Morphological Development of Primary Laticifers in Shoots of <i>Hevea brasiliensis</i> Muell. Arg

TAN Deguan; Anuwat KUMPEANGKEAW; HAN Bingying; FU Lili; SUN Xuepiao; ZHANG Jiaming

doi:10.3969/j.issn.1000-2561.2020.05.006

Chinese Journal of Tropical Crops >

2020 , Vol. 41 >Issue 5: 881 - 887

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2020.05.006

Phytophysiology and Biochemistry

Morphological Development of Primary Laticifers in Shoots of Hevea brasiliensis Muell. Arg

TAN Deguan ¹ ,
Anuwat KUMPEANGKEAW ¹^,² ,
HAN Bingying ¹ ,
FU Lili ¹ ,
SUN Xuepiao ¹ ,
ZHANG Jiaming ^,¹^,^*

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1. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences (CATAS) / Hainan Academy of Tropical Agricultural Resource, CATAS / Key Laboratory of Tropical Crop Biology and Genetic Resources, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Haikou, Hainan 571101, China
2. Song Khla Rubber Research Centre, Department of Agriculture, Ministry of Agriculture and Cooperatives, Had Yai, Song Khla 90110, Thailand

* ZHANG Jiaming,E-maill: zhangjiaming@itbb.org.cn。

Received date: 2019-07-09

Request revised date: 2019-08-20

Online published: 2020-06-15

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Abstract

The primary laticifers of Hevea brasiliensis Muell. Arg present mainly in young trunks, shoots, leaves, flowers, and fruits. However, its morphological development is unknown. Two methods, parafin section and modified alkali-treated stripping were used to study the development of the primary laticifers in this study, and the latter was found superior to the former by continuous observation of the whole developmental process. The morphological development of the primary laticifers of different stages was systematically investigated using the modified alkali-treated stripping method. The results showed that the laticifers isolated from different positions of the bronze-stage shoots were morphologically distinct. The laticifers close to the apical meristem were longtube-like linear structures without end-walls and branches, and protrusive growth was not obvious. The lacifers at 7 cm away from the apical meristem had obvious intrusive growth and bead-like structures, which resulting in increase in the diameter of laticifers. The laticifers at 14 cm away from the apical meristem were significantly enlarged in diameter, and contained more bead-like structures, and the bead-like structures between the neighboring laticifers were connected to form laticifer bridges, which resulting in the formation of a laticifer network. The laticifers isolated from different positions of the stable-stage shoots were morphologically similar, and the density of the protrusions or bead-like structures and the laticifer bridges was significantly higher than that in bronze-stage shoots, and complex laticifer networks were formed in the barks at all positions. The primary laticifers were proved to be multinuclear as well. The results of this study indicate that the primary laticifers in the rubber tree shoots are non-articulated and anastomosing, and belong to a novel type of laticifers. This study would play an important role in the fundamental research of the plant laticifer development.

Key words： Hevea brasiliensis Muell. Arg; primary laticifer; novel type of laticifer; non-articulated and anastomosing laticifer

Cite this article

TAN Deguan , Anuwat KUMPEANGKEAW , HAN Bingying , FU Lili , SUN Xuepiao , ZHANG Jiaming . Morphological Development of Primary Laticifers in Shoots of Hevea brasiliensis Muell. Arg[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2020 , 41(5) : 881 -887 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.05.006

橡胶树（Hevea brasiliensis）属大戟科橡胶属,是热带地区重要的经济作物。据不完全统计,全球产胶作物12500多种,由于橡胶树所产天然橡胶具有产量高、易采收、质量好等优势^[1],是商品天然橡胶的主要来源。

乳管是指一种含有胶乳的特化细胞或一列含有胶乳的并合细胞^[2],它也是橡胶树胶乳生物合成、贮存和运输的场所^[3]。橡胶树的乳管分为2种类型,初生乳管和次生乳管^[4,5]。初生乳管是植物体初生生长时形成的乳管,主要存在橡胶树的幼嫩树干、枝条、叶片、花和果实中,而次生乳管主要存在树干中^[6,7]。橡胶树中初生乳管的胶乳含有一些有毒物质,如羟基腈水解酶,可用来催化腈基类化合物水解,释放氢氰酸,抵御害虫和病原菌的侵害^[8]。

目前尚欠缺对橡胶树初生乳管系统发育的研究。吴继林等^[4]采用石蜡制片的组织化学染色法研究橡胶树幼茎中初生乳管的发育,认为其为有节联结乳管;而采用剥离的方法观察到幼茎中初生乳管具有很多长的分枝,认为橡胶树初生乳管为无节乳管^[9]。导致这些研究结果的差异可能是由于研究方法和研究材料的差异所造成。本研究采用了改良的碱处理剥离法,系统研究橡胶树枝条不同发育时期、不同部位初生乳管的形态特征,克服了前人研究的局限性,发现橡胶树初生乳管属于一种新型乳管类型——无节联结乳管。

1 材料与方法

1.1 材料

橡胶树品种‘热研7-33-97’芽接苗种植于中国热带农业科学院热带生物技术研究所苗圃中,分别选取古铜期和稳定期的枝条作为实验材料。

1.2 方法

1.2.1 石蜡制片的组织化学染色法研究枝条初生乳管石蜡制片的组织化学染色法参考田维敏等^[10]的方法进行。用古铜期的枝条作为实验材料,选取距离顶端分生组织14 cm处的茎段,立刻置于75%乙醇中,抽真空,室温固定2 d。将固定好的材料经乙醇系列脱水,冰醋酸过渡处理4 h,溴碘染液处理48 h,冰醋酸浸洗3次（每次2 h）,无水乙醇置换冰醋酸3次（每次1 h）,经正丁醇透明后进行石蜡包埋、切片,切片厚度10 µm。切片用二甲苯脱蜡,固绿染色,二甲苯透明,中性树胶封片,光学显微镜下观察研究初生乳管。

1.2.2 改良的碱处理剥离法分离和研究初生乳管橡胶树枝条初生乳管的分离参考Zhao^[9]的碱处理剥离法,并进行改良。选取古铜期和稳定期的枝条,去除叶片,分别切取顶端分生组织部位和距顶端7、14 cm处的茎段,立刻置于75%乙醇中,抽气后室温条件下固定2 d。将固定好的茎段置于10% KOH溶液中,100 ℃处理10 min,再置于自来水中漂洗30 min,于解剖镜下用镊子小心将乳管从树皮中分离出来。

用溴碘染色法^[10]对剥离的初生乳管染色。剥离的初生乳管经乙醇/正丁醇系列脱水,醋酸过渡处理2次,每次30 min,溴碘染液染色10 min,光学显微镜下观察乳管的形态。

1.2.3 初生乳管细胞核观察将初生乳管从古铜期枝条剥离出来,乙醇/正丁醇系列脱水,石蜡包埋,滑走切片机上切片,切片厚度为8 µm。切片用二甲苯脱蜡,于环已烷溶液中处理6 h。将处理好的切片复水,于卡宝品红染液中处理8 min,光学显微镜下观察乳管细胞核情况。

2 结果与分析

2.1 2种制片方法观察乳管形态的比较

石蜡制片是研究植物乳管的经典方法,已被广泛应用于研究橡胶树乳管发育^[11,12,13]。碱处理剥离法应用较少。本研究以距顶端分生组织14 cm的古铜期枝条嫩茎为材料,比较了2种制片方法的观察效果。

利用石蜡制片法,观察到初生乳管细胞、乳管细胞之间的桥联结构以及乳管外凸结构（图1A,图1B）。然而,由于乳管是弯曲的延伸结构,不在同一平面,乳管在同一个切片上往往时隐时现（图1A,图1B）,一次只能观察到乳管的局部。需要通过观察多个切片,来推测乳管网络的结构。另外,由于有时脱蜡不充分,或者受乳管周围细胞的细胞壁折射的影响,可能观察到疑似端壁的结构（图1C）,因而将初生乳管误判为有节乳管。

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图1 2种乳管研究方法观察结果比较

A、B、C:石蜡制片染色法研究距顶端分生组织14 cm处初生乳管（纵切面）;D与E:改良碱处理剥离法研究相同部位初生乳管,其中E为初生乳管3D图象。蓝色箭头所示初生乳管;红色箭头所示乳管桥;绿色箭头所示外凸或珠状结构;紫色箭头所示疑似端壁结构。标尺=40 µm。

Fig. 1 Comparison of parafin section method and modified stripping method in studies of primary laticifers in rubber tree shoots

A, B, C: longitudinal paraffin section of the primary laticifers at 14 cm away from the apical meristem of bronze-stage shoots. D and E: partially isolated primary laticifers using modified stripping method isolated from the same position of bronze-stage shoots, and E is the 3D image of primary laticifers. Blue arrows indicated primary laticifers; red arrows indicatd laticifer bridges; green arrows indicated protrusions or bead-like structures; purple arrows indicated suspected articulated structures. Bars=40 µm。

利用改良剥离法分离到完整的乳管网络,可以将整个乳管网络放在同一个平面上观察（图1D,图1E）。可以观察到石蜡切片中所观察到的外凸结构、乳管之间的桥联结构、乳管的3D结构等,还可以排除石蜡和周围细胞对观察结果的影响。

另外,石蜡制片操作步骤烦琐,实验周期较长;改良碱处理剥离法操作简单方便,实验周期短。综上所述,改良碱处理剥离法优于石蜡制片法。

2.2 用改良的碱处理剥离法研究橡胶树枝条初生乳管形态发育

橡胶树枝条发育经历古铜期、变色期、淡绿期、稳定期等4个阶段^[14,15]。新抽出的枝条呈现古铜色（图2A）;随着发育,叶片颜色逐渐变绿。当发育到稳定期时,茎段硬化,叶片变为深绿色。为了系统研究橡胶树枝条初生乳管发育过程中的形态变化,本研究以古铜期和稳定期的枝条为研究材料,采用改良的碱处理剥离法对2个发育时期枝条中不同部位的乳管进行观察研究。

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图2 利用改良的碱处理剥离法研究橡胶树枝条初生乳管形态发育过程

A~F:古铜期;G~I:稳定期。A:古铜期枝条,B~D:顶端分生组织附近乳管;E:距顶端分生组织7 cm处乳管;F:距顶端分生组织14 cm处乳管;G:稳定期枝条;H:稳定期枝条顶端分生组织附近乳管;I:距顶端7 cm处乳管。蓝色箭头所示乳管;绿色箭头所示乳管外凸或珠状结构;红色箭头所示相邻乳管间乳管桥。B~D:未进行溴碘染色;E、F、H、I:溴碘染液染色。标尺:A、G=1 cm,B~F、H、I=40 µm。

Fig. 2 Morphological development of primary laticifers in rubber tree shoots revealed by observation of isolated laticifers

A-F: Bronze-stage; G-I: Stable-stage. A: A bronze-stage shoot. B-D: Primary laticifers near apical meristems. E: Primary laticifers at 7 cm away from the apical meristem; F: Primary laticifers at 14 cm away from the apical meristems. G: A stable-stage shoots. H: Primary laticifers near the apical meristem. I: Primary laticifers at 7 cm away from the apical meristems. Blue arrows indicated primary laticifers; green arrows indicated protrusions or bead-like structures; red arrows indicated laticifer bridges. B-D: Unstained with iodine-bromine solution; E、F、H、I: Stained with iodine-bromine solution. A and G: Bars=1 cm; B-F, H and I: Bars= 40 µm.

古铜期是橡胶树枝条快速发育时期。初生乳管从顶端分生组织分化而来,枝条不同部位的乳管处于不同发育时期,具有不同的形态。与顶端分生组织紧邻的乳管呈线状,连续观察至少2000 µm长的乳管,没有发现乳管分支,也没有观察到节状结构（图2B）,说明初生乳管在发育初期是不分支的无节乳管。此时,可以观察到部分乳管有少量不太明显的外凸结构,平均每200 µm长的乳管有1.1个外凸结构（表1）,相邻乳管间没有联结（图2B,图2C,图2D）。距顶端7 cm处,乳管在局部的膨大更为明显,形成珠状结构（图2E）,珠状结构密度为2.2个/200 µm为大。这种珠状结构是由外凸结构进一步膨大发育而成。距离顶端分生组织越远,乳管的外凸或珠状结构的密度越大（表1）。在距离顶端14 cm处,珠状或外凸结构的密度达到3.9个/200 µm,显著高于7 cm部位。与此同时,乳管直径明显增大（图2F）,表明初生乳管在发育过程中通过外凸生长并形成珠状结构,再由珠状结构向两端扩展,使乳管整体增粗。同时,在距顶端14 cm处,邻近乳管之间已经通过部分外凸生长联结,形成乳管桥（图2F,表1）,乳管桥密度约为1.4个/ 200 µm密度。

表1 橡胶树枝条2个发育阶段不同部位初生乳管形态比较

Tab. 1 Morphological development of primary laticifers at different positions of two shoot developmental stages

发育时期 Developmental stage	与顶端距离 Distance from tip/cm	外凸或珠状结构密度 Protrusion density/ [个•(200 µm)^-1]	乳管桥密度 Laticifer bridge density/[个•(200 µm)^-1]
古铜期	0	1.1±0.8^a	0
	7	2.2±1.1^b	0
	14	3.9±1.3^c	1.4±0.7^a
稳定期	0	4.8±1.3^d	2.7±1.2^b
稳定期	7	4.3±1.1^dc	3.2±1.1^c

	Note: The density of protrusions or bead-like structures=the number of protrusions in 200 µm laticifer; The density of laticifer bridges = the number of laticifer bridges in 200 µm laticifer. Thirty replicates were carried out in each treatment. SPSS statistical software was used for variance analysis, and different lowercase letters indicated significant difference at 0.05 level.
	注:乳管外凸或珠状结构密度=每条乳管200 µm长度内外凸或珠状结构数量;乳管桥密度=每条乳管200 µm长度内乳管桥的数量。重复计数30次。采用SPSS统计软件进行方差分析,不同小写字母表示差异显著（P<0.5）。

古铜期枝条发育到稳定期后,距枝条顶端不同距离的初生乳管在形态上基本趋同。紧邻顶端分生组织的乳管,其直径也已经变粗,与距顶端7 cm处乳管没有显著差异（图2H,图2I）。不同部位的乳管间,都形成了较多的乳管桥,乳管系统呈现网状结构（图2H,图2I）。不过,距顶端7 cm处乳管的乳管桥密度还是显著高于紧邻顶端的乳管,但外凸或珠状结构的密度差异不显著（表1）。稳定期枝条各部位外凸或珠状结构密度和乳管桥密度均显著高于古铜期枝条相应部位（表1）,表明随着枝条的发育成熟,初生乳管系统的发育也趋于成熟。

上述结果表明橡胶树枝条的初生乳管为无节乳管,乳管通过侧壁外凸生长发育成珠状结构,接着向两侧扩张,使乳管增粗,相邻乳管间通过外凸生长形成乳管桥,最终使整个乳管系统形成网状贯通结构。基于以上研究结果,橡胶树枝条的初生乳管为一种新的乳管类型,即无节联结乳管。

2.3 初生乳管细胞核的染色观察结果

无节乳管是由一个乳管基原细胞通过不断纵向有丝分裂形成,每次分裂的后期不形成细胞板,最终形成具有多细胞核的长管状结构。为了进一步证明橡胶树初生乳管为无节乳管,对古铜期枝条的初生乳管的细胞核进行研究。由于乳管含有丰富的橡胶烃,经各种试剂固定、脱水处理后,橡胶烃变性凝固^[16,17],与细胞核凝聚在一起,影响细胞核的染色。环已烷能溶解橡胶烃^[18]。为了去除橡胶烃对细胞核染色的影响,将制备好的切片用环已烷处理6 h,再进一步用卡宝品红染色,取得了较好的染色效果。

结果表明,初生乳管中即存在处于分裂末期的细胞核（图3A）,也普遍存在没有被端壁隔开的分裂间期的相邻细胞核（图3B）,没有观察到节状结构,进一步证明橡胶树初生乳管为无节乳管。这些结果表明橡胶树初生乳管通过乳管细胞纵向有丝分裂进行延伸,形成长管状的多核细胞。在发育成熟后,邻近乳管间侧面联结,最终形成网状结构。

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图3 橡胶树幼嫩枝条初生乳管细胞核的卡宝品红染色观察

红色箭头所示为细胞核。标尺=40 µm

Fig. 3 Observation of nuclei in carbol fuchsin stained primary laticifers in rubber tree shoots

Red arrows indicate nuclei. Bars=40 µm

3 讨论

植物乳管根据其形态特征,主要分为无节乳管和有节乳管2种类型^[1,2]。有节乳管是由一系列延伸的乳管细胞组成,细胞间相接触的横壁会穿孔融合成串,细胞间存在节状结构。根据乳管侧面联结情况,有节乳管又分为有节无联结乳管和有节联结乳管^[1]。有节联结乳管也形成网状结构,这种类型的乳管常见于橡胶树树干^[19]。无节乳管是由一个乳管基原细胞延伸发育而成。根据有无分枝,无节乳管又进一步分为无节不分枝乳管和无节分枝乳管。无节分枝乳管的分枝在发育过程中不断伸长,最后形成网状结构,但乳管间不会联结融合。这种类型乳管存在于夹竹桃（Nerium oleander）、Euphorbia engelmanni等植物中^{[1, 20]}。无节不分支乳管也不形成乳管间的联结。因此,2种无节乳管都不形成乳管间的联结。本研究发现橡胶树初生乳管发育早期时呈线性,没有端壁,属于无节不分支乳管。然而,随着乳管的发育,侧壁出现一些外凸结构,这些外凸结构会进一步发育成珠状结构。随着发育时间的延长,乳管的外凸或珠状结构的数量显著增加,珠状结构不断向外生长,导致相邻乳管间形成乳管桥,并最终形成网状结构,与典型的无节不分支乳管明显不同。根据其发育形态特征,橡胶树初生乳管不属于已报道的4种类型乳管中的任何一类,而应属于一种新的乳管类型——无节联结乳管。

根据本研究结果,阐明无节联结乳管的发育过程如下:首先顶端分生组织乳管基原细胞进行有丝分裂（图4A）,不形成细胞板,乳管不断延伸成长管状（图4B）。随后乳管细胞侧面外凸（图4C）,外凸结构进一步发育成珠状结构（图4D）。多数珠状结构向两侧延伸使乳管增粗。同时,少数珠状结构向外膨胀,导致相邻乳管相互接触,融合贯通,形成细胞桥（图4E）。随着乳管桥数量的增加,乳管最终形成网状结构（图4F）。

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图4 无节联结乳管潜在的发育过程

Fig. 4 The underlying development model of non-articulated and anastomosing laticifer

Zhao^[9]首次采用碱处理剥离的方法将橡胶树乳管从幼茎中剥离出来,获得离体乳管网络,但他未对材料进行固定预处理,在碱液的处理过程中乳管形态可能会受到影响,同时其只观察了幼茎单个发育阶段的形态,幼茎不同发育阶段乳管的形态仍有待研究。吴继林等^[4]采用石蜡制片法研究橡胶树幼茎中初生乳管的发育情况。由于乳管网络不在一个平面上,导致石蜡制片技术观察乳管网络存在局限性。因此采用改良的碱处理剥离法,克服了Zhao等^[9]乳管易变形的缺点,将不同发育时期的初生乳管都能分离出来,平放在载玻片上观察,获得了前人没有观察到的信息。这些信息包括:（1）古铜期枝条不同部位的乳管,处于不同的发育时期,形态差异较大;稳定期枝条不同部位的乳管,形态趋同。（2）初生乳管在发育初期为不分支的长管状结构,无隔,发育过程中通过外凸形成的珠状结构,珠状结构向两侧延伸使乳管增粗,向相邻乳管扩展则使相邻乳管联结融合形成网状结构,因此,橡胶树初生乳管为无节联结乳管。（3）由于珠状结构的存在,在石蜡制片观察时,可能会被误判为节状结构,导致误判橡胶树初生乳管为有节乳管。

本研究只对橡胶树枝条初生乳管的发育进行研究,橡胶树的叶片、花、果实、根等器官也存在初生乳管,这些器官初生乳管类型及其发育模式是否与枝条相似依然未知,尚需对它们初生乳管的发育进行系统研究。

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1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 2种制片方法观察乳管形态的比较

图1 2种乳管研究方法观察结果比较

2.2 用改良的碱处理剥离法研究橡胶树枝条初生乳管形态发育

图2 利用改良的碱处理剥离法研究橡胶树枝条初生乳管形态发育过程

表1 橡胶树枝条2个发育阶段不同部位初生乳管形态比较

2.3 初生乳管细胞核的染色观察结果

图3 橡胶树幼嫩枝条初生乳管细胞核的卡宝品红染色观察

3 讨论

图4 无节联结乳管潜在的发育过程

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