红棕象甲（Rhyncophorus ferrugineus）是我国重要的林业检疫害虫[1],也是国际上重要的棕榈害虫[2],对棕榈植物（椰子、油棕、椰枣等）具有致死性高、危害性大、前期危害症状不显著等特点[3]。目前我国对于该虫的防治主要以信息素诱集、茎干药剂注射等为主,其中信息素诱集虽然可以降低成虫基数,但对于茎干内危害的幼虫无效,而药剂茎干注射法可杀死树干内的幼虫,却会对植株形成伤害并有农药残留的风险。
昆虫病原线虫是一类重要的生物防治资源[4],它具有寄生性,可侵入健康幼虫、蛹或成虫体腔,并杀死多种害虫[5,6,7]。昆虫病原线虫一旦进入虫体,就会释放出消化道内的共生细菌,引起寄主败血症使寄主死亡[8,9]。线虫幼虫以寄主组织为食物,在虫尸内生活两到三代后侵染期线虫从死亡的昆虫体内迁移出来,寻找新的寄主[10]。对那些栖境隐蔽、杀虫剂不易作用到的地下害虫、钻蛀害虫,昆虫病原线虫有着其他防治手段所不可比拟的优势[11]。本文针对红棕象甲幼虫具有在树干内危害隐蔽的特性,结合昆虫病原线虫的寄生习性,在室内研究了嗜菌异小杆线虫（Heterorhabditis bacteriophora）H06品系对红棕象甲幼虫的致死效果和毒力水平,以期为红棕象甲的生物防治及昆虫病原线虫的利用提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
供试昆虫病原线虫：嗜菌异小杆线虫（H. bacteriophora）H06品系购自河南济源白云实业有限公司。线虫在室内采用大蜡螟（Galleria mellonella）进行活体繁殖,收获后收集于三角瓶中,静置待线虫沉淀于底层后去除上清液,浅水保存于8 ℃保存柜（华美冷藏柜LC2000D）中备用,保存时间不超过20 d。
红棕象甲幼虫：采用本实验室自繁自育的红棕象甲（R. ferrugineus）3龄幼虫,接种线虫前将红棕象甲试虫浸泡于75%酒精中10 s后晾干待用。
1.2 方法
1.2.1 嗜菌异小杆线虫 H06品系对红棕象甲的生物活性测定 选用3龄感染期线虫（infective juveniles, IJs）,用无菌水稀释为200、400、600、800、1000 IJs/mL共计5个浓度,以移液枪吸取150 μL线虫液点滴于虫体背面,各浓度线虫液接种于红棕象甲体背剂量分别为30、60、90、120、150 IJs/头,处理后将试虫转移至30 mm×30 mm×40 mm的养虫盒中,添加甘蔗块继续单独培养。以相同量的无菌水处理为对照。处理后24、48、72、96、120 h观察红棕象甲死亡情况,以昆虫针轻触虫体无自主反应为死亡标准。每处理接种30头试虫,重复3次。
1.2.2 嗜菌异小杆线虫H06品系侵染后红棕象甲幼虫的形态学观察 选取150 IJs/头线虫剂量处理后的红棕象甲幼虫进行形态学观察,从幼虫死亡开始每48 h观察记录1次,连续观察3次。
1.3 数据处理
根据黄剑等[12]的方法采用Excel统计软件求出毒力回归方程及LD50和LT50、95%置信区间等。LD50值以IJs/头表示,LT50以小时（h）表示,毒力差异显著性以LD50或LT50的95%置信区间是否重叠为标准。
2 结果与分析
2.1 嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲幼虫的致死效果
经不同剂量嗜菌异小杆线虫处理后,红棕象甲幼虫的死亡率与线虫剂量和处理时间均呈正相关（图1）。研究结果表明,在处理后相同时间,随着线虫接种剂量的增加,红棕象甲死亡率增加,以处理后48 h为例,30、60、90、120、150 IJs/头处理组的红棕象甲死亡率分别为25.56%、45.56%、55.56%、64.44%、77.78%;处理后120 h,各处理组的死亡率分别为66.67%、68.89%、91.11%、92.22%、97.78%,其中90、120、150 IJs/头处理组死亡率均超过90%。各剂量处理组中,随着处理时间的延长,各处理的死亡率均呈上升趋势,经150 IJs/头剂量处理后24、48、72、96、120 h,红棕象甲幼虫死亡率分别为51.11%、77.78%、87.78%、90.00%和97.78%。
2.2 嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲幼虫的毒力水平
处理后不同时间嗜菌异小杆线虫对红棕象甲幼虫的毒力水平如表1所示。结果表明,随着处理时间的延长,LD50值呈逐渐降低的趋势。从LD50值的95%置信区间来看,处理后72、96、120 h之间存在重叠,表明三者之间的毒力水平差异不显著,但均与24、48 h处理组差异显著。嗜菌异小杆线虫对红棕象甲幼虫毒力的时间顺序为：120 h、96 h、72 h>48 h>24 h。
表1 嗜菌异小杆线虫H06品系处理后不同时间对红棕象甲幼虫的毒力水平Tab. 1 Toxicity of H. bacteriophora H06 strain to R. ferrugineus larvae at different exposure time |
| 处理时间 Exposure time/h | 毒力回归方程 LD-P line | LD50/(IJs·insect-1） | R值 R value | 95%置信区间 95% confidence interval |
|---|---|---|---|---|
| 24 | y=2.49+1.08x | 211.56 | 0.90 | 127.63~350.67 |
| 48 | y=1.50+1.90x | 69.15 | 0.99 | 60.00~79.70 |
| 72 | y=2.62+1.49x | 39.50 | 0.87 | 29.79~52.37 |
| 96 | y=2.87+1.50x | 26.43 | 0.86 | 17.64~39.60 |
| 120 | y=1.91+2.23x | 24.12 | 0.92 | 17.53~33.18 |
注：以LD50的95%置信区间是否重叠作为显著性差异的判断标准。 | |
Note: Significant criteria is whether 95% FL of LD50 overlaps or not. |
不同剂量线虫处理对红棕象甲幼虫的致死时间（LT50）测定结果如表2。结果表明,随线虫接种剂量的增加,对红棕象甲幼虫的致死时间（LT50）逐渐缩短。每头红棕象甲幼虫接种30、60、90、120、150 IJs/头线虫后,红棕象甲的LT50分别为74.18、64.14、42.49、34.30、24.31 h。95%置信区间对比结果表明,150 IJs/头剂量处理后的LT50值显著低于90、60、30 IJs /头剂量处理组;120 IJs/头剂量处理组LT50值也显著低于60、30 IJs/头剂量处理组,说明整体上线虫的接种剂量与对红棕象甲幼虫的致死时间呈负相关。
表2 不同剂量嗜菌异小杆线虫H06品系处理对红棕象甲幼虫的LT50Tab. 2 LT50 of R. ferrugineus larvae treated with different doses of H. bacteriophora H06 strain |
| 剂量 Dose/(IJs·insect-1) | 毒力回归方程 LT-P line | LT50/h | R值 R value | 95%置信区间 95% confidence interval |
|---|---|---|---|---|
| 30 | y=1.38+1.93x | 74.18 | 0.95 | 64.25~85.65 |
| 60 | y=2.16+1.57x | 64.14 | 0.99 | 54.34~75.70 |
| 90 | y=1.03+2.44x | 42.49 | 0.97 | 36.99~48.80 |
| 120 | y=1.33+2.39x | 34.30 | 0.99 | 28.84~40.80 |
| 150 | y=1.45+2.56x | 24.31 | 0.97 | 19.32~30.59 |
注：以LT50的95%置信区间是否重叠作为显著性差异的判断标准。 | |
Note: Significant criteria is whether 95% FL of LT50 overlaps or not. |
2.3 嗜菌异小杆线虫H06品系侵染红棕象甲幼虫的形态学结果
3 讨论
生物防治被认为是有害生物治理中对环境安全性较高的方法之一。昆虫病原线虫作为重要的生物防治资源,近年来越来越受到人们的关注,如滑莎等[13]探讨了4种昆虫病原线虫对舞毒蛾（Lymantria dispar Linn.）幼虫的侵染效果,结果显示,Sc-All和Sf-IGA线虫均对舞毒蛾幼虫具有很强的侵染能力;钱秀娟等[14]选用昆虫病原线虫Steinernema feltiae 0619 HT品系,以线虫浓度1000 IJs/mL与低剂量吡虫啉（10 mg/L）混配,对韭菜异迟眼蕈蚊（Bradysia odoriphaga Yang et Zhang）幼虫的校正死亡率比单用吡虫啉更高,表明昆虫病原线虫与低剂量吡虫啉混用,对异迟眼蕈蚊有明显的增效作用;陈瑞等[15]研究表明,昆虫病原线虫制剂对萝卜地黄曲条跳甲（Phyllotreta striolata Fab.）幼虫具有较好的防治作用,在萝卜播后0、15、30 d各施用1次,小区试验防效可达75%以上;李根等[16]测定了斯氏线虫（S. carpocapsae）和异小杆线虫（H. bacteriophora）共5个品系对小地老虎（Agrotis ypsilon Rottemberg）幼虫和蛹的致病力,结果表明,5个不同昆虫病原线虫品系均对小地老虎幼虫具有致病力,其中Sc-A11线虫对小地老虎的致死速度最快。这些研究结果均表明昆虫病原线虫在害虫的生物防治方面具有很高的应用潜力。
在利用昆虫病原线虫防治红棕象甲方面,国外已经开展了部分研究。如Santhi等[17]通过遗传改良技术提升了昆虫病原线虫对红棕象甲幼虫的搜索能力;Llacer等[18]研究了小卷蛾斯氏线虫甲壳聚糖制剂对红棕象甲的小区防治实验,表明其对红棕象甲具有较好的防治效果。Dembilio等[19]通过研究表明,昆虫病原线虫在田间对红棕象甲幼虫的防治效果与吡虫啉相当。而国内在这方面的研究报道较少。本研究结果表明,昆虫病原线虫嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲幼虫具有一定的致死效果,且随着线虫接种剂量的增加,红棕象甲的死亡率呈递增的趋势,当接种剂量从30 IJs/头增加到150 IJs/头时,处理后120 h红棕象甲幼虫的死亡率从66.67%提高到97.78%。
毒力数据对比结果表明,随着处理时间的延长,嗜菌异小杆线虫H06品系对红棕象甲的毒力水平提高,LD50值逐渐降低,其原因可能是由于线虫通过虫体表面的气孔、足基部的薄弱部位等地方侵入,且线虫在寄主体内需要一定时间才可发挥作用,因此随着时间的延长,侵入虫体内部的线虫数量逐渐增加,侵入的线虫个体通过取食虫体营养和排出细菌等,引起红棕象甲死亡数量的累计增加。同时在各处理中,随着处理剂量的提高,红棕象甲的LT50值降低,表明虫体接种的线虫越多,侵入虫体的线虫数量相应增多,虫体死亡时间越短,因此适当提高线虫的接种浓度可提高其对红棕象甲的防治效果,且随着时间的延长,防治效果愈加显著。
“椰风海韵”是海南的一张名片,椰子、槟榔、大王棕等棕榈植物在海南大量种植,但近年来这些植物受到红棕象甲的严重危害。本文初步探索了利用昆虫病原线虫嗜菌异小杆线虫H06品系防治红棕象甲的可能性,符合海南省建设“国际生态旅游岛”的战略规划,有利于促进加快实施海南省的生态省建设工程和农业可持续发展,同时可为红棕象甲生防资源的选择和生物防治技术的制定提供有利支撑。本研究结论是基于室内研究,供试的昆虫病原线虫和红棕象甲均为室内种群,虽然研究结果与田间应用结果可能会有所偏差,但仍可为红棕象甲生物防治技术的研发提供很好的技术参考。同时如何将本结果应用到田间,会涉及到线虫应用器械、使用关键期、线虫剂型的制作等方面,均需进一步研究。