萼脊兰（Sedirea Japonica）是兰科萼脊兰属植物,花朵小,花的颜色优雅素净,有香气,开花时间4—6月,易栽培且抗性较强[1,2]。萼脊兰由于其特殊的生长环境及香气迷人,成为现在人们追捧的对象,具有巨大的市场空间。兰科是最大的单子叶植物科之一,有25 000多种,兰花的香味更是人们喜欢的一大特点。张莹等[3,4]分析了文心兰的香气成分;李崇晖等[5]对4种石斛原生种鲜花的香气组成成分进行了分析;丁灵等[6]测定了7种秋石斛鲜花香气中的挥发性成分;吕素华等[7]分析了11个铁皮石斛杂交家系鲜花的挥发性物质;Hsiao等[8]研究了蝴蝶兰单萜类生物合成途径;Huang等[9]研究了蕙兰香气物质MeJA的释放规律。以上研究认为,萜烯类、酯类、醇类和醛类对石斛的花香起着重要作用。从美洲热带、非洲热带、澳大利亚热带和欧洲部分地区的兰科花卉中发现了许多挥发性成分。但人们对兰花花香的生物合成途径还不是很了解。对于控制单子叶植物（兰花）气味产生的酶和基因知之甚少,且如果没有基因组学,理解其中的分子机制可能是无法克服的问题。有文献记载,已有1700多种挥发性物质从90多种植物中鉴别,主要是萜类、苯丙类化合物、脂肪酸或者氨基酸衍生物[10]。
植物的气味因挥发性化合物的数量、特性和相对量的不同而不同,花香也是在植物与昆虫、植物与植物、植物与非生物胁迫的相互作用中一个关键的因素,并且在传粉、果实生长发育和植物防御方面起到一个关键的作用[11]。在植物花香有关的酶基因研究进展下面,Dudareva等[11]从仙女扇（Clarkia breweri）中克隆出编码（S）-芳樟酶醇合成酶基因的全长cDNA,之后花香物质等形成的相关基因如PAAS、BSMT、BEBT、SAMT、BEAT和IEMT等相继被克隆出来。植物花香物质的合成与萜类化合物代谢有关,根据萜类物质结构中的异戊二烯数目可把萜类物质分为不同种类[11]。科学家们不断探索发现了植物萜类化合物的合成主要是由甲醛戊酸途径（MVP）和脱氧木酮糖-5-磷酸（DXP）途径共同合成[12]。在这2个途径中,最主要的中间产物异戊二烯焦磷酸（IPP）、单萜、倍半萜、二萜、三萜等均是由它产生的化合物[13]。甲醛戊酸（MVA）途径中的限速酶是还原酶3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶（HMGR）,这个限速酶可催化3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A (HMG-CoA)生成甲羟戊酸[14]。关于HMGR在多种植物中均有深入研究,如从马铃薯[15、橡胶草[16]、刺五加[17]、甜瓜[18]、藿山石斛[19]等多种植物中的HMGR被克隆出来。在蹄叶橐吴萜类化合物-紫苑酮的研究中发现,将N端缺少的HMGR基因在薰衣草中通过转基因过表达,其促进薰衣草精油和植物甾醇的产生[20]。将长春花的HMGR基因转到青蒿中,可使青蒿中青蒿素的含量变多,在烟草中过表达阳春砂的HMGR基因,结果发现萜类、植醇及甾醇的表达量都明显增多[21]。大量研究证明,甲醛戊酸途径的一个关键调控点是HMGR,但目前关于HMGR在萼脊兰花香中的作用研究较少,所以本研究从SjHMGR的全长cDNA开始,并对其进行生物信息学分析和时空表达分析,研究该基因在萼脊兰花香物质合成中的关键作用,为后续萼脊兰SjHMGR基因的功能验证和兰花新品种培育打下良好的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
实验材料来源于郑州师范学院的兰花工程技术研究中心。盛花期取萼脊兰花瓣进行基因片段克隆,并取其苗期根和叶,花蕾期根、叶和花蕾,盛花期的根、叶、花葶、萼片、花瓣、合蕊柱,每个样品3个生物学重复,液氮速冻,-80 ℃保存备用。
E.coli DH5α感受态细胞、rTaq DNA聚合酶、T4-DNA连接酶、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒、M-MLV反转录试剂盒、RACE扩增试剂盒、质粒小提和实时荧光定量表达分析试剂盒等均购自TaKaRa公司。引物的合成和基因测序由上海英潍捷基贸易有限公司完成。
1.2 方法
RNA的提取：采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒对萼脊兰花瓣进行RNA的提取。采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性,采用微量紫外可见分光光度计测定RNA的OD260/280及浓度。
HMGR基因保守片段的克隆：以提取的萼脊兰花瓣总RNA为模板,利用M-MLV反转录试剂盒合成单链cDNA。根据XP_020579399（蝴蝶兰）、AGT78194 (霍山石斛)、XP_020705018（铁皮石斛）物种的HMGR基因保守区,综合利用DNAAN 6.0和Primer 5.0生物软件设计1对简并引物,扩增SjHMGR保守片段。最后将扩增出来的基因片段进行电泳检测和菌液测序。
SjHMGR全长基因克隆及ORF验证：以萼脊兰的花瓣cDNA 为PCR扩增模板,利用RACE技术分别扩增SjHMGR的5°端和3°端序列,将扩增产物连接到pGEM-T Easy载体上,转入大肠杆菌DH5α菌株,电泳检测及菌液测序。将测序正确的HGMR基因保守片段、5°端和3°端序列利用DNAMAN软件拼接得到HGMR基因序列全长,根据获得的全长序列,设计1对引物 HMGR-F2和 HMGR-R2,进行ORF扩增,用于HGMR基因全长序列验证（引物见表1）。
表1 基因克隆引物Tab. 1 Gene cloning primers |
| 引物名称 Primer name | 引物序列 Sequence | 用途 Purpose |
|---|---|---|
| HMGR-F1 HMGR-R1 | 5°-TCGGCATCGCTTATGTYCA-3° 5'-TGATCTRTTRTAYTT CATGTGGCTC-3° | 保守片段扩增 |
| HMF1 HMF2 | 5°-GCTCTAGGTGGGTT CAATGCTC-3° 5°-CAGTCAGCCTGCTTAAAT CTTCT-3° | 3°端RACE引物 |
| HM-R19 HM-R57 | 5°-TGGACATAAGCGATGCCGA-3° 5°-TGAAGTCGTCCTCAT CGTCGT-3° | 5°端RACE引物 |
| HMGR-F2 HMGR-R2 | 5°-GCTCGTAGTGGGT TCAATGCTC-3° 5°-ACCGACTGTGCCA ACCTCAAT-3° | HMGR编码区克隆 |
1.3 生物信息学分析
开放阅读框的预测采用ORFfinder;基因相似性分析采NCBI上的BLAST;氨基酸序列比对分析采DNAMAN;蛋白质的理化性质分析采用ProtParam;蛋白质亲疏水性采用ProtScale程序分析;亚细胞定位分析采用用TargetP软件和PSORTⅡ;SjHMGR蛋白质结构功能和功能分析预测采用ProtFun。蛋白质2级结构预测采用ExPASy网站上的GOR;蛋白质3级结构预测采用SWISS- MODEL进行分析预测。
1.4 SjHMGR基因的时空表达分析
根据SjHMGR基因全长序列设计特异性较强的qRT-PCR引物,参照SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ使用说明,利用qRT-PCR的方法检测SjHMGR基因在萼脊兰不同发育阶段及不同器官的表达量。EF1a作为内参基因,计算该基因的相对表达量。目的基因SjHMGR和内参基因EF1a的退火温度均为58 ℃,每个样品3个生物学重复,蒸馏水做为阴性对照,反应体系共为20 μL,反应程序如下：95 ℃预变性30 s,95 ℃变性15 s,58 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,共41个循环,PCR结果按照相对表达量Rel. Exp=2-ΔΔCT计算,式中ΔCT=CT (HMGR)-CT (EF1a RNA),ΔΔ CT=(各植物组织ΔCT)-(萼片ΔCT) [20,21]。qRT-PCR引物及参数见表2。
表2 qRT-PCR引物参数Tab. 2 Primers parameters for qRT-PCR |
| 引物及序列 Primers and sequence | 退火温度 Annealing temperature/℃ | 片段大小 Fragment size/bp |
|---|---|---|
| qRT-HMGR-F: ATCGTGGTATCTCCGTGGTTG qRT-HMGR-R: AGGTAATCTAAACCAGCAAGGC | 58 | 188 |
| qRT-EF1a-F: GTTCTTTCCCTATATGCTAGTGGC qRT-EF1a-R: GAAGGATGGCATGFPPSGAAGTG | 60 | 154 |
2 结果与分析
2.1 萼脊兰总RNA的提取
由图1可知提取的花瓣总RNA具有完整的28 S、18 S和5 S条带,说明提取的总RNA完整性好,很少降解。OD260/280的值为1.99,浓度为98.7 ng/μL。
2.2 SjHMGR基因克隆和蛋白质的理化性质分析
以花瓣总cDNA为模板,对保守区片段进行PCR扩增,得到1个1358 bp基因片段（图2A）,利用RACE扩增技术,根据设计的3′端和5′端特异性引物,扩增出5′端（图2B）和3′端（图2C）的目的片段。DNAMAN软件进行序列拼接得该基因的全长为1892 bp,ORFfinder分析发现,该基因序列共有7个ORF,最长的ORF为1689 bp,包含115 bp的5′-UTR、88 bp的3′-UTR。利用全长基因序列设计的引物扩增出ORF片段1716 bp,阳性质粒命名为pGEM-HMGR,说明全长SjHMGR基因序列拼接正确。理化性质分析发现,SjHMGR蛋白质的分子质量为60.06 kDa,等电点为7.43;氨基酸结构域分析发现,SjHMGR有3个HMG-COA特殊位点,且属于HMG-COA超基因家族。
图2 SjHMGR基因扩增结果A：保守片段扩增;B：5′RACE扩增;C：3′RACE扩增;M：DL2000 Marker。1：保守片段;2：5′RACE产物;3：3′RACE产物。 Fig. 2 SjHMGR gene amplification results A: Conserved region amplification; B: 5′RACE amplification; C: 3′RACE amplification; M: DL2000 Marker. 1: Conservative fragment; 2: 5′RACE product; 3: 3′RACE product. |
2.3 SjHMGR蛋白质的亲疏水性分析
蛋白质的亲疏水性分析发现,SjHMGR蛋白质序列具有较强的疏水性,其中第88位的亲水性最强（2.767）,第552位的疏水性最强（-2.567）,整体来看,亲水性氨基酸均匀分布在整个肽链中,并且多于疏水性的氨基酸。因此,整个多肽链表现为亲水性,可认为该酶是亲水性蛋白。
2.4 SjHMGR编码蛋白质的功能预测与分析
分析预测SjHMGR蛋白质结构功能及功能分类发现,可能有意义的功能主要有作为细胞被膜、脂肪酸代谢、翻译功能、中间代谢、合成辅酶因子等,其几率分别是11.180、5.831、4.361、4.224、4.143。这表明SjHMGR在中间代谢中起到了一个很重要的角色,在脂肪酸代谢、翻译过程中起到较为重要的作用,在辅酶因子的生物合成中也起到了关键性作用。
2.5 SjHMGR编码蛋白质的2级、3级结构预测
2.6 氨基酸序列同源性分析
通过BlastP对HGMR蛋白进行序列同源比对分析,发现其蛋白在氨基酸水平上与兰科植物的HGMR蛋白具高度同源性,其中与蝴蝶兰（XP_020579399）蛋白的同源性最高（96%）,与霍山石斛（AGT78194）的蛋白同源性为87%,与鼓槌石斛（AHI88624）的蛋白同源性为87%（图5）。进一步利用MEGA 6.0软件,采用相邻连接法构建系统进化树,根据氨基酸序列进行亲缘关系分析结果显示,萼脊兰SjHMGR蛋白与蝴蝶兰（P. Sequestris XP_020579399）、与霍山石斛（D. huoshanense AGT78194）、鼓槌石斛（D. chrysotoxum AHI88624）、铁皮石斛（D. officinale XP 020705018）的HMGR蛋白处于同1个分支上,其中与蝴蝶兰的亲缘关系最近（图6）。
2.7 萼脊兰SjHMGR基因的时空表达分析
3 结论
萼脊兰属于兰科中较适宜观赏的一种附生兰,因其花具有浓郁花香,深受人们喜爱。与气味相关的萜类合成基因GPPS、DXR、DXS、TPS研究较多,而3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）作为萜类成分甲羟戊酸（MVA）合成途径上第1个重要限速酶,对植物萜类活性成分生物合成过程起着至关重要的作用,所以研究HMGR基因的功能与生理学特性具有深远的意义[22]。大量研究表明：倍半萜类物质的合成与HMGR活性呈正相关,提高植物体内HMGR基因的表达水平可显著提高倍半萜类物质的含量[23]。研究发现,倍半萜类化合物生物的合成主要通过甲羟戊酸（MVA）途径,HMGR是MVA合成途径中的关键基因,对甲羟戊酸代谢“碳流”的调控起到重要的作用,如果改变HMGR活性可会有效调控萜类化合物的含量[24]。
试验成功克隆萼脊兰SjHMGR基因,全长1892 bp,开放阅读框1689 bp,编码367个氨基酸,分子质量为60.06 kDa,等电点为7.43;SjHMGR编码的蛋白为亲水性蛋白;SjHMGR有3个HMG-COA特殊位点,且属于HMG-COA超基因家族;蛋白质2级结构分析α-螺旋占27.05%,延伸链占25.02%,不规则折叠占48.93%。
已有研究表明,SjHMGR 基因在不同植物组织的表达模式表现出较大的差异性,在人参的花中表达量最高,茎中的表达量最低[24];在露水草的根和叶中的表达丰富[25]。萼脊兰SjHMGR基因的表达研究发现,营养器官根和叶中的表达量很低,生殖器官萼片和花瓣的表达量较高,花蕾和花葶中没有表达,结果显示SjHMGR基因只有在盛花期才有表达,花蕾期的表达几乎为零,与丁灵等[6]研究的蝴蝶石斛兰‘日出2号’主要发香部位是萼片,合蕊柱基本不发香的研究结果一致,但研究中也指出不同品种的石斛兰花朵花瓣基本均是主要发香部位,说明不同品种兰花的发香部位不一样。为进一步研究萼脊兰的发香部位提供了新的思路。本研究结果还显示,SjHMGR在中间代谢中起到了一个很重要的角色,在脂肪酸代谢、翻译过程中起到较为重要作用,在辅酶因子的生物合成中也起到了关键作用,相信该研究结果的发现均为萼脊兰SjHMGR基因的功能验证和新品种的培育打下良好的基础。