马蹄莲（Zantedeschia spp.）为天南星科（Araceae）马蹄莲属（Zantedeschia Spreng.）的多年生草本球根花卉。由于其形态高雅、色彩艳丽,不仅可用作切花和盆花,还可扎成花束、花篮,还是春秋两季花坛或花境的重要素材[1],因而其市场需求逐年增大。目前杂交育种是培育马蹄莲新品种的主要途径,在杂交过程中,为解决亲本花期不遇和异地授粉,需要对花粉进行贮藏和活力鉴定,因此,研究花粉活力检测的适宜方法和花粉贮藏影响因子具有重要的理论和实践意义。
低温能延长花粉的贮藏期限[2],Mathad等[3]研究表明,辣椒花粉在室温下3 d就失去授粉能力,在-20 ℃下可保存6 d,而液氮中保存48 d后仍能授粉结实。Kazushige等[4]的研究发现,翠雀花粉室温下贮藏期限不到21 d,在-30 ℃下可以保存180 d;Alba等[5]研究证明橄榄花粉在室温下只能保存10 d,在液氮中的贮藏时间却长达1年。Yuan等[6]研究表明蝴蝶兰花粉在室温下只能保存28 d,4 ℃下可以保存280 d,-80 ℃下可以保存672 d,而且4 ℃和-80 ℃下贮藏后的花粉仍能授粉结实。目前,有关马蹄莲花粉的研究较少,主要是简单的活力检测[7],关于低温或超低温贮藏期限还未见报道。因此,本文研究马蹄莲花粉活力鉴定方法及贮藏特性,旨在为马蹄莲杂交育种中花粉活力检测及离体保存提供理论依据,以促进这一优良种质资源的研究和利用。
1 材料与方法
1.1 材料
供试用的彩花马蹄莲品种（ym002、ym005、ym011、ym032、ym035、ym037、ym044、ym064、ym088）的开花植株来自于云南昆明亚欧园艺有限公司塑料大棚内栽培的盆栽马蹄莲;白花马蹄莲则来自于云南农业大学园林园艺学院种质资源圃。于2017年10月至2018年9月晴天的上午9：00用干燥毛笔采集盛开的马蹄莲花粉,装于垫有硫酸纸的培养皿中,迅速带回实验室备用。
本实验先以白花马蹄莲花粉为材料,筛选出适宜马蹄莲花粉活力鉴定的染色法和萌发法、初步探索出马蹄莲花粉贮藏影响因子,随后根据此结果以10个品种的马蹄莲花粉为材料,研究马蹄莲花粉的贮藏期限。
1.2 方法
1.2.1 花粉染色法 氯化三苯四氮唑（triphenyl tetrazolium chloride, TTC）染色法[8]：在载玻片上加1~2滴0.5%TTC染色液,用毛笔将白花马蹄莲新鲜花粉弹在染色液上,盖上盖玻片,置于28 ℃恒温培养箱中,12 h后置于显微镜下观察。碘-碘化钾（Lugol’s染色液）染色法[9]：在载玻片上加1~2滴Lugol’s染色液,用毛笔将白花马蹄莲新鲜花粉弹在染色液上,盖上盖玻片,置于28 ℃恒温培养箱中,5~10 min后置于显微镜下观察。亚甲基蓝染色法[10]：在载玻片上加1~2滴0.025%亚甲基蓝染色液,用毛笔将白花马蹄莲新鲜花粉弹在染色液上,盖上盖玻片,置于28 ℃恒温培养箱中,5~10 min后置于显微镜下观察。醋酸洋红染色法[11]：在载玻片上加1~2滴醋酸洋红染色液,用毛笔将白花马蹄莲花粉弹在染色液上,盖上盖玻片,置于28 ℃恒温培养箱中,10~ 15 min后置于显微镜下观察。
1.2.2 花粉离体培养 花粉离体培养采用固体培养基,设置不同种类培养基来筛选最适培养基。本研究采用正交试验设计,用L9(34)正交表安排试验,即3因素3水平试验（表1）。配制母液：称取MgSO4·7H2O 2 g,KNO3 1 g,赤霉素50 mg,定容至500 mL。除蔗糖、硼酸和硝酸钙之外,每种培养基加50 mL母液和6 g琼脂。培养基配置好后分装在培养皿中,放入4 ℃冰箱备用。
表1 花粉离体培养基正交试验表Tab. 1 Orthogonal test table of pollen in vitro medium |
| 水平 Level | 因素Factor | ||
|---|---|---|---|
| A：蔗糖 Sucrose/(g·L-1) | B：硼酸 Boric acid/(g·L-1) | C：钙 Calcium/(g·L-1) | |
| 1 | 70 | 0.1 | 0.1 |
| 2 | 80 | 0.2 | 0.2 |
| 3 | 90 | 0.3 | 0.3 |
参照周涤等[7]的方法,将白花马蹄莲新鲜花粉均匀弹落于培养基上,放于28 ℃培养箱中黑暗培养24 h后每隔2 h进行镜检,直至观察到花粉萌发率不再增加。萌发率=视野内萌发花粉粒数/视野内总花粉粒数×100%,各处理重复3次,每次重复统计花粉数不少于100粒。
表2 花粉贮藏前后处理方式正交试验表Tab. 2 Orthogonal test table of the treatment of pollen pre-storage and post-storage |
| 水平 Level | 因素Factor | ||
|---|---|---|---|
| A°：干燥时间 Drying time/h | B°：预冻方法 Pre-freezing method | C°：解冻方法 Thawing method | |
| ① | 9 | 直接放入冰箱 | 冰上解冻2 min |
| ② | 18 | 4 ℃ 12 h后放入冰箱 | 自来水冲淋2 min |
| ③ | 27 | -196 ℃处理后放入冰箱 | 37 ℃水浴2 min |
根据筛选的最适的预冻和解冻方式,将10个马蹄莲品种的新鲜花粉置于室温下干燥后,分装至2 mL离心管中,做好标记,设置不同的贮藏温度：室温、4、-20、-80 ℃。花粉活力测定：室温和4 ℃下贮藏的花粉每隔1 d测定1次活力,-20和-80 ℃下贮藏的花粉每隔10 d测定1次活力。
1.2.4 显微观察 花粉染色和萌发观察采用LEICA显微镜（ICC50 W, 德国）。使用LASEZ Version 3.2.1软件进行图像捕捉和保存。
1.3 数据处理
采用Excel 10.0软件处理数据和绘图,并利用SPSS 18.0和正交设计助手软件进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 不同染色法测定马蹄莲花粉活力的效果
TTC染色的原理在于检验花粉呼吸过程中脱氢酶的活性。具有活力的花粉呼吸作用较强,由于呼吸作用产生的氢能使无色的TTC还原成红色的TTF,因此花粉被染成红色;而无生命的花粉没有呼吸代谢活力,TTC不被还原,因而不着色。实验结果显示,TTC将马蹄莲花粉染成不同程度的红色（深红、浅红和粉红）,只是颜色分界不明显,如图1A所示。
Lugol’s染色液法是利用碘遇淀粉变蓝的原理来检测花粉活力。有活力的花粉积累的淀粉多,遇到碘化钾溶液可以被染成蓝色;无活力的花粉积累的淀粉少,因而不着色。实验结果显示马蹄莲花粉均未染成蓝色而呈黄褐色,可能是因为马蹄莲花粉内淀粉含量较少,不足以与碘化钾反应变色,如图1B所示。
亚甲基蓝是根据花粉胞质的有无来判断花粉活力,一般有活力的花粉胞质丰富,花粉能被染成蓝色;发育不完全没有活力的花粉缺少胞质,花粉不着色。实验结果显示,马蹄莲花粉均被染成蓝色,未成熟和败育花粉也着色,可能是因为马蹄莲花粉内存在其他可以使亚甲基蓝呈现蓝色的物质,如图1C所示。
醋酸洋红染色法是根据花粉对醋酸洋红的吸附作用来判断花粉活力。有活力的花粉细胞内物质积累较多,对醋酸洋红的吸附作用强,通常易被染成深红色,没有活力的花粉内含物少,因而不着色。实验结果显示马蹄莲花粉均未被染成深红色而呈染色液本身的颜色,可能是因为马蹄莲花粉细胞壁过厚,醋酸洋红染色液不能进入花粉细胞从而不着色,如图1D所示。
综上,Lugol’s 染色液和醋酸洋红染色液均没有使花粉染上对应的颜色;亚甲基蓝染色液将检测的所有花粉染成蓝色,而TTC染色液将花粉染成不同程度的红色,进而区分花粉活力强弱。所以除TTC染色法外,Lugol’s染色液、醋酸洋红和亚甲基蓝染色法均不适合马蹄莲花粉活力的鉴定。
2.2 离体培养法鉴定马蹄莲花粉活力的适宜培养基
花粉萌发结果显示（表3）,不同培养基下的白花马蹄莲花粉萌发率相差很大,其中组合5培养基80 g/L蔗糖+0.2 g/L硼酸+0.3 g/L硝酸钙培养24 h的效果最好,白花马蹄莲花粉在培养24 h的萌发率为76.64%,其次是组合4的69.75%,组合1最弱,只有36.78%。
表3 花粉离体培养正交试验参数条件及对应结果Tab. 3 Conditions and results of orthogonal test table of pollen in vitro medium |
| 序号 No. | 因素Factor | 萌发率 Germination rate/% | ||
|---|---|---|---|---|
| A | B | C | ||
| 1 | 1 | 1 | 1 | 36.78 |
| 2 | 2 | 2 | 2 | 49.36 |
| 3 | 3 | 3 | 3 | 56.24 |
| 4 | 1 | 1 | 2 | 69.75 |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 76.64 |
| 6 | 3 | 3 | 1 | 62.18 |
| 7 | 1 | 1 | 3 | 52.37 |
| 8 | 2 | 2 | 1 | 47.66 |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 60.57 |
| K1 | 47.63 | 52.97 | 48.88 | |
| K2 | 69.53 | 57.89 | 59.89 | |
| K3 | 53.53 | 59.66 | 61.75 | |
| R | 22.06 | 6.69 | 12.88 | |
通过K1、K2、K3的大小可以判断各因素对花粉萌发率的影响程度。以花粉平均萌发率为试验指标,根据极差值R的大小,可以判断各因素对花粉萌发率的影响主次,由表3中的结果可见,极差值R由大到小依次为A>C>B,所以主次因素的影响顺序为A（蔗糖）>C（钙）>B（硼酸）。为判断各因素对马蹄莲花粉萌发率的影响是否显著,采用方差分析进行检验,精确评估各因素对花粉萌发率的影响程度。当F值>F0.05时,表明相对应的因素达到显著水平（P<0.05）。当F值>F0.01时,表明相对应的因素达到极显著水平（P<0.01）。由表4可知,各因素对花粉萌发率的影响顺序为A（蔗糖）>C（钙）>B（硼酸）,且FA值>F0.05,表明蔗糖浓度对花粉的萌发率影响较显著（P<0.05）,而因素B（硼酸）和因素C（钙）对花粉萌发率的影响不显著。因此试验最佳培养基组合为A2B3C3,即80 g/L蔗糖+0.3 g/L硼酸+ 0.3 g/L硝酸钙。
表4 花粉离体培养基正交试验结果的方差分析Tab. 4 Analysis of variance of the results of the orthogonal test of optimum medium for the pollen culture |
| 影响因素Influencing factor | 偏差平方和SS | 自由度df | 均方MS | F值F value | 临界F值Critical F value |
|---|---|---|---|---|---|
| A | 779.42 | 2 | 389.71 | 35.59* | F0.05(2,2)=19.00 |
| B | 72.15 | 2 | 36.08 | 3.30 | F0.01(2,2)=99.00 |
| C | 290.63 | 2 | 145.32 | 13.27 | |
| 误差 | 21.89 | 2 | 10.95 | ||
| 总和 | 1164.09 | 8 |
Note: * means significance among treatments (P<0.05). | |
注：*表示处理间存在显著差异（P<0.05）。 |
2.3 不同品种马蹄莲花粉的活力差异
由图2可见,10个马蹄莲品种新鲜花粉在最佳组合培养基（80 g/L蔗糖+0.3 g/L硼酸+0.3 g/L硝酸钙）中培养24 h的萌发率从高到低依次为白花马蹄莲>ym064>ym035>ym088>ym044> ym037> ym011>ym005>ym032>ym002。白花马蹄莲活力显著（P<0.05）高于彩花马蹄莲;彩花马蹄莲中ym064显著（P<0.05）高于其他品种,ym035与ym088、ym037与ym044、ym002和ym005与ym032之间花粉活力差异不显著（P≥0.05）。
2.4 花粉贮藏影响因子
2.4.1 花粉含水量、预冻方法及解冻方式对花粉贮藏活力的影响 以白花马蹄莲新鲜花粉作为材料,在室温下干燥不同时间后,以不同的预冻方法处理后放入-80 ℃冰箱贮藏72 h后,用不同的解冻方式处理,花粉活力测定结果表明（表5）,不同处理方式对马蹄莲花粉的活力影响较大,其中组合⑦以室温干燥27 h后直接放入-80 ℃冰箱中贮藏,用37 ℃水浴2 min解冻处理的萌发率最高,达到57.31%,其次是组合⑧的37.55%,组合⑤最弱,只有16.65%。
表5 花粉贮藏前后处理方式正交试验参数条件及对应结果Tab. 5 Conditions and results of orthogonal test table of the treatment method of pollen pre-storage and post-storage |
| 序号 No. | 因素Factor | 萌发率 Germination rate/% | ||
|---|---|---|---|---|
| A | B | C | ||
| ① | 1 | 1 | 1 | 22.06 |
| ② | 2 | 2 | 2 | 27.22 |
| ③ | 3 | 3 | 3 | 24.75 |
| ④ | 1 | 1 | 2 | 16.73 |
| ⑤ | 2 | 2 | 3 | 16.65 |
| ⑥ | 3 | 3 | 1 | 23.89 |
| ⑦ | 1 | 1 | 3 | 57.31 |
| ⑧ | 2 | 2 | 1 | 37.55 |
| ⑨ | 3 | 3 | 2 | 20.57 |
| K① | 24.67 | 32.03 | 27.83 | |
| K② | 19.09 | 27.14 | 21.50 | |
| K③ | 38.47 | 23.06 | 32.90 | |
| R | 19.38 | 8.97 | 11.39 | |
表6 花粉处理方式正交试验结果的方差分析Tab. 6 Orthogonal test and range analysis of the optimum pollen treatment method |
| 影响因素Influencing factor | 偏差平方和SS | 自由度df | 均方MS | F值F value | 临界F值Critical F value |
|---|---|---|---|---|---|
| A° | 785.51 | 2 | 392.76 | 3.08 | F0.05(2,2)=19.00 |
| B° | 35.96 | 2 | 17.98 | 0.14 | F0.01(2,2)=99.00 |
| C° | 209.33 | 2 | 104.67 | 0.82 | |
| 误差 | 255.33 | 2 | 127.67 | ||
| 总和 | 1286.13 | 8 |
2.4.2 不同贮藏温度对马蹄莲花粉活力的影响 由图3A可知,白花马蹄莲新鲜花粉的活力最好,萌发率超过70%,室温下贮藏10 d后仍有20%的萌发率。彩花马蹄莲ym064、ym035、ym088、ym037和ym044新鲜花粉的活力较好,萌发率超过40%,室温下贮藏10 d后除ym037萌发率降至6%外,其他品种花粉仍有15%的萌发率。而彩花马蹄莲ym011、ym032、ym005和ym002新鲜花粉的活力较弱,萌发率不到30%,室温下贮藏10 d后萌发率只有6%,几乎失活。
从图3可以看出,4 ℃贮藏10 d后,除白花马蹄莲与彩花马蹄莲ym064仍有20%以上的萌发率（图3B）,其余品种花粉的萌发率均不到15%。-20 ℃下贮藏31 d后,彩花马蹄莲ym002、ym005、ym032、ym037和ym011萌发率已降至10%,将近失活;贮藏51 d后,除ym064仍有15%的萌发率外,其余品种的花粉萌发率均不到10%,61 d后所有品种花粉萌发率只有5%（图3C）。-80 ℃下贮藏61 d后,白花马蹄莲花粉仍有40.68%的萌发率,彩花马蹄莲ym064、ym035、ym044、ym037和ym088仍有20%的萌发率。彩花马蹄莲ym011、ym032、ym005和ym002的花粉在贮藏前萌发率较低,但其贮藏后的萌发率仍然超过10%（图3D）。
此外,在相同贮藏条件下,不同马蹄莲花粉活力的变化明显不同,其中白花马蹄莲的花粉活力最强,下降最慢;彩花马蹄莲ym005的花粉活力最弱,下降最快,同种花粉在不同贮藏条件下的活力也有显著差异,说明花粉活力与贮藏温度和花粉来源密切相关。
从图4可见,马蹄莲花粉在室温、4 ℃、-20 ℃和-80 ℃下贮藏10 d后,-80 ℃下贮藏的花粉平均萌发率最高,达到38.83%,其次是-20 ℃的30.35%,再次是室温的10.70%,最差的是4 ℃,平均萌发率只有8.99%。
-80 ℃下贮藏的10个马蹄莲花粉,贮藏31 d时,其平均萌发率从44.39%下降到28.86%;贮藏61 d时,平均萌发率仍有22.77%。与-80 ℃贮藏相比,-20 ℃贮藏的马蹄莲花粉,其活力下降较快,51 d后花粉萌发率不到10%,61 d后花粉萌发率力只有3.61%。而室温和4 ℃贮藏的马蹄莲花粉,其萌发率在2 d前相差不大,4 d后4 ℃的贮藏效果明显低于室温。
3 讨论
本研究所采用的4种染色法中,除TTC染色法外的3种染色法均不适于马蹄莲花粉活力的测定,Lugol’s染色液及醋酸洋红染色液均未能使马蹄莲花粉着色,可能是由于马蹄莲花粉的花粉壁对这2种溶液有限制作用,染色液不能穿过花粉壁进入原生质体,从而不能使花粉着色[13],也可能是马蹄莲花粉所含的淀粉较少,不能使Lugol’s染色液染色液变色;在亚甲基蓝溶液作用下马蹄莲花粉均被染成蓝色,说明没有活力的花粉也有足够的胞质被亚甲基蓝染色,所以此方法不能区分马蹄莲未成熟和败育花粉;本研究中TTC染色时间过长,如若大幅缩短染色时间,有可能会更好地分辨强活力、弱活力和无活力的花粉。染色法测定花粉活力虽然比实际值偏高,但快速便捷,在实际应用中建议先用TTC染色法对马蹄莲花粉活力做定性分析,再用萌发法对花粉做定量分析。
花粉长期冷冻贮藏时,其含水量与活力关系密切。含水量过高,花粉易受冻死亡丧失活力;含水量过低,花粉的代谢受到抑制则影响活力[14]。因此,花粉只有在适宜的含水量下贮藏才会持久的保持其活力[15]。芍药花粉超低温保存效果最好的含水量为12%左右[16];山茶花粉超低温保存效果最好的含水量为15%~23%[17];枇杷花粉超低温保存效果最好的含水量为30%左右[18];部分梅花在含水量高达40%时仍然可以进行超低温保存[19]。本研究用不同干燥时间区分花粉含水量,并发现马蹄莲花粉干燥27 h后在低温贮藏环境中仍能保持较高的活力。有研究发现,干燥温度越低,花粉的失水速度越慢,细胞自由水含量也较高,花粉在低温贮藏过程中更易形成细胞内结晶,引起细胞破裂,导致花粉活力降低[20,21]。本研究在室内（室温18~25 ℃）干燥花粉,室内空气湿度差异也可能对花粉的失水程度产生影响,因此,后续研究有必要将空气湿度考虑在内。
低温可以抑制花粉代谢活性进而延长花粉的贮藏期限。王钦丽等[2]研究表明,在超低温度（-270~-180 ℃）下花粉的生活力可以长期维持。一般来说,耐寒植物花粉萌发的适温较低,而喜温植物花粉萌发适温较高。马蹄莲喜温暖湿润和阳光充足的环境,不耐寒也不耐旱,其生长开花均需要相对高的温度。本研究中,室温下马蹄莲花粉的贮藏效果要稍好于4 ℃低温,说明马蹄莲花粉在常温条件下耐贮性较好,这与马蹄莲适宜的生长温度一致,此结果也与周涤等[7]的研究结果相一致;-20 ℃下花粉的贮藏效果则优于室温;-80 ℃下花粉贮藏61 d后仍有活力,贮藏效果显著高于其他3种温度,与山茶和百合花粉的研究结果相一致[17, 21]。
本研究从干燥时间、预冻处理、解冻方式和温度4个主要因素测定了马蹄莲花粉低温贮藏的效果,探明这些因子对马蹄莲低温贮藏的影响,至于马蹄莲花粉贮藏的低温极限,在超低温保存中是否会出现迎春、紫叶桃等花粉超低温保存的“冷刺激”现象[15]有待进一步研究。