草坪为人们休闲娱乐提供舒适的环境,是城市景观绿化的重要组成部分,也是衡量城市生态建设的重要标志。然而由于淡水资源缺乏,为节约用水,在城市园林绿化中越来越多采用再生水或循环水灌溉草坪和花卉树木,由此导致土壤含盐量增加,影响草坪建植和生长[1,2,3]。随着土壤盐渍化不断加剧,使得大面积土壤将难以被利用,这使得城市绿化建设面临严峻挑战[4]。因此,培育和筛选耐盐性强的草坪草具有重要意义,为改善利用盐碱土壤以及生态景观建设提供参考依据,同时还可以减少一定的经济损失[5]。
盐胁迫是影响草坪草生长发育的主要逆境因素之一。草坪受到盐胁迫后,植株生长缓慢,干物质积累减少,表观质量显著下降。植物对盐胁迫的适应机制主要包括渗透调节、钠离子外排、抗氧化调节、盐离子在组织中的分配和积累等多个方面[6]。植物通过选择性吸收钾、钠、钙等离子以及合成可溶性糖、脯氨酸和甜菜碱等渗透调节物质来维持细胞渗透势平衡,保证植物正常的生理代谢活动[7]。脯氨酸是一种重要的渗透调节剂,研究表明,当植物遭受盐胁迫或干旱胁迫时,脯氨酸含量迅速上升,能有效缓解逆境胁迫,提高植物耐盐性[8]。此外,盐胁迫下大量钠离子破坏植物体内离子平衡,细胞的正常生理活动受到抑制。为了抵御盐胁迫,植物普遍采取离子区域化或将盐离子排出体外的调节机制,使其免受离子毒害。低浓度NaCl胁迫对耐盐性较强的暖季型草坪草生长有促进作用,根系较长、生物量増加,而高浓度NaCl胁迫对草坪草生长有抑制作用[9]。
在我国南方地区,结缕草属（Zoysia）、狗牙根属（Cynodon）、海滨雀稗（Paspalum vaginatum）等草种被认为是比较耐盐的暖季型草坪草种,但不同种之间及同一种不同品种之间耐盐性差异较大[10]。海滨雀稗是禾本科黍族雀稗属的多年生暖季型草本植物,具有较高的坪用价值[11,12]。因其主要生长于海滨、滩涂等含盐量较高的环境中,能从海水和雨水中吸取所需要的水分和养分,并迅速发展其根部系统,是暖季型草坪草中耐盐性较强的草种[13,14]。正是由于其耐盐性强的特点,海滨雀稗是目前高尔夫球场、运动场选择的重要草种,在国内外有着广阔的市场需求[15]。目前我国对于培育具有多方优良性状的草种技术还比较薄弱,大部分坪用草种引自国外,因此培育出适用于多方地区的种质资源具有重要意义。
辐射诱变技术可快速有效地筛选到有价值的突变体,在植物育种过程中发挥重要作用[16]。辐射诱变在牧草和草坪草育种中具有应用前景,是新品系选育和品质改良的有效手段。在目前国外的研究中,Li等[17,18]利用60Co-γ诱射线对钝叶草（Stenotaphrum secundatum）进行性状改良,并进一步筛选出抗寒性更优良的新种质。本研究利用60Co-γ射线对海滨雀稗的Sea Isle 2000、Platinum和Salam共3个品种进行辐射诱变后,连续筛选获得一批突变材料。与辐射诱变前的亲本材料相比,部分突变材料的坪用性状和抗旱性得到了很大的提升,但是其耐盐性是否优于亲本材料仍然未知。因此,本研究以前期辐射诱变获得的海滨雀稗突变体为研究材料,通过测定相关生理指标来综合评价其耐盐性,旨在初步评价突变体材料的耐盐性,缓解草坪管理中的淡水消耗,发展节约型草坪。
1 材料与方法
1.1 材料
突变材料为经过60Co-γ射线辐射处理并经过3代选育后得到的在株高、叶长、叶宽、成坪密度等指标优于各对照的突变材料[19]和亲本对照,分别为：Sea Isle 2000（SI-CK）及其辐射诱变筛选出的突变材料SI-50-1、SI-50-5、SI-60-6;Platinum（PL-CK）及其突变材料PL-40-1、PL- 40-2、PL-40-8;Salam（SLM-CK）及其突变材料SLM-45-1。
1.2 实验设计
实验材料单株种植于花盆中（口径10.0 cm,高9.0 cm）,底部铺白色纱网。基质为过1 mm筛的普通细河沙,将种植好的实验材料放入装有1 L 1/2 Hoagland营养液（每周更换1次）的容器中（口径14.0 cm,高9.4 cm）后进行统一修剪与养护管理。待所有材料根系生长至突破花盆底部纱网,剪去外漏根系,继续生长20 d后进行盐胁迫处理。将材料放入盛有1 L 1/2 Hoagland营养液配制的不同浓度NaCl溶液（每3 d更换1次）的容器中,进行渗灌盐胁迫。NaCl浓度梯度设置为0、7、21、35 g/L,每个材料每个浓度设3个重复。盐处理9 d后取样测定以下指标。
1.3 测定指标与方法
1.3.1 叶片相对含水量 取剪碎混匀的叶片0.1 g,除去表面灰尘,称其鲜重;常温浸泡24 h后用吸水纸擦干叶片,称重得饱和重,然后置于烘箱中,105 ℃杀青15 min,80 ℃烘干24 h,称其干重[20]。
叶片相对含水量=[(鲜重-干重)/(饱和鲜重-干重)]/[(鲜重-干重)/(饱和鲜重—干重)]×100%
1.3.2 叶片相对电导率 取剪碎混匀的叶片0.1000 g,剪碎,分别置于5 mL去离子水的刻度试管中,盖上玻璃塞置于室温下浸提12 h,测定外渗透液电导率C1,及沸水浴中浸提15 min,冷却至室温后摇匀,再次测定外渗透液电导率C2[21]。
相对电导率=C1/C2×100%
1.3.3 脯氨酸含量 取剪碎混匀的叶片0.1000 g,分别放入试管中,加入5 mL 3%的磺基水杨酸,塞上试管塞,于沸水浴中浸提10 min。取出试管,待冷却至室温后,吸取上清液2 mL,加2 mL冰乙酸和2 mL酸性茚三酮,于沸水浴中加入30 min,取出冷却后向各试管中加入5 mL甲苯充分振荡,以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯以0号试管为对照,在波长520 nm下比色,记录吸光值[22]。
脯氨酸含量(μg/g FW)=(C×V/a)/W,由标准曲线求得。V为提取液总体积（mL）,a为测定时所吸取的体积（mL）,W为样品重（g）。
1.3.4 叶绿素含量（soil and plant analyzer development, SPAD值） 使用SPAD计（502型,日本美能达公司生产）直接进行测定。测定时选取生长状况一致且完全展开自上而下的倒三叶,把测量计夹在叶片上,按下“取生长状况”键,所得值为SPAD值,该值与叶片的叶绿素含量成正相关。
1.3.5 根系活力 采用氯化苯基四氮唑（TTC）法测定。选取完整的根系,将待测根系洗净后轻轻擦干,剪碎混合,准确称取0.2 g,浸没在浓度为0.4%的TTC溶液和6 mmol/L磷酸缓冲液（pH 7.0）的等量混合液中,放在人工气候箱中,37 ℃保温3 h,然后加入1 mol/L硫酸2 mL终止反应。擦干后加3~5 mL乙酸乙酯和少量石英砂充分碾磨。过滤后将红色提取液移至10 mL试管,用少量乙酸乙酯冲洗残渣2~3次,皆移入试管,最后补充乙酸乙酯至刻度。在波长485 nm下比色,记录吸光值。
TTC还原强度=TTC还原量(µg)/根量(g)×时间(h)
1.4 数据处理
实验数据均以平均值表示,用Excel 2010软件进行数据图表分析;采用SAS 9.2软件进行方差分析,多重比较,以及2个独立样本的t检验,各平均值的多重比较采用邓肯式新复极差检验法（Duncan’s multiple range test, DMRT）。
2 结果与分析
2.1 盐胁迫对海滨雀稗叶片相对含水量的影响
海滨雀稗各材料受到盐胁迫后叶片相对含水量均存在一定程度的下降（图1）。当NaCl浓度为0~21 g/L时,Sea Isle 2000和Platinum及其各自3个突变材料间的叶片相对含水量无显著差异（P>0.05）（图1A和图1B）。当NaCl浓度达到35 g/L时,Sea Isle 2000（SI-CK）的突变材料SI-50-1、SI-50-5、SI-60-6的叶片相对含水量显著高于亲本材料SI-CK（P<0.05）（图1A）。Platinum（PL-CK）的突变材料PL-40-2和PL-40-8在35 g/L的NaCl浓度下叶片相对含水量显著高于材料PL-CK和PL-40-1（图1B）。随着NaCl浓度不断增加,亲本材料Salam(SLM-CK)及其突变材料SLM-45-1间的叶片相对含水量为表现出显著差异（P<0.05）（图1C）。
2.2 盐胁迫对海滨雀稗叶片脯氨酸的影响
盐胁迫处理对海滨雀稗叶片脯氨酸产生显著影响,随着NaCl浓度增加,叶片脯氨酸含量呈上升趋势（图2）。Sea Isle 2000（SI-CK）和突变材料SI-50-1、SI-50-5、SI-60-6的脯氨酸含量随着盐胁迫浓度增加而逐渐升高,当NaCl浓度大于21 g/L时,SI-60-6脯氨酸含量急剧上升,显著高于其他材料（P<0.05）（图2A）。盐胁迫下Platinum（PL-CK）和突变材料PL-40-1、PL-40-2、PL-40-8的脯氨酸含量变化趋势与Sea Isle 2000相似。当NaCl浓度大于21 g/L时,PL-40-8的脯氨酸含量升高幅度显著高于其他材料（P<0.05）（图2B）。当NaCl浓度为0~7 g/L时,Salam（SLM-CK）和突变材料SLM-45-1的脯氨酸含量无显著性差异（P>0.05）。当NaCl浓度高于21 g/L时,SLM-CK的叶片脯氨酸含量无明显变化,而SLM-45-1的叶片脯氨酸含量迅速上升且显著高于SLM-CK（图2C）。
2.3 盐胁迫对海滨雀稗叶片相对电导率变化
盐胁迫处理后,海滨雀稗各材料的相对电导率均随着NaCl浓度的增加而呈上升趋势（图3）。当NaCl浓度为0~7 g/L时,Sea Isle 2000（SI-CK）和突变材料SI-50-1、SI-50-5、SI-60-6的叶片相对电导率无显著差异（P>0.05）。 在21 g/L的NaCl浓度下SI-50-5和SI-60-6的叶片的相对电导率显著低于SI-CK和SI-50-1（P<0.05）,而在35 g/L的NaCl浓度下仅有SI-60-6显著低于其他材料（P<0.05）（图3A）。当NaCl浓度为0 g/L时,Platinum（PL-CK）和突变材料PL-40-1、PL-40-2、PL-40-8间的叶片相对电导率差异不显著（P>0.05）。当盐度在7~35 g/L时,PL-40-8的叶片相对电导率显著低于其他各材料（P<0.05）（图3B）。Salam(SLM- CK)和突变材料SLM-45-1的叶片相对电导率变化趋势与Sea Isle 2000近似。当NaCl浓度为0~7 g/L时材料间电导率差异不显著（P>0.05）,而NaCl浓度为21~35 g/L时SLM-45-1的相对电导率显著低于SLM-CK（P< 0.05）（图3C）。
2.4 盐胁迫对海滨雀稗叶片叶绿素值含量的影响
随着NaCl浓度的不断增加,海滨雀稗各材料的叶绿素含量逐渐下降（图4）。当NaCl浓度为0~7 g/L时,Sea Isle 2000（SI-CK）和突变材料SI-50-1、SI-50-5、SI-60-6间的叶绿素含量无显著差异（P >0.05）。在21 g/L的NaCl浓度下SI-50-5和SI-60-6的叶绿素含量显著高于SI-CK和SI-50- 1（P<0.05）,而在35 g/L的NaCl浓度下SI-60-6的叶绿素含量显著高于其他材料（P<0.05）（图4A）。在0~35 g/L的NaCl浓度范围内,Platinum（PL-CK）和突变材料PL-40-1、PL-40-2、PL-40-8间的叶绿素含量变化趋势相同,即材料PL-40-8显著高于其他材料（P<0.05）（图4B）。当NaCl浓度为0~7 g/L时,Salam（SLM-CK）和突变材料SLM-45-1的叶绿素含量无显著差异（P>0.05）,而NaCl浓度为21~35 g/L时SLM-45-1的叶绿素含量均显著高于SLM-CK（P<0.05）（图4C）。
2.5 盐胁迫对海滨雀稗根系活力的影响
随着NaCl浓度的不断增加,海滨雀稗各材料的根系活力呈下降趋势（图5）。当NaCl浓度为0 g/L时,亲本材料Sea Isle 2000（SI-CK）的根系活力显著低于突变材料SI-50-1、SI-50-5、SI-60- 6（P<0.05）。当NaCl浓度为7~21 g/L时,SI-50-5、SI-60-6的根系活力显著高于其他2个材料（P< 0.05）。当NaCl浓度达到35 g/L时,Sea Isle 2000和突变材料间无显著差异（P>0.05）（图5A）。在无盐胁迫条件下,Platinum（PL-CK）和突变材料PL-40-1、PL-40-2、PL-40-8间的根系活力无显著差异（P>0.05）。当NaCl浓度为7~35 g/L时,PL-40-8的根系活力均显著高于其他3个材料（P< 0.05）（图5B）。亲本材料Salam（SLM-CK）和突变材料SLM-45-1的根系活力在所有盐浓度处理下均未表现出显著差异（P>0.05）（图5C）。
3 讨论
土壤中盐离子浓度较高时,草坪草根细胞渗透压降低,进而吸水能力下降出现缺水现象,导致生理干旱。植物叶片相对含水量能较好反映细胞的水分生理状态,在盐胁迫下,细胞内水分含量越高越有利于草坪草度过盐渍环境。胡化广等[23]对复盐胁迫下结缕草的生理与生长研究中指出,盐胁迫下叶片保持较高的相对含水量,其叶片也可保持较强的持水能力,其耐盐能力就越强。从研究结果可以看出,在盐浓度为35 g/L时突变材料SI-50-1、SI-50-5、SI-60-6叶片相对含水量高于亲本Sea Isle 2000,突变材料PL-40-2、PL-40-8叶片相对含水量高于亲本Platinum。表明此盐胁迫状态下,这些突变材料对盐环境的敏感性低于亲本材料,吸水能力更强。
在盐渍环境下,植物表现的越敏感,其耐盐性越弱,同时造成的生理伤害就越大。脯氨酸在植物体内积累,使植物保持一定的含水量与膨压势,以便使植物可以维持正常代谢,这在许多植物的耐盐性研究中得到证实[24,25]。在正常环境条件下,植物脯氨酸含量很低,但当其受到渗透胁迫时,植物体内脯氨酸氧化受到抑制与合成被促进[26]。在Buhl等[27]的研究中同样表明,在盐胁迫下,脯氨酸的合成会加强,从而造成脯氨酸在细胞中大量积累。本研究中,突变材料SI-60-6、PL-40-8、SLM-45-1的脯氨酸含量显著高于各自的亲本材料,表明脯氨酸调节渗透平衡,高浓度的盐胁迫对海滨雀稗突变材料造成的损伤更低,从而对植株在渗透胁迫下的生长起到保护作用。
植物遭遇盐胁迫时,生理生化过程受到破坏和干扰,有害代谢产物积累,影响叶绿素的合成。叶绿素含量的多少可反映盐胁迫下植物光合作用的强弱,耐盐性强的植物的叶绿素酶活性较低,叶绿素的降解就较少,而叶绿素含量下降的幅度可作为植物耐盐性强弱的重要指标,耐盐性越强叶绿素含量下降幅度越小[30,31]。因此,通过测定叶绿素含量可判断叶片受盐胁迫的损伤程度[32]。本研究中所有海滨雀稗材料的叶绿素含量均随盐浓度的增加而逐渐降低,说明盐胁迫影响植株叶绿素的合成,这与前人的研究结果一致[33]。在盐浓度达到21 g/L和35 g/L时,突变材料的叶绿素含量显著高于亲本材料,表明突变材料的光合强度和活性比亲本更高,盐害损伤的程度更小,更能适应高盐逆境。
根系为草坪生长提供了所需的水分和养分,是草坪草生长发育的重要器官。根系活力的高低反映了代谢能力的强弱,直接关系到整个草坪系统的整体质量和使用性能。与此同时,根系还可以通过调节根系模型来适应多变的土壤环境[34]。在高浓度盐胁迫下,突变材料PL-40-8的根系活力显著高于亲本材料,而在无盐胁迫下;两者无明显差异。突变材料根系活力的升高可能是对逆境的一种应激性反应,通过提高代谢作用吸收更多营养物质,缓解盐分对植物的伤害,以此来保证植物正常的生长发育[35,36]。此外有研究表明,低浓度盐胁迫对盐生植物的根系活力有促进作用,而高浓度盐胁迫则会对植物根系活力产生抑制作用[37]。本研究中,海滨雀稗亲本和突变材料均未观察到低浓度盐胁迫提升根系活力的现象。
在盐分胁迫的研究中,可通过测定叶片的相对含水量、脯氨酸含量、相对电导率、叶绿素值、根系活力来从不同方向来鉴定该材料的耐盐能力。本研究结果表明,海滨雀稗3个品种及其突变体在受到盐胁迫时,生理生化指标产生了明显变化,但Platinum的突变材料PL-40-8随着盐浓度的增高,各项生理生化指标的变化未出现较大波动。由此说明,该突变材料在遇到较高的盐分胁迫时,可通过维持较低的电导率与较高的脯氨酸的积累从而使叶片能保证正常的代谢合成。与此同时,叶片还能保证足够的含水量与叶绿素含量,保证植物正常的光合作用与呼吸代谢,进而保证植物正常的根系活力。可由此推断出Platinum的突变材料PL-40-8在盐胁迫下的适应性优于对照,耐盐性得到了很大的提升,因此,可作为耐盐品种进一步进行推广与选育。后续实验还需要进一步从分子水平探究该突变材料的耐盐机理,为选育耐盐品种奠定基础。