火龙果（Hylocereus spp.）是典型的长日照植物,其中红肉类型的临界日照时长为12 h[1]。在北半球地区,火龙果的自然花期为5—10月[2],采用人工补光方式延长光周期可诱导火龙果在非自然产期开花,实现周年生产[2]。在温度适宜、植株无花果负载的情况下,持续补光15~45 d即可诱导红肉类型火龙果的花芽形成和发育[3,4],火龙果成花与光照时间密切相关。
植物成花受自身遗传因子和外界环境因素的共同影响,光周期是主要成花途径之一[5,6]。植物节律钟输出基因GIGANTEA（GI）是光周期途径调控开花的关键基因之一[7],通过应答光周期信号进而调控CONSTANS（CO）和flowering locus T（FT）等开花促进基因[8,9]。在长日照条件下,拟南芥（Arabidopsis thaliana）GI基因突变体开花时间延迟[10],而超表达GI能让拟南芥提早开花[11]。长日照单子叶模式植物二穗短柄草（Brachypodium distachyon）的GI同源基因表达产物也能促进开花[12]。应用基因转化技术将BoGI反义链导入甘蓝（Brassica oleracea）后,其花期明显推迟[13],说明BoGI行使促进成花功能。GI同源基因在上述长日照植物中具有功能保守性,而在水稻（Oryzasativa）、大豆（Glycine max）和牵牛花（Pharbitis nil）等短日照植物中的作用却不尽相同。超表达OsGI在长、短日照情况下均导致水稻延迟开花[14,15];在牵牛花中过表达PnGI同样可以延迟花期[16],而大豆GmGI能与FKF1/FKF2蛋白互作而促进开花[17]。GI及其同源基因的功能在不同日照类型的植物中存在一定的差异。国内外关于火龙果光周期途径调控成花的研究报道较少,鉴定火龙果GI同源基因并分析其功能具有重要意义。
本研究以自交亲和型火龙果新品系黔蜜龙为试验材料,克隆获得了GI同源基因编码区的cDNA序列并进行了结构、系统进化和表达模式分析,以期为进一步研究火龙果GI同源基因功能奠定基础,为基于延长光周期的火龙果产期调控技术提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
以黔蜜龙火龙果[Hylocereus polyrhizus（Weber）Britton & Rose]为材料,在农业农村部火龙果种质资源保护贵州创新基地（25°21′18′′~ 25°21′27′′N,105°46′14′′~105°46′36′′E）进行补光处理,具体参考严佳文等[18]的方法。采集处理1、8、15、21 d和相应对照2年生向阳面结果枝刺座周围约1 cm2见方的肉质茎,以及自然条件下生长的火龙果根、茎、茎芽、花芽和果皮（花谢后10 d）。所有样本采集时间均为15：00时左右,3次生物学重复,液氮速冻后保存在-80 ℃超低温冰箱备用。
1.2 方法
1.2.1 RNA提取及cDNA合成 采用TRIzol试剂提取火龙果总RNA,具体方法参照试剂说明书（Invitrogen,美国）。用NanoDrop 2000检测总RNA的浓度和纯度,Agilent 2100测定RNA完整性。选取RIN值≥7.0、OD260/280≥1.8、OD260/230≥1.5的总RNA用于cDNA合成,具体方法参照逆转录试剂盒说明书（Promega,M1701,美国）。
1.2.2 基因克隆和测序 根据前期获得的unigene序列,应用Primer 5.0软件设计GI同源基因的扩增引物,引物信息见表1。PCR反应体系为20 μL,包含10×PCR buffer 2.0 μL、10 mmol/L的dNTPs 2 μL、2.5 μmol/L的引物HpGI-F、HpGI-R各2 μL,Taq DNA聚合酶（TaKaRa,RR02MQ,大连）1 U,cDNA 2 μL,去离子水补充体积至20 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s,58 ℃复性45 s,72 ℃延伸4 min,35次循环;最后72 ℃延伸10 min。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测并以胶回收试剂盒（TransGen Biotech,北京）进行纯化。回收片段采用pMD18-T克隆试剂盒（TaKaRa,大连）进行TA克隆,随机选取5个阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序,应用NCBI数据库中的ORF finder程序（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/orffinder/）预测目的基因的开放阅读框（open reading frame,ORF）并获得氨基酸序列。
表1 火龙果HpGI基因克隆及表达分析引物Tab. 1 Primers for HpGI gene cloning and expression analysis |
| 引物名称 Primer name | 引物序列（5′-3′） Primer sequence (5′-3′) | 引物用途 Primer application |
|---|---|---|
| HpGI-F | ATCGTGTGATTGCTGTTCGTC | ORF 序列扩增 |
| HpGI-R | ATACCCACTTTACGGTCACCC | |
| qHpGI-F | CAGCCTCTTCATCGCTCACA | 定量RT-PCR |
| qHpGI-R | CGACGAACAGCAATCACACG | |
| ACTIN-F | GAACAATGTTACCATACAGGTC | |
| ACTIN-R | CAGCCCTCATTCATTGGTAT |
1.2.3 序列分析和系统进化树的构建 应用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）预测蛋白分子量、等电点和疏水性。应用PredictProtein（https://www.predictprotein.org/）在线工具进行蛋白质二级结构预测。应用PSORT在线工具（http://www.psort.hgc.jp/）、TMHMM Serverv. 2.0（http://www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM/）和SignalP Serverv.3.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP-3.0/）分别进行亚细胞定位分析、跨膜螺旋区预测和信号肽预测。应用蛋白质结构域分析程序SMART（http://www.smart.embl.de/）预测其功能结构域。在NCBI数据库中下载已报道的其他植物的GI蛋白序列,应用MEGA7.0软件进行GI蛋白的系统发育分析。采用ClustalW进行多序列比对,设置自展值为1000,以Neighbor Joining法构建系统进化树。
2 结果与分析
2.1 HpGI基因克隆
以cDNA为模板,应用引物HpGI-F、HpGI-R扩增GI同源基因序列。凝胶电泳结果显示,扩增产物大小与预期的3686 bp接近（图1）。测序得到的碱基序列与前期获得的unigene序列仅有2个碱基差异,一致性为99.95%。应用ORF finder预测ORF长度为3537 bp,将该GI同源基因序列命名为HpGI,GenBank登录号为MK609546。
2.2 HpGI基因生物信息学分析
2.2.1 HpGI编码蛋白理化性质分析 HpGI编码1178个氨基酸组成的蛋白,分子量为129.196 kDa,等电点6.45,带负电荷的氨基酸（Asp+Glu）数量为124,带正电荷的氨基酸（Arg+Lys）数量为115,不稳定指数50.69,平均疏水性值为-0.072,属于亲水性蛋白。亚细胞定位和信号肽预测结果显示,该蛋白定位于细胞核内,没有信号肽输出位点,也没有线粒体靶向肽和叶绿体转运肽,属于非分泌蛋白。跨膜结构预测结果显示,该蛋白无跨膜螺旋区,这一预测结果与其定位于细胞核内相符。
为进一步明确HpGI与其他植物GI同源蛋白之间的亲缘关系,构建了HpGI与甜菜（Beta vulgaris,Bv）、菠菜（Spinacia oleracea,So）、丝石竹（Gypsophila paniculata,Gp）、大樱桃（Prunus avium,Pa）、葡萄（Vitis vinifera,Vv）、桃（Prunus persica,Pp）、甘蓝（Brassica oleracea,Bo）、枣（Ziziphus jujuba,Zj）、大豆（Glycine max,Gm）、枇杷（Eriobotrya japonica,Ej）、番薯（Ipomoea batatas,Ib）、番荔枝（Annona squamosa,As）、菊花（Chrysanthemum morifolium,Cm）、黑麦草（Lolium perenne,Lp）、拟南芥（Arabidopsis thaliana,At）、水稻（Oryza sativa,Os）、玉米（Zea mays,Zm）和苜蓿（Medicago truncatula,Mt）的GI同源蛋白的系统进化树。结果显示,18种GI同源蛋白分成双子叶亚族和单子叶植物亚族,HpGI与拟南芥等同属于双子叶植物亚组（图3）。HpGI与甜菜BvGI（XP 010681268.1）的分子进化距离最近,其次是菠菜SoGI（XP 021849292.1）和丝石竹GpGI（BAW15106.1）。通过系统进化分析,进一步说明HpGI是节律钟输出基因GI的同源基因。
图3 火龙果与其他物种的GI同源蛋白系统进化树Pa：大樱桃;Pp：桃;Ej：枇杷;Zj：枣;Vv：葡萄;Cm：菊花;Gm：大豆;Mt：苜蓿;Gp：丝石竹;Hp：火龙果;Bv：甜菜;So：菠菜;Bo：甘蓝;At：拟南芥;As：番荔枝;Lp：黑麦草;Os：水稻;Zm：玉米。 Fig. 3 Phylogenetic tree of GI homologous proteins from different plant species Pa: Prunus avium; Pp: Prunus persica; Ej: Eriobotrya japonica; Zj: Ziziphus jujuba; Vv: Vitis vinifera; Cm: Chrysanthemum morifolium; Gm: Glycine max; Mt: Medicago truncatula; Gp: Gypsophila paniculata; Hp: Hylocereus polyrhizus; Bv: Beta vulgaris; So: Spinacia oleracea; Bo: Brassica oleracea; At: Arabidopsis thaliana; As: Annona squamosa; Lp: Lolium perenne; Os: Oryza sativa; Zm: Zea mays. |
2.3 HpGI表达分析
图4 HpGI基因在火龙果不同组织部位的表达情况不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 Fig. 4 Relative expression levels of HpGI gene in different organs of H. polyrhizus Different lowercase letters mean significant difference (P<0.05). |
3 讨论
GI基因最初从拟南芥中克隆,编码含有1173个氨基酸的蛋白[7]。近年来,研究者们从其他植物中克隆到GI同源基因所编码蛋白大小存在一定的差异。黑麦草LpGI（CAY26028.1）最小,含1148个氨基酸,而枣ZjGI（XP_015886353.1）含有1181个氨基酸。本研究克隆的火龙果GI同源基因开放阅读框序列为3537 bp,编码1178个氨基酸,大小与拟南芥AtGI（NP_564180.1）和枣ZjGI更接近。亚细胞定位预测结果表明,火龙果HpGI（MK609546.1）既没有信号肽输出位点和跨膜螺旋区,也没有线粒体靶向肽和叶绿体转运肽,定位于细胞核,属于非分泌蛋白,这与菊花[19]、甘蓝型油菜（Brassica napus）[20]、番荔枝[21]和番薯[22]等植物中的研究结果一致。HpGI与其他GI同源蛋白的序列比对结果显示,HpGI与甜菜BvGI的一致性高达85.41%,与拟南芥、水稻和玉米的GI蛋白一致性分别为72.51%、69.09%和68.78%,且存在多处高保守性的氨基酸残基。系统进化分析结果表明,HpGI与AtGI、BvGI等同属于双子叶植物亚族。以上结果表明,HpGI是节律钟输出基因GI的同源基因。
在光周期途径调控植物开花的过程中,GI基因感受和响应光敏色素和生物节律钟信号进而调控下游开花相关基因的转录水平[7,8,9]。HpGI基因在火龙果的根、茎、茎芽、花芽和果皮中均有表达,但在茎、花芽中的表达量显著高于其他组织,在根中的表达量最低。前人研究表明：甘蓝型油菜BnGI在不同组织中表达情况为分生组织>茎>叶>花蕾>果实>根[20];番荔枝AsGI在叶片、花蕾中的表达量高于顶芽和果实[21]。HpGI与BnGI、AsGI的表达模式较为一致,这可能是因为叶（茎）和花是感受光周期和响应生物节律信号更为敏感的部位。人工补光处理8 d后,HpGI在火龙果茎中的表达量显著高于对照和处理1 d时,而对照中的表达量始终无显著变化。短日照植物菊花暗处理13 d后,CmGI表达量显著上调[19]。采用补光措施延长长日照植物的光周期,或者采用遮光措施缩短短日照植物的光周期,均能诱导GI同源基因的表达量上调而促进开花。综上所述,HpGI基因可能在延长光周期而诱导火龙果成花的过程中发挥作用。
本研究克隆了火龙果GI同源基因,命名为HpGI。通过生物信息学、组织特异性和延长光周期后的基因表达分析,初步研究了该基因表达产物的理化性质、进化关系及其对光周期的响应特征,为进一步阐释其功能奠定了基础。后续研究拟将HpGI基因导入拟南芥GI突变体,验证其功能。此外,通过分析与之互作或受其调控的光周期途径成花相关基因的表达模式,从分子水平揭示HpGI的作用机制。