仙人掌（Opuntia）,又名先巴掌、观音掌、霸王树、龙舌等,为仙人掌科仙人掌属多年生常绿肉质灌木状植物[1,2,3]。其原产于南美洲,现在我国海南、广东、广西、云南、四川及东南亚等热带、亚热带地区均有分布[4,5]。仙人掌果,又名仙掌子,为仙人掌的果实。其表皮呈紫色、青绿色或金黄色,果浆呈紫红色,味酸甜。仙人掌果富含糖、氨基酸、有机酸、维生素、矿物质、果胶、黄酮类等营养物质,具有清热解毒、提高免疫力、抗肿瘤、降低血压血糖、清除自由基、镇痛等作用[6,7,8,9,10,11,12,13]。
色素,分为天然色素和合成色素2种。研究表明,大部分合成色素均有不同程度的毒性,危害人体健康[14,15]。与之相比,天然色素无毒无害,营养价值高,且具有一定的生物活性[16,17]。近年来,合成色素由于安全性差,在品种和数量上均受到了严格的限制。有文献报道,在欧美日等发达国家和地区,天然色素已成为主要的食品着色剂。在我国,自80年代以来,列入食品添加剂卫生标准的天然食用色素品种从几种增加到几十种,相反,批准使用的合成色素已经减为9种[18]。但目前国内外天然色素的种类和数量还比较少,远远满足不了食品、化妆品及药品等行业的发展需求。因此,研究开发新的天然色素具有一定的实际意义。
仙人掌果富含色素。据文献报道,仙人掌果色素为甜菜苷类化合物[7]。仙人掌果色素色泽鲜艳,水溶性好,无毒无害,是一种优质的天然色素[7]。但目前国内对仙人掌果的研究多集中于多糖上,对色素的研究相对较少。目前,色素的提取方法主要有溶剂浸提法,酶提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、超临界CO2提取法等[19,20]。溶剂浸提法是最简单、最常用的方法,工艺简单易行,且提取成本低,但其存在一定的溶剂残留问题;酶提取法不仅可以有效快速地得到目标色素,还能有效去除淀粉、蛋白质、果胶等一系列杂质,但由于酶的活性条件较苛刻,难以运用到实际的生产中;微波辅助提取法具有提取时间短,选择性好,回收率高,试剂用量少,污染低等优点,但因其辐射大,具有明显的热效应,只适用于受温度影响比较小的物料;超声波辅助提取法具有简便快捷,高速高效,无需加热等优点,但超声波发生器噪音大,造成严重的噪音污染,对提取容器壁的厚度要求繁琐,难以进行工业化应用。在天然色素的开发利用过程中,除了提取方法外,色素稳定性的考察亦尤为重要。色素产品需具有良好的稳定性才能满足加工环节中各种条件的变化。
海南岛属热带海洋性气候,阳光充足,自然生长着大量的仙人掌果,但目前当地多以直接食用为主,较少对其进行深加工。为了合理开发利用这一宝贵的绿色资源,本研究以海南三亚野生仙人掌果为原料,运用溶剂浸提法提取仙人掌果色素,并通过L9(34)正交表排列优化提取工艺参数。同时,研究了pH、温度、光照等因素对仙人掌果色素稳定性的影响,以期为仙人掌果色素的开发利用提供一定的理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 新鲜成熟的野生绿皮红心仙人掌果购于三亚市。
无水乙醇、30%过氧化氢、无水亚硫酸钠、六水合硫酸镁,西陇科学股份有限公司;氢氧化钠、盐酸、氯化钾、氯化钙、氯化钠、五水合硫酸铜、七水合硫酸亚铁,广州化学试剂公司;三氯化铁,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;L(+)-抗坏血酸,广州市金华大化学试剂有限公司。以上试剂均为分析纯。
1.1.2 仪器与设备 ME104型精密天平,梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司;TDL-5-A低速台式大容量离心机,上海安亭科学仪器厂;XW-80A旋涡混合仪,海门市其林贝尔仪器制造有限公司;HH-4数显恒温水浴锅,常州澳华仪器有限公司;SHA-B双功能水浴恒温振荡器,江苏金坛亿通电子有限公司;FST-DZ-TA30普利菲尔超纯水制备机,上海富诗特仪器设备有限公司;PHS-3C型pH计,上海仪电科学仪器股份有限公司;Zirbus vaco2冷冻干燥机,北京涵美生物科技发展有限公司;752N分光光度计,上海佑科仪器仪表有限公司。
1.2 方法
1.2.1 仙人掌果色素的提取工艺流程 新鲜仙人掌果→洗净晾干→分离果皮、果籽和果肉,得到果浆→溶剂浸提法提取→离心→定容→色素粗提液。
1.2.2 仙人掌果色素提取的单因素试验 以仙人掌果为原料,一定pH的乙醇水溶液为提取试剂进行提取工艺优化。准确称取一定量的仙人掌果浆,按照一定的料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL）,在一定的温度（30、35、40、45、50 ℃）下,浸提一定的时间（20、40、60、80、100 min）,离心后取上清液,用相应提取试剂定容至25 mL,测其在530 nm的吸光值。
1.2.3 仙人掌果色素提取的正交试验 以吸光值为考察指标,分别研究提取试剂pH、乙醇体积分数、温度、时间对提取效果的影响。在单因素试验的基础上,采用4因素3水平,按L9(34)正交表排列优化乙醇浸提工艺参数,因素水平设计见表1,每组试验重复3次。
表1 正交试验因素水平表Tab. 1 Factors and levels of orthogonal experiment |
| 水平 Levels | 因素Factors | |||
|---|---|---|---|---|
| A提取试剂 pH Extracting solution pH | B乙醇体积分数Ethanol concentration/% | C温度 Temperature /℃ | D时间 Time /min | |
| 1 2 3 | 6.5 7.0 7.5 | 0 10 20 | 25 30 35 | 10 20 30 |
1.2.4 仙人掌果色素得率 将按正交最优方案提取得到的仙人掌果色素溶液冷冻干燥至恒重,按下式计算得率：
$仙人掌果色素得率=\frac{m_{1}}{m_{2}}\times 100\%$
式中：m1为仙人掌果恒重的色素的质量（g）;m2为仙人掌果浆的质量（g）。
1.2.5 仙人掌果色素稳定性的研究 pH：准确移取5 mL仙人掌果色素溶液,分别加入5 mL pH为2、4、6、7.5、8、10的水溶液,并分别测定1 h后其在530 nm处的吸光值。
金属离子、氧化还原剂：准确移取5 mL仙人掌果色素溶液,分别加入5 mL 金属离子（0.01 mol/L的K+、Ca2+、Na+、Mg2+、Al3+、Fe2+、Fe3+、Cu2+）溶液,氧化还原剂（1%、1.5%、2%、2.5%、3%的H2O2、Na2SO3、维生素C）溶液,并分别测定0、6 h其在530 nm处的吸光值。
温度、光照：准确移取8 mL仙人掌果色素溶液,分别在4 ℃、室温和30、45、60、75、90 ℃恒温水浴锅,分别于室内自然光和避光、室外太阳光和避光下放置5 h,每隔1 h在530 nm处测定其吸光值。
1.3 数据处理
实验至少设3个平行,数据以均值±标准偏差（mean±SD）的形式表达。采用SPSS17.0对数据进行单因素方差分析,用One-way ANOVA方法比较数据间的差异显著性。采用Origin 2017软件绘图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 乙醇体积分数的选择 如图1所示,在料液比1∶20（g/mL）,pH 5,40 ℃恒温水浴振荡提取40 min的条件下,随着乙醇体积分数的增加,仙人掌果色素溶液的吸光值呈下降趋势。这可能是由于仙人掌果色素属于水溶性色素,更易溶解在含水量多的试剂中。因此,选择10%乙醇溶液为提取试剂。
2.1.2 料液比的选择 如图2所示,以pH 5的10%乙醇溶液为提取试剂,在40 ℃恒温水浴振荡提取40 min的条件下,随着料液比的增大,仙人掌果色素溶液的吸光值无显著变化。可能是由于当料液比为1∶10（g/mL）时,便已经将果浆中的色素充分提取出来了。因此,为了便于操作,料液比选择1∶20（g/mL）。
2.1.3 提取温度的选择 由图3可知,在料液比1∶20（g/mL）,pH 5的10%乙醇溶液为提取试剂,恒温水浴振荡提取40 min的条件下,随着温度的升高,仙人掌果色素溶液的吸光值不断减小,可能是由于温度升高而使色素分解的缘故。当温度为30、35 ℃时,其吸光值无显著差别。鉴于海南天气炎热,为了便于控制,提取温度选择35 ℃。
2.1.4 提取试剂pH的选择 由图4可知,在料液比1∶20（g/mL）,10%乙醇溶液为提取试剂,35 ℃恒温水浴振荡提取40 min的条件下,随着pH的增大,仙人掌果色素溶液的吸光值呈先上升后下降趋势,在pH 7时达到最大值。因此,选择提取试剂pH值为7。
2.1.5 提取时间的选择 由图5可知,在料液比1∶20（g/mL）,pH 7的10%乙醇溶液为提取试剂,35 ℃恒温水浴振荡提取的条件下,随着振荡时间的延长,仙人掌果色素溶液的吸光值呈先下降后趋于平缓的趋势,在20 min处有最大吸光值。可能是由于随着提取时间的延长,空气的氧化作用使色素成分分解而产生褪色现象,40 min后,易氧化的部分已分解完,故吸光值几乎不变。因此,提取时间选择20 min。
2.2 正交试验结果
采用L9(34)正交试验设计,对试剂pH、乙醇体积分数、温度、时间在3个不同水平上进行优化试验,结果见表2。仙人掌果色素提取试剂的pH、乙醇体积分数、温度、时间的极差分别为0.040、0.010、0.037、0.008,各因素对仙人掌果色素浸提效果影响的主次顺序为pH>温度>乙醇体积分数>时间。仙人掌果色素提取的最佳工艺为A3B1C2D1,即料液比1∶20（g/mL）,提取试剂为pH 7.5的水溶液,温度30 ℃,时间10 min。在此工艺下的仙人掌果色素提取率最高,为(7.75± 0.08)%。
表2 正交试验设计及结果分析Tab. 2 Scheme and experimental results of orthogonal array design |
| 试验号 Test number | A提取 试剂pH Extracting solution pH | B乙醇体积 分数 Ethanol concentration/% | C温度 Temperature /℃ | D时间 Time/ min | A530 nm |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 0.884 |
| 2 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0.901 |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 0.850 |
| 4 | 3 | 2 | 3 | 1 | 0.895 |
| 5 | 2 | 3 | 2 | 1 | 0.898 |
| 6 | 3 | 2 | 1 | 2 | 0.924 |
| 7 | 3 | 1 | 2 | 2 | 0.935 |
| 8 | 2 | 2 | 1 | 3 | 0.888 |
| 9 | 2 | 1 | 3 | 2 | 0.862 |
| k1 | 0.878 | 0.899 | 0.904 | 0.898 | |
| k2 | 0.883 | 0.889 | 0.906 | 0.890 | |
| k3 | 0.918 | 0.891 | 0.869 | 0.891 | |
| R | 0.040 | 0.010 | 0.037 | 0.008 |
2.3 仙人掌果色素稳定性的研究
2.3.1 pH对色素稳定性的影响 由图6可知,当pH为4~10时,仙人掌果色素溶液的吸光值与对照组接近;当pH为2时,其吸光值明显小于对照组。可能是强酸对仙人掌果色素的分子结构具有一定的破坏作用,导致其吸光值下降。
2.3.2 温度对仙人掌果色素稳定性的影响 由图7可知,温度及加热时间对仙人掌果色素的稳定性均有一定程度的影响。在4 ℃、室温、30 ℃避光储存1~5 h,色素溶液的吸光值均无明显变化。45、60 ℃避光加热1~5 h,前3 h吸光值下降相对较快。75、90 ℃避光加热1 h后,其吸光值便骤然下降。此外,加热相同时间条件下,吸光值随温度的升高而递减。由此可见,在仙人掌果色素的提取、使用及保存过程中,应尽量避免高温。
2.3.3 光照对仙人掌果色素稳定性的影响 由图8可知,随着光照时间的延长,在室内自然光和避光条件下,仙人掌果色素溶液的吸光值下降较小,稳定性较好。但在室外太阳光的照射下,见光组与避光组溶液的吸光值均呈急剧下降趋势。光照能加速色素的降解。由此可知,太阳光降低了仙人掌果色素的稳定性。因此,在生产、储存及运输该色素时,应尽量避免阳光直射。
2.3.4 金属离子对仙人掌果色素稳定性的影响 由图9可知,加入Na+、K+、Ca2+、Mg2+溶液的仙人掌果色素溶液与对照组相比,其色素吸光值均无明显下降,而加入Cu2+、Fe2+、Fe3+、Al3+的色素溶液,其吸光值下降急剧,表明这4种金属离子对色素具有一定的破坏作用。其中,Cu2+、Fe3+对色素的稳定性影响最大。此外,色素溶液加入各金属溶液6 h后,其吸光值均小于刚加入（0 h）时的值,即各金属离子对色素均无增色作用。因此,仙人掌果色素不宜与含Cu2+、Fe2+、Fe3+、Al3+的原料接触,尤其是应避免与Cu2+、Fe3+接触。
图10 H2O2对仙人掌果色素稳定性的影响Fig. 10 Effect of H2O2 on the stability of pigment from cactus fruit |
图11 Na2SO3对仙人掌果色素稳定性的影响Fig. 11 Effect of Na2SO3 on the stability of pigment from cactus fruit |
3 讨论
海南盛产仙人掌果,仙人掌果富含清新,明艳的红色素,本研究结合当地地域特色,合理配置资源,运用正交优化溶剂浸提法提取仙人掌果色素,得出的最佳工艺参数为：料液比1∶20（g/mL）,提取试剂为pH 7.5的水溶液,浸提温度30 ℃,浸提时间10 min,在此条件下,仙人掌果色素得率可达7.75%,明显高于马丹雅等[21]的研究结果。马丹雅等[21]以pH 5的70%乙醇为提取试剂,按料液比1∶20（g/mL）,在提取温度50 ℃条件下,提取1 h,色素得率为5.2%;略高于耿晓玲等[22]运用超声辅助提取仙人掌果色素的得率。耿晓玲等[22]以45%乙醇为提取试剂,按料液比1∶30（g/mL）,在250 W的功率下,超声提取65 min,色素得率为7.2%。通过讨论可知,本研究优化后的仙人掌果色素的提取方法,提取试剂为pH 7.5的水溶液,绿色、安全、健康;提取时间为10 min,快捷、高效;提取方法为溶剂浸提法,操作简单、耗能低、成本低、易于实现规模化生产、便于推广、有较强的实用性。
综上所述,本研究优化了仙人掌果色素提取工艺并对其稳定性进行了测定,经研究分析,优化后的提取方法操作简单,绿色安全、高效、成本低,不仅提高了色素得率,而且提取出的色素更耐碱性和自然光照射,具有一定的实用价值,为仙人掌果色素的开发利用奠定了一定的理论基础。