.090de | 25.13±5.13b | 4.45±.453bcd |
| 8 | 50(2) | 300(4) | 125(3) | 200(2) | 300(1) | 25.52±3.86ab | 8.37±.372de | 45.63±5.63a | 4.59±.593bcd |
| 9 | 75(3) | 150(1) | 125(3) | 400(4) | 400(2) | 31.84±5.99a | 4.74±.744e | 12.19±2.19cd | 2.79±.799cd |
| 10 | 75(3) | 200(2) | 75(1) | 300(3) | 300(1) | 10.12±2.33de | 43.90±3.92a | 5.03±.032d | 2.74±.742cd |
| 11 | 75(3) | 250(3) | 150(4) | 200(2) | 600(4) | 15.48±3.49cd | 10.06±0.06de | 21.38±1.38b | 2.71±0.56cd |
| 12 | 75(3) | 300(4) | 100(2) | 100(1) | 500(3) | 10.40±0.7de | 13.79±3.79c | 19.32±9.32bc | 5.87±.872abc |
| 13 | 100(4) | 150(1) | 150(4) | 200(2) | 500(3) | 9.16±0.84de | 17.86±7.86bc | 7.42±.426d | 1.04±.046d |
| 14 | 100(4) | 200(2) | 125(3) | 100(1) | 600(4) | 8.73±1.22de | 20.27±0.27b | 10.48±0.48cd | 2.93±.938cd |
| 15 | 100(4) | 250(3) | 100(2) | 400(4) | 300(1) | 2.23±0.39e | 10.02±0.02de | 19.45±9.45bc | 4.81±.815bcd |
| 16 | 100(4) | 300(4) | 75(1) | 300(3) | 400(2) | 9.40±1.52de | 10.63±0.63de | 24.93±4.93b | 5.87±.873abc |
注：括号中的数字分别代表正交设计中4个水平的处理;不同小写字母表示在0.05水平下差异显著。 | |
Note: Numbers in brackets represent four levels of processing in orthogonal design. Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level. |
图2 4种睡莲花粉在最适培养基中的萌发A：‘默笙’花粉;B：澳洲原生浅色睡莲花粉;C：澳洲原生深色睡莲花粉;D：‘白巨睡莲’花粉 Fig. 2 Germination of pollens of four Nymphaea Anecphya in optimum medium A: The pollen of N. ‘Moshen’; B: The pollen of N. immutabilis subsp. immutabilis blue form; C: The pollen of N. immutabilis subsp. immutabilis purple form; D: The pollen of N. ‘Gigantea Albertde Lestang’. |
2.3 不同保存条件对花粉离体萌发率的影响
由图3可知,随着花粉保存时间的增加,萌发率大幅度下降。-70 ℃保存的花粉24 h以后花粉萌发率下降至0。常温、4、-20、-40 ℃保存的花粉72 h以后萌发率下降至0。花粉在4 ℃条件下保存效果相对较好,24 h后的萌发率由31.84%下降至18.88%;48 h后,萌发率进一步降至4.32%。花粉在4 ℃条件下保存24 h和48 h时的萌发率均高于其他温度处理,表明‘默笙’澳系睡莲的花粉相对适合在4 ℃条件下保存。
如图4所示,‘白巨睡莲’花粉的初始萌发率较低,花粉随着保存时间的增加,萌发率呈下降趋势。-70 ℃条件下保存24 h,萌发率为0;常温条件下保存48 h,花粉无萌发;-4、-20、-40 ℃条件下保存72 h,萌发率降至0。花粉在4 ℃条件下保存24 h,萌发率小幅度下降,由9.73%降至9.05%;48 h后,萌发率大幅度降至2.61%。花粉在常温、-20、-40、-70 ℃下保存24 h,萌发率均大幅度下降,分别为2.71%、3.66%、2.08%、0。结果表明‘白巨睡莲’在4 ℃条件下可保存24 h。
由图5可知,澳洲原生浅色睡莲的花粉随着保存时间的增加,萌发率大幅度下降,不同温度下保存24 h后,萌发率降至10%以下,48 h后均下降至2%以下,72 h后萌发率为0。花粉在4 ℃下处理效果相对略好,24 h后萌发率由43.90%下降至7.02%,略高于其他的温度处理;48 h后,萌发率降至1.65%。花粉在-20 ℃条件下保存24 h,萌发率由44.90%下降至7.02%,仅次于4℃的处理;48 h后,萌发率降至1.81%,略高于其他的温度处理。
如图6所示,澳洲原生深色睡莲花粉随着保存时间的增加,萌发率大幅下降。在常温、-20、-40、-70 ℃条件下保存48 h,萌发率下降至0。花粉在4 ℃下保存效果相对略好,萌发率略高于其他温度处理,但花粉生活力仍然大幅下降,保存至24 h,萌发率由45.63%下降至15.60%,48 h后萌发率进一步下降至1.52%,72 h后萌发率为0。
3 讨论
蔗糖是影响植物花粉萌发的重要因素,为花粉萌发和花粉管生长提供能源物质,同时维持着花粉细胞外界环境的渗透压[20,21,22],H3BO3能增加花粉对糖的吸收、运转和代谢,形成糖硼酸复合体[23,24],Ca2+的动态平衡影响花粉的萌发与花粉管的顶端生长[25]。本研究中,蔗糖的单因素和正交试验结果表明,50、75 g/L的蔗糖配适宜的B3+、Ca2+、K+、Mg2+分别对4种澳系睡莲花粉萌发有较好的促进作用。但是B3+、Ca2+、K+、Mg2+的单因素试验与正交试验结果不完全吻合。例如,在单因素试验的BK培养基中,75 mg/L H3BO3处理的‘默笙’花粉萌发率最高,而在正交试验的9号培养基中,125 mg/L H3BO3处理的‘默笙’花粉萌发率更高,其原因可能是各因素存在交互作用,H3BO3与不同浓度的蔗糖、Ca2+、K+、Mg2+互作产生了不一样的效应。毛立彦等[13]对‘保罗兰’睡莲花粉的研究发现,蔗糖、CaCl2、H3BO3对睡莲花粉萌发存在极显著的交互作用;常海龙等[26]研究表明,在硼酸、蔗糖、硝酸钙、硫酸镁4个因素中,蔗糖对甘蔗花粉萌发的影响最大,硼酸次之,它们对花粉管的生长最为关键。4种澳系睡莲花粉的最适培养基的各组分浓度不同,合理配比可以增加花粉的萌发率。通过花粉离体萌发法,可以直观、有效地评价花粉生活力,在睡莲的杂交育种过程中,对于父本材料的筛选有指导意义。在本研究中,‘白巨睡莲’的花粉生活力较低,不适宜作为父本育种材料。