薏苡（Coix lacryma-jobi L.）为禾本科玉蜀黍族薏苡属1年生或多年生草本植物,在中国至少有6000年以上的栽培驯化历史[1],是我国传统的药食兼用经济作物,具有较高的营养价值和药用价值[2,3,4]。其被开发成薏苡仁油注射液、薏苡仁油软胶囊、薏苡酒、薏苡仁饼干、唇膏、面膜等商业产品在市场上推广应用[5,6,7,8]。目前,贵州是我国薏苡种植、加工和销售的第1大省,已有近百年的栽培历史[9,10,11,12]。但是由于多年来科研者们对薏苡种质资源收集、保护、创新利用意识浅薄,导致生产上栽培品种单一,主要以兴仁小白壳作为主栽品种[13,14],野生薏苡资源也锐减[15,16]。尤其是近年随着我省经济的迅速发展和农业产业结构的调整,薏苡种植面积逐步扩大,栽培品种单一的问题日益凸显,而种质资源是作物优良基因的载体,是作物遗传改良、创新种质的重要前提[17,18]。因此,基于现有薏苡种质资源挖掘出一批具有潜在优势的薏苡新品种成为当前势在必行的工作。
核心种质是以最小的资源数量和遗传重复最大程度地代表整个遗传资源的多样性,其建立既保证了遗传多样性,又减少了资源数量,也是种质资源高效管理和有效利用的重要方法[19,20]。自Frankel等[21]首次提出核心种质（core collection）的概念以来,国内外有关核心种质库的研究逐步增多,尤其是基于某作物或某一地区收集的种质资源构建核心种质库成为研究的热点。例如一些研究者基于表型或分子数据构建了辣椒[22]、烟草[23]、小麦[24]、甜瓜[25]、广西野生水稻[26]、山西普通菜豆[27]等多种农作物的核心种质库,为遗传育种中选择特异基因型材料、保护种质资源、种质创新等奠定了重要基础。目前,国内外关于薏苡的研究报道局限于部分材料的遗传多样性、亲缘关系、营养组成、药用成分等方面的研究较多[28,29,30],关于薏苡种质资源的收集、保存、鉴定的报道相对较少,而基于薏苡种质资源构建核心种质库的研究还鲜见报道。本研究以产地分组+逐步聚类法对本单位（贵州省农业科学院亚热带作物研究所）在贵州、云南、四川、广西、湖南、湖北、福建等地区收集保存的248份薏苡种质资源的14个重要表型性状进行鉴定和评价,旨在剔除重复种质,构建薏苡初级核心种质库,保护现有薏苡种质资源,扩大贵州薏苡育种的基因资源库,为今后薏苡种质的遗传改良、创新利用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
供试248份薏苡种质是贵州省农业科学院亚热带作物研究所自2012年以来在贵州、云南、广西、江苏、浙江、四川、湖南、湖北、福建等10个省（区）收集获得,供试材料地理来源和样本量详见表1。
表1 收集248份薏苡种质资源区域资料Tab. 1 General information of 248 accessions of C. lacryma-jobi L. collected from ten regions |
| 材料来源 Source of materials | 样本量 Sample size |
|---|---|
| 贵州 | 61 |
| 云南 | 89 |
| 广西 | 43 |
| 四川 | 15 |
| 江苏 | 7 |
| 浙江 | 12 |
| 湖南 | 1 |
| 湖北 | 1 |
| 福建 | 1 |
| 未知 | 18 |
1.2 方法
1.2.1 表型性状鉴定 供试材料于2018年种植在贵州省亚热带作物研究所资源圃中,按采取地点+序号,每份材料种植5行,行长4 m,行距0.6 m,株距0.4 m,每穴1株。按照石明等[31]《薏苡种质资源描述规范和数据标准》和《薏苡新品种特异性、一致性和稳定性测试指南》对薏苡表型变异较大的株高、茎粗、叶长、叶宽、总分蘖数、主茎分枝数、主茎节数、粒长、粒宽、百粒重等10个数量性状和果壳颜色、总苞形状、总苞光泽、总苞条纹等4个质量性状进行统计和赋值。
1.2.2 薏苡初级核心种质构建 聚类分析的表型性状共14个。根据前人的研究结果[25],按平均值（X）和标准差（δ）将株高、茎粗、叶长、叶宽、总分蘖数、主茎分枝数、主茎节数、粒长、粒宽和百粒重10个数值性状分为10级,1级≤X-2δ,10级>X+2δ,中间每级间相差0.5δ;果壳颜色、总苞形状、总苞光泽和总苞脊4个描述性状按表2赋值。参照李自超等[32]的方法,将供试材料按地理来源分组,来源地不详的种质单独划为1组,组内采用标准化的表型数据按5%~40%比例进行系统聚类（最短距离法）[33]抽样,根据聚类图从遗传距离最短的2个遗传材料中随机取1个材料进入下一轮聚类,通过抽样材料和原始材料的表型遗传多样性比较筛选确定薏苡初级核心种质。
表2 薏苡4个质量性状分级与赋值Tab. 2 Classification and coden designation for four qualitative traits in C. lacryma-jobi L. |
| 性状Trait | 分级Classification |
|---|---|
| 果壳颜色 | 黄白色=1,灰色=2,棕色=3,深棕色=4,黑褐色=5 |
| 总苞形状 | 卵圆形=1,近圆柱形=2,椭圆形=3,近圆形=4,扁圆形=5 |
| 总苞光泽 | 有=1,无=2 |
| 总苞条纹 | 有=1,无=2 |
1.2.3 核心种质取样方法 各组种质的取样数量通过比例法确定,即：Si=Ai×a,其中,Si是第i组所要抽取的样品数,Ai是第i组的样品总数,a是总体取样百分数。按照5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%和40%的取样比例分别提取种质,构建候选核心样本。取样原则根据各组实际情况灵活掌握,种质数量大的组按取样比例确定种质,种质规模小的组至少保留1份。借鉴Hu等[34]和张洪亮等[35]的研究经验,用变异系数变化率（variable rate of coefficient of variation, VR, %）、极差符合率（coincidence rate of range, CR, %）、方差差异百分率（variance difference percentage, VD, %）、均值差异百分率（phenotypic indexes of mean difference percentage, MD, %）、表型保留比例（ratio of phenotypic retained, RPR, %）、表型频率方差（variance of phenotypic frequency, VPF）和多样性指数（Shannon-Wiener diversity index, I）等检验参数对候选核心样本进行评价。
2 结果与分析
2.1 种质资源表型性状的统计分析
对供试种质资源的4个描述性状进行统计分析,结果表明,薏苡种质资源中果壳颜色以黑褐色为主,占全部材料的34.68%,黄白色、灰色、棕色和深棕色分别占23.39%、6.05%、22.18%和13.70%;总苞形状以卵圆形为主,占全部材料的66.53%,近圆柱形、椭圆形、近圆形和扁圆形分别占6.86%、4.03%、19.76%和2.82%;供试资源的总苞多数表现为有条纹和无光泽,占全部材料的66.53%,无条纹和有光泽种质资源占全部材料的33.47%。另外,通过对薏苡种质资源10个数值性状的进行统计分析发现（表3）,供试薏苡种质资源数值性状变异丰富,变异系数（CV）大小顺序为总分蘖数>百粒重>主茎分枝数>主茎节数>茎粗>叶长>株高>叶宽>总苞宽度>总苞长度,变异范围最大的是株高,为93~330 cm,总苞宽度的变异范围最小,为5.01~8.92 mm;Shannon- Wiener指数（I）最大的是叶长,为0.91,最小的是总分蘖数,为0.65。
表3 薏苡种质资源数量性状统计分析Tab. 3 Statistical analysis of numerical traits of the C. lacryma-jobi L. germplasm resources |
| 特征值 Character indices | 极小值 Min | 极大值 Max | 均值 Mean | 标准差 SD | 变异系数 CV/% | Shannon-Wiener 指数I |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 株高/cm | 93.00 | 330.00 | 203.64 | 43.18 | 21.20 | 0.88 |
| 茎粗/mm | 7.42 | 21.60 | 12.63 | 2.80 | 22.14 | 0.84 |
| 叶长/cm | 26.00 | 90.00 | 55.51 | 12.26 | 22.08 | 0.91 |
| 叶宽/cm | 2.10 | 6.20 | 3.83 | 0.74 | 19.42 | 0.87 |
| 总分蘖数 | 1.00 | 45.00 | 7.94 | 6.11 | 76.98 | 0.65 |
| 主茎分枝数 | 0.00 | 17.00 | 8.62 | 2.83 | 32.88 | 0.84 |
| 主茎节数 | 4.00 | 15.00 | 8.48 | 2.55 | 30.14 | 0.88 |
| 总苞长度/mm | 5.51 | 13.72 | 8.79 | 0.98 | 11.10 | 0.87 |
| 总苞宽度/mm | 5.01 | 8.92 | 6.82 | 0.86 | 12.54 | 0.89 |
| 百粒重/g | 2.37 | 32.91 | 13.37 | 4.87 | 36.42 | 0.85 |
2.2 薏苡初级核心种质构建
根据前人研究经验及本研究实际情况,按40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%和5%的取样比例筛选出薏苡初级核心种质的最佳组合,通过对地理来源组进行表型逐步聚类分析,种质数量较少的组,至少保留1份资源,最终获得8个薏苡初级候选样本,所含种质数分别为103、90、79、67、55、42、30和19份（表4）,其实际取样比例为41.53%、36.29%、31.85%、27.02%、22.18%、16.94%、12.10%和7.66%。
表4 组内不同比例的取样量Tab. 4 Sampling amounts at various proportions |
| 组别 Group | 取样比例 Proportion/% | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 | 35 | 40 | |
| 贵州 | 4 | 7 | 10 | 13 | 16 | 19 | 22 | 25 |
| 云南 | 5 | 9 | 14 | 18 | 23 | 27 | 32 | 36 |
| 广西 | 3 | 5 | 7 | 9 | 11 | 13 | 15 | 18 |
| 四川 | 1 | 2 | 2 | 3 | 4 | 5 | 5 | 6 |
| 江苏 | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 2 | 3 | 3 |
| 浙江 | 1 | 1 | 2 | 3 | 3 | 4 | 4 | 5 |
| 湖南 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 湖北 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 福建 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 未知 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 6 | 7 |
| 合计 | 19 | 30 | 42 | 55 | 67 | 79 | 90 | 103 |
为确定最终的核心种质,利用变异系数变化率（VR）、均值差异百分率（MD）、极差符合率（CR）、方差差异百分率（VD）、表型保留比例（RPR）、表型频率方差（VPF）、Shannon-Wiener指数（I）等7个表型检验指标对8个候选核心样本进行评价（表5）。结果表明,8个候选核心样本的MD变化范围为0%~20%,CR变化范围为70.39%~95.30%,根据“核心种质均值差异百分率小于20%,同时极差符合率大于80%可认为能够代表原种质遗传多样性”的经验标准,说明除5%取样比例外（CR小于80%）,其余候选核心样本均保留原始种质性状的变异幅度;VR均超过100%,而且随着取样比例的减少呈现出先升高后降低的趋势,说明将原始群体中一些冗余的样品排除后,获得的核心样本性状变异量得到显著提高,过分筛选会使核心样本各性状的变异量降低;RPR随着取样比例的减少而减少,以40%取样比例的候选样本最高（99%）,5%取样比例的候选样本最低（68%）,15%~40%取样比例的候选样本均超过90%,说明取样比例越大,能较好的保留原始种质各性状的表现型;VD和VPF是评估群体的均度、表型的分布情况、材料的异质性等,其值越小,表明所得核心种质中各性状的分布越均匀,遗传冗余度越小[36],在8个候选核心样本中,以25%取样比例的VD和VPF表现值最低,分别为10%和0.655;Shannon-Wiener指数（I）在各候选核心样本的变化较小,以25%取样比例的核心样本I最大（0.881）,5%取样比例的核心样本I最小（0.75）。综合分析7个检验指标发现,25%取样比例的候选核心样本展现为多样性水平高、变异丰富、表型频率方差低、方差差异百分率低、种质规模适宜、与原始种质表型差异小等特点,在8个候选核心样本中综合表现最好。因此,以25%取样比例（取样量为67份种质）最适宜于构建薏苡核心种质。
表5 候选样本7个表型检验参数的比较Tab. 5 Comparison of seven phenotypic test parameters for candidate samples |
| 候选样本 Candidate samples/% | 变异系数变化率 VR/% | 均值差异百分率 MD/% | 极差符合率 CR/% | 方差差异百分率 VD/% | 表型保留比例 RPR/% | 表型频率方差 VPF | Shannon-Wiener指数 I |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 5 | 102.04 | 10 | 70.39 | 30 | 68 | 1.035 | 0.750 |
| 10 | 109.16 | 0 | 81.10 | 20 | 83 | 0.895 | 0.833 |
| 15 | 110.81 | 0 | 88.46 | 30 | 92 | 0.683 | 0.875 |
| 20 | 110.80 | 10 | 92.35 | 40 | 96 | 0.730 | 0.876 |
| 25 | 110.05 | 0 | 93.03 | 10 | 96 | 0.655 | 0.881 |
| 30 | 107.84 | 0 | 94.01 | 10 | 96 | 0.682 | 0.876 |
| 35 | 107.35 | 20 | 95.30 | 30 | 97 | 0.709 | 0.874 |
| 40 | 106.33 | 10 | 95.30 | 20 | 99 | 0.673 | 0.880 |
2.3 薏苡初级核心种质评价
为明确原始种质和核心种质的各性状特征值之间的差异,分别统计了2个样本14个性状的最大值、最小值、均值、CV和I,以及核心种质的RPR（表6）。从表中可以看出,获得的薏苡核心种质有8个表型性状（主茎分枝、主茎节数、百粒重、总苞宽度、果壳颜色、总苞形状、总苞光泽和总苞条纹）与原始种质的最大值和最小值完全相同,其余6个表型性状的最大值或最小值与原始种质的差异较小,均值与原始种质也基本一致（t检验差异不显著）,但核心种质多数表型性状的变异系数（CV）和Shannon-Wiener指数（I）略高于原始种质（除总分蘖数、果壳颜色、总苞光泽和总苞条纹外）,说明初选核心种质的多样性更丰富;在RPR检验指标上,核心种质除茎粗（RPR=0.9）、总分蘖数（RPR=0.8）和主茎分枝（RPR=0.9）3个表型的某一性状级别被丢失外,其余表型均保留了原始种质的所有性状级别（RPR=1.0）。以上分析说明,核心种质与原始种质的大部分性状的基本特征值相等或差异较小,核心种质保留了原始种质绝大部分性状级别（96.49%）,具有很好的代表性。
表6 原始种质和核心种质特征值的比较Tab. 6 Comparison of characteristic parameters of initial germplasm and core germplasm |
| 性状 Characters | 原始种质 Initial germplasm | 核心种质 Core germplasm | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 极小值 Min | 极大值 Max | 均值 Mean | 变异系数CV/% | Shannon- Wiener 指数I | 极小值 Min | 极大值 Max | 均值 Mean | t值 t value | 变异系数 CV /% | Shannon- Wiener 指数I | 表型保留比例 RPR | |
| 株高/cm | 93.00 | 330.00 | 203.64 | 21.20 | 0.88 | 93.00 | 325.00 | 200.3 | -0.545 | 25.24 | 0.94 | 1.00 |
| 茎粗/mm | 7.42 | 21.60 | 12.63 | 22.14 | 0.84 | 7.65 | 20.01 | 12.61 | -0.047 | 22.57 | 0.82 | 0.90 |
| 叶长/cm | 26.00 | 90.00 | 55.51 | 22.08 | 0.91 | 26.00 | 88.00 | 54.34 | -0.734 | 24.08 | 0.92 | 1.00 |
| 叶宽/cm | 2.10 | 6.20 | 3.83 | 19.42 | 0.87 | 2.10 | 5.80 | 3.75 | -0.750 | 21.90 | 0.92 | 1.00 |
| 总分蘖数 | 1.00 | 45.00 | 7.94 | 76.98 | 0.65 | 1.00 | 30.00 | 7.64 | -0.442 | 72.20 | 0.64 | 0.80 |
| 主茎分枝 | 0.00 | 17.00 | 8.62 | 32.88 | 0.84 | 0.00 | 17.00 | 8.82 | 0.504 | 36.97 | 0.88 | 0.90 |
| 主茎节数 | 4.00 | 15.00 | 8.48 | 30.14 | 0.88 | 4.00 | 15.00 | 8.52 | 0.118 | 34.63 | 0.92 | 1.00 |
| 总苞长度/mm | 5.51 | 13.72 | 8.79 | 11.10 | 0.87 | 6.06 | 13.72 | 8.84 | 0.317 | 14.52 | 0.92 | 1.00 |
| 总苞宽度/mm | 5.01 | 8.92 | 6.82 | 12.54 | 0.89 | 5.01 | 8.92 | 7.00 | 1.543 | 13.75 | 0.93 | 1.00 |
| 百粒重/g | 2.37 | 32.91 | 13.37 | 36.42 | 0.85 | 2.37 | 32.58 | 13.72 | 0.510 | 41.37 | 0.91 | 1.00 |
| 果壳颜色 | 1 | 5 | 3.30 | 47.29 | 0.64 | 1 | 5 | 3.52 | 1.174 | 44.03 | 0.62 | 1.00 |
| 总苞形状 | 1 | 5 | 1.85 | 71.06 | 0.44 | 1 | 5 | 2.04 | 1.091 | 71.62 | 0.50 | 1.00 |
| 总苞光泽 | 1 | 2 | 1.65 | 29.12 | 0.28 | 1 | 2 | 1.67 | 0.374 | 28.32 | 0.27 | 1.00 |
| 总苞条纹 | 1 | 2 | 1.33 | 35.44 | 0.28 | 1 | 2 | 1.27 | -1.124 | 35.20 | 0.25 | 1.00 |
3 讨论
近年来,薏苡（薏仁米）作为药食两用的重要作物,深受国内外广大消费者的青睐,但由于目前薏苡种质资源遗传基础狭窄,育种进程缓慢,导致生产上栽培品种比较单一,缺乏特色、优质的薏苡品种,因此加强薏苡资源的收集、整理、评价成为当前研究的重点工作。而核心种质库是以最少的遗传资源份数代表该物种最大的遗传多样性,是种质资源高效管理和利用的重要方法。目前,国内外关于构建核心种质库的方法已经比较成熟,尤其利用表型数据构建核心种质库是最常用的方法之一,且多数研究均采用先分组、后聚类、再取样的策略,如颜小文[37]选用24个分类性状指标对1002份芝麻种质资源进行筛选评价,建立了含有203份芝麻品种的核心种质;胡建斌等[25]以国家甜瓜种质资源库中的1200份甜瓜种质为材料,根据19个表型性状遗传变异,采用15%的取样比例构建了包含189份甜瓜的核心种质库;徐宁等[38]基于地理来源分组和利用表型数据对中国国家种质库的4877份小豆种质资源进行鉴定评价,构建了包含435份小豆资源的核心种质。
核心种质构建中聚类方法和取样比例选择是关键,但不同作物的具体构建方法或取样比例也存在一定的差异。据报道,当前最小距离逐步取样法被认为是豌豆[39]、苦瓜[40]、甘薯[41]等作物构建核心种质库的最佳取样策略,取样比例大小由原始种质样本量、表型数据有效性（考察性状数的多少）等决定[32, 42],范围约为原始种质的5%~ 40%[43,44,45]。本研究以248份薏苡资源的收集地理来源分组,利用最短距离法逐步取样法对14个表型性状进行聚类构建核心种质库,与水稻[46]、玉米[47]等传统作物相比,供试资源数量、调查性状偏少,为此扩大了本研究组内取样比例（5%~ 40%）,获得8个候选核心样本,最终建立包含67份资源的薏苡初级核心种质库,保留原始种质27.02%的样品（组内抽样比例为25%）,表型保留比例为96%,很好的反映了原始薏苡资源的表型变异,既保证了表型数据的有效性,又减少了资源数量,为后期薏苡资源的研究和利用奠定了基础;而且核心种质库多数表型性状的变异系数和Shannon-Wiener指数略高于原始种质,说明核心种质库包含的薏苡资源的多样性更丰富、遗传冗余度较小,与原始种质基本一致,代表性好,这与刘子记等[40]、马洪文等[48]的研究结果一致。
4 结论
基于248份薏苡种质的地理来源进行分组,组内表型数据按系统聚类（最短距离法）获得固定抽样比例的8个候选核心样本,并利用VR、MD、CR、VD、RPR、VPF、I等7个表型检验指标进行评价,构建薏苡初级核心种质库。获得的薏苡初级核心种质库包含67份资源,保留了原始种质27.02%的样品（组内25%抽样比例）,其VR、MD、CR、VD、RPR、VPF和I等检验指标分别为110.05%、0、93.03%、10%、96%、0.655和0.881,而且核心种质库14个表型性状均值与原始种质无显著性差异,保留原始种质表型性状级别比例为96.49%,能够较好的代表原始薏苡资源的多样性,该结果为后期薏苡种质资源的收集、保护、创新利用奠定了重要基础。