磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC）是一种细胞质酶,其主要功能是在Mg2+或Mn2+的辅助下,催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和HCO3-生成草酰乙酸（OAA）和无机磷酸盐（Pi）的不可逆反应[1]。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶广泛分布于古菌、细菌、蓝藻、绿藻、原生动物和植物中,在动物和真菌中不存在[2]。PEPC参与的催化反应是C4代谢和景天酸代谢植物光合作用中CO2同化和固定的主要步骤[1],同时PEPC还参与种子形成和萌发[2,3]、果实成熟[2]、气孔开放[4],调节植物对逆境胁迫的耐受性[5,6],为豆科植物根瘤共生氮固定提供碳骨架[7]等非光合生理过程。目前,PEPC基因已在多种植物中被鉴定和研究,拟南芥和水稻中分别报道4个和6个PEPC家族成员[8,9],在大豆中共鉴定到10个（GmPEPC1~10）PEPC基因,其中GmPEPC6、GmPEPC8和GmPEPC9被铝毒、寒害、盐害等非生物胁迫诱导表达[10]。花生基因组报道5个PEPC基因（AhPEPC1~5）[11],涂嘉琦等[12]从蔓花生基因组中鉴定到9个PEPC基因。
菠萝是一种极具营养和药用价值的热带水果。2016年菠萝的全球生产总值高达到14.9亿美元（www.freshplaza.com）,目前菠萝已成为世界第三大热带水果,第二大国际贸易的热带水果。2015年菠萝基因组测序和组装工作已经完成[13],为菠萝重要基因家族鉴定和分析提供了数据支持,菠萝WRKY[14]、NRT[15]、ABC[16]、DOF[17]等许多重要基因家族先后被报道。菠萝作为典型的CAM代谢植物,PEPC基因家族尚未被挖掘,其家族成员在菠萝光合过程中的作用尚不清楚,本文从菠萝基因组中鉴定出3个PEPC基因,并对其结构、序列特征及进化关系进行生物信息学分析,并结合转录组数据分析菠萝PEPC基因组织表达差异,为后期研究PEPC基因参与菠萝CAM光合代谢过程中物质积累和代谢调控作用机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
菠萝（Ananas comosus L.）基因组和转录组数据来自（http://pineapple.angiosperms.org）,拟南芥数据来自（https://www.arabidopsis.org/）,水稻数据来自（http://rice.plantbiology.msu.edu/）,玉米数据来自（https://www.maizegdb.org/）。
1.2 方法
1.2.1 菠萝AcPEPC家族基因鉴定 菠萝AcPEPC家族基因鉴定参考涂嘉琦等[12]的方法,从菠萝基因组数据库（http://pineapple.angiosperms.org）中检索菠萝的AcPEPC基因,同时获得其基因序列、转录本序列、CDS和氨基酸序列及染色体位置信息,并利用 Pfam 对AcPEPC候选基因进行进一步确认,凡包含PEPcase（PF00311）结构域蛋白为 PEPC蛋白家族成员。利用GSDS2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）工具绘制AcPEPC 基因结构图,分析其外显子和内含子结构。
1.2.2 菠萝AcPEPC蛋白理化性质分析 运用 Expasy（http://web.expasy.org/protparam/）在线工具分析AcPEPC蛋白成员的分子量、等电点、不稳定指数、总平均疏水性、脂溶系数;运用Plant-mPloc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant- multi/）预测AcPEPC蛋白的亚细胞定位,利用SOPMA（https: //npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）工具预测AcPEPC蛋白的二级结构。
1.2.3 菠萝AcPEPC蛋白保守结构域分析 利用 MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）在线工具分析AcPEPC蛋白保守基序,基序长度范围为10~50个氨基酸残基,基序最大发现数目为10个,其他参数为默认值。利用SMART（http:// smart.embl-heidelberg.de/）和Pfam（http://pfam. xfam.org）在线工具分析AcPEPC蛋白的PEPcase保守结构域。
1.2.4 菠萝AcPEPC蛋白进化树分析 利用Clustalx（1.83）对拟南芥和菠萝AcPEPC蛋白序列进行同源序列比对,并利用 MEGA6软件构建拟南芥、水稻、玉米、菠萝AcPEPC蛋白家族的系统进化树,采用相邻连接法（Neighbor-Joining,NJ）,校验参数 BootStrap 重复为 1000次,其他参数均为默认值。
1.2.5 菠萝AcPEPC基因的组织表达谱分析 在菠萝基因组网站（http://pineapple.angiosperms. org/pineapple/html/index.html）获取菠萝AcPEPC基因的组织表达量（fragments per kilobase of exon per million fragments mapped, FPKM）数据,包括菠萝根、白天和晚上叶片不同部位（S1-S6）、花、5个果实发育的阶段,以及叶片叶端（S5）和叶基部（S1）24 h表达量数据,采用TBtools工具绘制热图。
2 结果与分析
2.1 菠萝AcPEPC家族基因成员鉴定
表1 菠萝PEPC基因家族的特征描述Tab. 1 Characterization of PEPC genes in pineapple |
| 基因名称 Gene name | 基因识别码 Gene ID | 基因位置 Location | 基因方向Gene direction | 序列长度 Sequence length/bp | 编码序列长度 CDS length/bp | 基因描述 Gene description |
|---|---|---|---|---|---|---|
| AcPEPC1 | Aco010025.1 | LG10:2289633-2296058 | Forward | 6426 | 2895 | phosphoenolpyruvate carboxylase 1 |
| AcPEPC3 | Aco018093.1 | LG11:8354142-8364065 | Forward | 9924 | 2901 | phosphoenolpyruvate carboxylase 3 |
| AcPEPC4 | Aco016429.1 | LG10:11897432-11906814 | Forward | 9383 | 3504 | phosphoenolpyruvate carboxylase 4 |
2.2 菠萝AcPEPC蛋白分析
表2 菠萝PEPC蛋白的理化性质Tab. 2 Physical and chemical properties of AcPEPCs protein in pineapple |
| 蛋白Protein | 氨基酸数目 Amino acid number/aa | 分子量 MW/kDa | 等电点 PI | 不稳定指数 Instability index | 脂溶指数 Aliphatic index | 总平均亲水性 Average of hydropathicity (GEAVY) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| AcPEPC1 | 964 | 109.87 | 5.89 | 48.39 | 92.09 | -0.358 |
| AcPEPC3 | 966 | 110.29 | 5.98 | 44.09 | 90.26 | -0.381 |
| AcPEPC4 | 1017 | 114.71 | 6.14 | 54.35 | 90.05 | -0.383 |
表3 菠萝PEPC蛋白的二级结构分析和亚细胞定位Tab. 3 Secondary structure and subcellular localization of AcPEPCs protein in pineapple |
| 蛋白 Protein | α-螺旋 Alpha helix/% | 扩展链结构 Extended strand/% | β-转角 Beta turn/% | 无规则卷曲 Random coil/% | 亚细胞定位 Subcellular localization |
|---|---|---|---|---|---|
| AcPEPC1 | 62.14 | 5.81 | 4.15 | 27.90 | 细胞质 |
| AcPEPC3 | 61.90 | 5.80 | 4.35 | 27.95 | 细胞质 |
| AcPEPC4 | 58.80 | 5.90 | 3.54 | 31.76 | 细胞质 |
2.3 菠萝AcPEPC蛋白保守结构域分析
2.4 菠萝AcPEPC蛋白序列比对和进化树分析
对拟南芥、水稻、玉米和菠萝共计19个PEPC蛋白进行进化树分析（图4）。3个AcPEPC被分为2类,其中AcPEPC1和AcPEPC3与ZmPEPC5的亲缘关系最近,为植物型PEPC（PTPC）蛋白,而AcPEPC4与ZmPEPC3,AtPPC4和水稻Osppc-b聚为一类,为细菌型PEPC（BTPC）蛋白。氨基酸序列一致性结果显示（表4）,AcPEPC1和AcPEPC3的氨基酸序列相似性很高,达85.2%,且与拟南芥中PTPCs亚家族成员（AtPPC1、AtPPC2、AtPPC3）间的序列一致性均在82%以上,说明PTPCs亚家族的同源性很高,可能为同一基因进化而来的,而BTPCs亚家族成员AcPEPC4与PTPCs（AcPEPC1和AcPEPC3）的相似性分别为43.5%和43.0%,同源性较差,AcPEPC4与AtPPC4均为BTPCs亚家族成员,氨基酸一致性为74.8%。
图4 菠萝、拟南芥、水稻和玉米中PEPC蛋白家族成员的进化树Fig. 4 Phylogenetic tree of PEPC proteins in pineapple, Arabidopsis thaliana, rice and maize |
表4 菠萝和拟南芥PEPC氨基酸序列一致性分析Tab. 4 Amino acid sequence identity of PEPCs among pineapple and Arabidopsis thaliana% |
| 氨基酸Amino acid | AcPEPC1 | AcPEPC3 | AcPEPC4 | AtPPC1 | AtPPC2 | AtPPC3 | AtPPC4 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| AcPEPC1 | 100.0 | ||||||
| AcPEPC3 | 85.2 | 100.0 | |||||
| AcPEPC4 | 43.5 | 43.0 | 100.0 | ||||
| AtPPC1 | 83.3 | 86.9 | 44.1 | 100.0 | |||
| AtPPC2 | 82.5 | 86.5 | 43.9 | 85.5 | 100.0 | ||
| AtPPC3 | 83.6 | 87.5 | 44.4 | 91.8 | 84.8 | 100.0 | |
| AtPPC4 | 43.1 | 43.5 | 74.8 | 43.1 | 42.7 | 43.5 | 100.0 |
2.5 菠萝AcPEPC基因组织表达分析
为进一步分析AcPEPC基因在不同组织中的表达情况,本研究分析了不同组织在不同发育阶段的转录组数据,包括根、叶（叶片从叶基部至叶尖分为6个取样部位,依次为S1~S6,并分别在中午和晚上进行取样）、花和果实发育的5个阶段共19个样品数据,分析结果表明：AcPEPC1在叶片不同部位的表达量存在差异,分别在中午S4~S6,夜晚S5~S6表达量最高,在根中相对较低,其次为花,果实发育5个不同阶段AcPEPC1的表达量变化不大。AcPEPC3在根和果实发育前期（S1~S3）表达量相对较高,且在叶片S1~S3中的表达量高于叶片S4~S6。而AcPEPC4在花和果实发育各阶段表达量较高,在叶片和根中表达量低（图5）。这些表达量的差异说明其在菠萝光合作用中可能发挥不同功能。
图5 菠萝PEPC基因不同组织表达热图如图例所示,热图中的不同颜色指示基因转录组水平,图中NO-S1至S6表示成熟叶片中午时从叶基部至叶尖的6个不同采样部位,NI-S1至S6表示成熟叶片晚上时从叶基部至叶尖6个不同采样部位,R表示根,Fl表示花,Fr-S1至S5表示果实发育的5个时期。 Fig. 5 Heat map of the PEPC gene expressions in different tissues Different colors in heatmap refer gene transcript level as shown in the figure legend. NO-S1 to S6 represent 6 different parts from leaf base to leaf tip in the mature leaves at noon, NI-S1 to S6 represent 6 different parts from leaf base to leaf tip in the mature leaves at night, R represents root, Fl represents flower. Fr-S1 to S5 represent five stages of fruit development. |
PEPC酶主要参与菠萝CAM光合过程,其在叶片光合部位和非光合部位,以及相同部位不同时间点的表达可能存在差异。分析结果表明：AcPEPC1主要在绿色叶端部位表达,表达量明显高于白色叶基部位,AcPEPC3在白色叶基部位的表达量高于绿色部位,而AcPEPC4在叶片绿色和白色部位的表达量均较低,在白色基部的表达量略高于绿色部位。3个AcPEPC基因在不同时间点的转录组表达差异不明显（图6）。
图6 菠萝叶端（Gr）和叶基（Wh）AcPEPC基因24 h表达如图例所示,热图中的不同颜色指示基因转录组水平,图中Gr-6am至Gr-4am表示AcPEPC基因在叶端部位自早上6点到凌晨4点的表达情况,Wh-6am至Wh-4am表示AcPEPC基因在叶基部位自早上6点到凌晨4点的表达情况。 Fig. 6 AcPEPC gene 24 h expression profiles in leaf tip (Gr) and leaf base (Wh) Different colors in heatmap refer gene transcript level as shown in the figure legend. Gr-6am to Gr-4am represent AcPEPC gene 24 h expression profiles at leaf tip (Gr) from 6 am to 4 am, Wh-6am to Wh-4am represent AcPEPC gene 24 h expression profiles at leaf base (Wh) from 6 am to 4 am. |
3 讨论
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）在C4和CAM植物的光合作用过程中CO2的吸收发挥重要作用,并参与多种非光合作用过程。菠萝作为典型的CAM植物,其PEPC基因的研究尚未见报道。本研究从菠萝基因组中鉴定到3个PEPC家族成员。前期研究表明植物中存在2种类型的PEPC家族基因,包括植物型PEPC（PTPC）和细菌型PEPC（BTPC）,拟南芥编码的4个PEPC基因中3个属于PTPCs,1个属于BTPCs[8],在水稻中5个PEPC（Osppc1,2a,2b,3 and 4）为PTPCs,Osppc-b为BTPCs[9]。大豆中7个PEPC基因（GmPEPC3,4,6,7,8,9,1）属于PTPCs,3个PEPC基因（GmPEPC1,2,5）属于BTPCs[10]。花生中4个PEPC基因（AhPEPC1~4）属于PTPCs,1个基因（AhPEPC5）属于BTPCs[11]。本研究中AcPEPC1和AcPEPC3属于亚家族PTPCs,且与ZmPEPC5的进化关系最为相近,AcPEPC4与AtPEPC4,Osppc-b和ZmPEPC3聚在一起,属于亚家族BTPCs。研究表明PTPCs亚家族通常编码约为110 kDa大小的蛋白,且在N端具有保守的磷酸化作用位点,基因结构由10个左右的外显子组成,而BTPCs亚家族编码分子量约为117 kDa的氨基酸,且缺乏N端的磷酸化位点,基因结构由20个左右的外显子组成[2, 8]。对菠萝的研究有相似的结果,菠萝PTPCs（AcPEPC1,AcPEPC3）亚家族编码约为110 kDa的蛋白,包含10个高度同源的外显子,BTPCs（AcPEPC4）编码114.71 kDa的蛋白,包含19个外显子（图1,表2）。所有的PTPCs都是由共同的祖先基因进化而来的,具有高度的保守性[18],而BTPCs与PTPCs的序列同源性较低（<40%）[19,20],本研究中AcPEPC1和AcPEPC3的同源性高达85.2%,且与拟南芥中PTPCs成员的同源性均在82%以上,与BTPCs成员的同源性均在40%左右。保守基序分析发现AcPEPC1和AcPEPC3具有10个保守基序,且位置序列相对一致,而AcPEPC4缺少保守基序10。
前期报道PEPC基因广泛存在于植物的组织中,且表达具有组织特异性。例如Atppc4在花、根和果实表达[8],蔓花生AdPEPC家族多数成员在花和茎中表达量较高[12],花生中AhPEPC1在根、叶和种子表达量高,而在茎中表达量低,AhPEPC2在叶片表达量高,其他组织表达量低,AhPEPC3在根中表达量高,其次为种子,AhPEPC4 叶片中表达量高,其次为种子,而AhPEPC5在根和叶片中的表达量高于其他组织[21],GmPEPC5在茎和叶中的表达水平较高,而在花和根中的表达水平低[10]。本研究中,AcPEPC不同成员在不同组织部位中的表达量不同,其中AcPEPC1在叶片中的表达量较高,在根和花中的表达较低,且AcPEPC1在叶片叶端（S4~S6）的表达量显著高于叶片叶基（S1~S3）,AcPEPC3与AcPEPC1相反,AcPEPC3在根和果实中的表达量较高,在叶片中的表达较低,在S1~S3的表达量高于S4~S6。而AcPEPC4在花和果实发育的表达量高于叶片和根（图5）。进一步分析发现AcPEPC1在叶端（S1）24 h的表达量均高于叶基部（S5）,AcPEPC3同样呈现相反的趋势（图6）。AcPEPC4在叶端（S1）和叶基部（S5）24 h的表达量均较低这与AcPEPC4在叶片中的表达量较低结果相一致（图5）。菠萝不同PEPC成员表达差异其在光合过程中发挥的作用不同,AcPEPC1在叶端表达量较高,说明AcPEPC1可能是参与景天酸代谢过程中CO2吸收的关键基因,而AcPEPC3和AcPEPC4可能主要参与菠萝花和果实的发育,本研究结果为进一步研究PEPC基因在菠萝中的功能提供依据。