海南省冬种番茄（圣女果）是一种经济价值很高的水果型蔬菜[1]。病毒病是危害番茄生长的主要病害之一[2]。目前研究表明,侵染番茄的病毒主要有烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）、马铃薯X病毒（Potato virus X,PVX）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）、烟草卷叶病毒（Tobacco leaf curl virus,TLCV）、苜蓿花叶病毒（Alfalfa mosaic virus,AMV）、番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis virus,ToCV）、番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）、番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus,ToMV）、番茄斑驳花叶病毒（Tomato mottle mosaic virus,ToMMV）等[3,4]。
番茄斑驳花叶病毒（ToMMV）是帚状病毒科（Virgaviridae）烟草花叶病毒属（Tobamovirus）的一个新种,基因组为正义单链RNA。2013年,该病毒在墨西哥番茄上首次被发现[5],随后在美国、以色列、巴西等地的番茄上检出该病毒[6,7,8,9],我国云南省与西藏自治区部分地区的辣椒也受到该病毒的侵染[10]。ToMMV主要侵染茄科作物,致使植株生长缓慢、矮化,叶片褪绿变形。ToMMV极易通过汁液传播,但关于其发生规律、传播途径以及分子生物学特性的研究甚少。目前,文献报道了分离自美国、墨西哥、西班牙、巴西及我国云南和西藏的该病毒9个分离物的全基因组信息。
2016年,海南省陵水县冬种番茄（圣女果）田间植株发生矮化、叶片褪绿斑驳及扭曲变形等类似病毒病症状,本研究采用小RNA深度测序及RT-PCR技术对其病原病毒进行鉴定和检测,证实病株受到ToMMV侵染。随后采用RT-PCR分段扩增获得了该病毒分离物的全基因组序列并对其基因组结构特征进行分析,以期为该病害的检测防控提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 材料
2016年,海南省陵水县冬种番茄（Lycopersicon esculentum）（圣女果）田间植株发生矮化、叶片褪绿斑驳及扭曲变形等类似病毒病症状。采集发病叶片于-80 ℃冰箱保存,抽提样品幼嫩叶组织总RNA,-20 ℃冰箱保存,同时采用汁液摩擦接种,将病毒毒源保存于本生烟（Nicotiana benthamiana）植株上,用于进一步实验。
1.2 方法
1.2.1 小RNA深度测序及RT-PCR验证 对所采集植株幼嫩叶片的小RNA进行测序。从5株显症植株上各采取100 mg左右幼嫩叶组织,混合后提取小RNA,使用Small RNA Sample Pre Kit（Illumina公司）构建文库,采用Illumina HiSeq 4000测序仪进行深度测序,对原始序列进行除杂后,以Velvet assembler软件[11]从头（De novo）拼接获得拼接序列（contigs）,将拼接序列与NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nig.gov）病毒数据库已知病毒基因组序列进行同源性比对,初步判断样品中存在疑似病毒的种类。上述测序及分析工作委托广东美格基因科技有限公司完成。
分别合成（上海生工生物工程有限公司）番茄斑驳花叶病毒（ToMMV）[10]、烟草花叶病毒（TMV）[12]和番茄花叶病毒（ToMV）[13]的特异性引物（表1）,采用RT-PCR检测对小RNA测序结果进行验证。采用Trizol试剂（南京诺唯赞生物科技有限公司）提取番茄（圣女果）感病植株幼嫩叶片的总RNA,以其为模板利用一步法反转录试剂盒HScript®One Step RT-PCR Kit Ver.5.1（南京诺唯赞生物科技有限公司）进行RT-PCR扩增。反应体系为：5.0 µL 2× One Step Mix,2.5 µL RNase free ddH2O,0.5 µL CPF（10 µmol/L）,0.5 µL CPR（10 µmol/L）,1.0 µL模板RNA,0.5 µL One Step Enzyme Mix,加ddH2O至总反应体积20 µL。RT-PCR反应条件为：50 ℃反转录30 min,94 ℃预变性 3 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35个循环。对5株田间样品进行检测,根据扩增产物的大小和产物直接测序结果鉴定样品中的病毒种类。
表1 病毒RT-PCR检测引物Tab. 1 Primers for RT-PCR virus detection |
| 引物名称及检测病毒 Primer name | 引物序列 Primer sequence (5′-3′) | 预期扩增片段大小 Expected product length/bp |
|---|---|---|
| ToMMV-F | CTGGAGAA ACTGGGTCTTG | 1152 |
| ToMMV-R | TTCGGTAAGTTCAATGGGACCT | |
| TMV-F | TAGACCCGCTAGTCACAG | 237 |
| TMV-R | CAGAGGTCCAAACCAAAC | |
| ToMV-F | GGCTGGATCCTAATACCTTGGTCAACGATC | 373 |
| ToMV-R | GGCTAAGCTTGCATTATGTCGCGGACATCC |
1.2.2 ToMMV-HN全基因组序列测定 取确诊为ToMMV侵染的番茄病株幼嫩叶片,通过汁液机械摩擦接种法,将病毒（命名为番茄斑驳花叶病毒海南分离物,ToMMV-HN）接种于本生烟幼苗上,15 d后取细嫩显症叶片抽提总RNA,以ToMMV云南分离物（ToMMV-YYMLJ）基因组序列（No. KR824950）为参照,设计4对覆盖全基因组的PCR引物,每对引物预期扩增片段大小约为1700 bp,相邻两片段之间约有100 bp的重叠区域（表2）,采用RT-PCR法获得病毒基因组扩增产物。反应体系和程序同上所述,扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离,在紫外灯下切下目的条带,送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向序列测定。利用DNAstar软件对上述4对引物扩增所得产物序列进行拼接,获得ToMMV-HN基因组全序列,提交至Genbank数据库公开发布。
表2 ToMMV-HN全基因组序列扩增引物Tab. 2 Primers for determination of ToMMV-HN genomic sequence |
| 扩增片段 Amplified fragment | 引物序列 Primer sequence (5′-3′) | 方向 Direction | 位置 Position | 预期扩增片段大小 Expected product length/bp |
|---|---|---|---|---|
| F1 | GCGCGTATTTATTATTACAACAATTACC | + | 1~1677 | 1677 |
| CTCGGAAACCAACCTATCATGG | - | |||
| F2 | TATCGTTAGCGTTTGGCAATGCC | + | 1538~3237 | 1699 |
| TCTGACTAACGACACATCCGCA | - | |||
| F3 | CCAAACCACTCAGTGGAAAGGT | + | 3081~4783 | 1702 |
| CACAATTGTTCAACGAGCCAGC | - | |||
| F4 | CTCGGTGCAAAACACATCAAGG | + | 4696~6399 | 1703 |
| TGGGCCCCTACCGGGG | - |
Note: The primer positions were based on the GenBank accession number KR824950. | |
注：引物位置参照ToMMV-YYMLJ（No. KR824950）。 |
1.2.3 ToMMV-HN基因组序列分析 采用ORF Finder软件对获得的ToMMV-HN全基因组序列进行结构分析,搜索编码序列（open reading frame,ORF）和非编码序列,获得编码产物氨基酸序列和相关特征数据。从NCBI网站获取已报道的9个ToMMV分离物及同属（烟草花叶病毒属,Genus Tobamovirus）的3种病毒（TMV、ToMV和TBRFV）代表分离物全基因组序列,使用DNAstar软件中的MegAlign对ToMMV-HN全基因组序列进行比对分析。采用Mega 7.0软件邻位相接聚类分析法构建基于全基因组序列的ToMMV系统发育树,用1000次重复的自展检验评价系统发育树拓扑结构的可靠性[14,15]。
2 结果与分析
2.1 小RNA深度测序检测番茄样品中病毒种类
对海南省陵水县疑似感染病毒病的番茄（圣女果）幼嫩叶片混合样品进行小RNA深度测序,共获得22 619 831条reads,除杂后为19 516 592条reads,拼接获得216个contigs。经与GenBank中报道的病毒序列进行比对,其中31条比对到番茄斑驳花叶病毒（ToMMV）,同源率均高于98%,11条比对到番茄花叶病毒（ToMV）,同源率为83%~92%,5条比对到烟草花叶病毒（TMV）,同源率为77%~92%。测序结果初步表明,混合样品中可能含有以上3种病毒。
2.2 RT-PCR对小RNA深度测序检测结果的验证
采用ToMMV、ToMV和TMV特异引物,对采集自海南省陵水县田间表现病毒病症状的5株番茄（圣女果）样品进行RT-PCR检测,结果仅ToMMV特异引物能从病株叶组织总RNA抽提物中获得预期大小（约1000 bp）扩增产物（图1）。而ToMV和TMV特异引物不能扩增到预期产物（结果未显示）。该结果表明引起海南省陵水县圣女果（番茄）病毒病的病原为ToMMV。
2.3 ToMMV海南分离物基因组全长序列的测定及分析
以室内人工接种感病本生烟叶片总RNA为模板,RT-PCR获得4个DNA片段,大小与预期一致,分别为1677、1699、1702、1703 bp（图2）。双向直接测序后进行拼接,得到ToMMV-HN全长基因组序列,注释后在NCBI GenBank数据库中发布,序列登录号为MH381817。
图2 RT-PCR扩增获得ToMMV-HN全基因组4 个片段M：DL2000 DNA marker;1~8：ToMMV-HN基因组4对引物扩增得到的RT-PCR产物;其中1和2,3和4,5和6,7和8分别是重复实验。 Fig. 2 The four RT-PCR products covering the genome sequence of ToMMV-HN M: DL2000 DNA marker; 1-8: RT-PCR products amplified by four primer pairs of ToMMV-HN; lane 1 and 2, 3 and 4, 5 and 6, 7 and 8 were repeat experiments, respectively. |
2.4 ToMMV海南分离物与其他分离物亲缘关系分析
ToMMV-HN基因组全长6399 nt,编码4个开放阅读框,5′至3′编码产物分别为126和183 ku的复制酶蛋白、29.8 ku的运动蛋白以及17.7 ku的外壳蛋白。将其与已报道的ToMMV9个分离物和烟草花叶病毒属3个种代表分离物进行核酸和氨基酸序列比对,结果表明,ToMMV-HN与同属异种病毒基因组核酸序列相似性仅为79.0%~ 84.7%;而与ToMMV各分离物相似性为98.9%~ 99.7%,其中126 ku复制酶蛋白的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.2%~99.6%和99.2%~ 99.6%,183 ku复制酶蛋白的相似性分别为99.2%~ 99.6%和99.4%~99.8%,运动蛋白的相似性分别为98.8%~99.6%和99.3%~99.6%,外壳蛋白的相似性分别为99.4%~100%和99.4%~100%（表3）。此外,ToMMV-HN的5′非编码区与ToMMV其他分离物保持98.7%~100%的相似性,而3′非编码区与ToMMV其他分离物保持98.0%~100%的相似性。相比较而言,ToMMV-HN与中国云南分离物ToMMV-YYMLJ和中国西藏分离物ToMMV- TiLhaLJ基因序列相似性较高,各开放阅读框及5′/3′非编码区序列相似性分别为99.6%~100%和99.4%~100%,但与其余各分离物开放阅读框及5′/3′非编码区序列相似性也均在98%~100%范围内。
表3 ToMMV-HN与已报道的ToMMV分离物核苷酸和氨基酸序列相似性Tab. 3 Nucleotide and amino acid sequence identities between ToMMV-HN and other reported isolates |
| 分离物 Isolate | 登录号 Accession number | 国家 Country | 相似性Identity/% | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 基因组 Genome | 126 ku复制酶 126 ku viral replicase | 183 ku复制酶 183 ku viral replicase | 运动蛋白 Movement protein | 外壳蛋白 Coat protein | 5′非编码区 5′ noncoding region | 3′非编码区 3′ noncoding region | |||||||
| nt | nt | aa | nt | aa | nt | aa | nt | aa | nt | nt | |||
| ToMMV- MX5 | KF477193 | 墨西哥 | 99.5 | 99.4 | 99.3 | 99.5 | 99.5 | 99.4 | 99.3 | 99.8 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| ToMMV- 10-100 | KP202857 | 美国 | 99.4 | 99.3 | 99.6 | 99.4 | 99.6 | 99.3 | 99.3 | 99.6 | 100.0 | 100.0 | 98.0 |
| ToMMV- NY-13 | KT810183 | 美国 | 99.4 | 99.3 | 99.2 | 99.3 | 99.4 | 99.6 | 99.6 | 99.6 | 99.4 | 98.7 | 100.0 |
| ToMMV- SC13-05 | KX898033 | 美国 | 99.5 | 99.4 | 99.4 | 99.4 | 99.6 | 99.4 | 99.3 | 100 | 100.0 | 98.7 | 100.0 |
| ToMMV- CA16-01 | KX898034 | 美国 | 99.2 | 99.2 | 99.6 | 99.2 | 99.7 | 98.8 | 99.3 | 99.8 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| ToMMV- YYMLJ | KR824950 | 中国 | 99.6 | 99.6 | 99.6 | 99.6 | 99.8 | 99.6 | 99.6 | 99.4 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| ToMMV- TiLhaLJ | KR824951 | 中国 | 99.7 | 99.6 | 99.6 | 99.6 | 99.8 | 99.6 | 99.6 | 99.6 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| ToMMV- VLC-1 | KU594507 | 西班牙 | 98.9 | 98.7 | 99.3 | 98.8 | 99.3 | 99.4 | 99.6 | 99.0 | 100.0 | 100.0 | 99.5 |
| ToMMV- CpB1 | MH128145 | 巴西 | 99.0 | 98.8 | 99.1 | 98.8 | 99.3 | 99.1 | 99.3 | 99.6 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| ToMV- SL-1 | KY912162 | 斯洛伐克 | 84.7 | 85.1 | 94.3 | 85.4 | 94.7 | 78.7 | 81.4 | 85.8 | 91.2 | 95.8 | 81.9 |
| TBRFV- Tom1-Jo | KT383474 | 约旦 | 80.7 | 80.4 | 91.5 | 81.7 | 92.2 | 73.8 | 72.9 | 80.2 | 86.2 | 82.4 | 82.7 |
| TMV- Hejiang | HE818427 | 中国 | 79.0 | 79.3 | 90.5 | 80.4 | 84.7 | 71.0 | 72.8 | 75.4 | 81.8 | 88.1 | 82.1 |
基于ToMMV基因组序列构建的系统发育树表明,10个ToMMV分离物可分为2个亚组,其中西班牙分离物ToMMV-VLC-1与巴西分离物ToMMV-CpB1在同一亚组中（图3）。ToMMV-HN分离物与其他中国分离物、美国分离物、墨西哥分离物处在一个亚组中,其中中国海南分离物ToMMV-HN与中国云南分离物ToMMV-YYMLJ、中国西藏分离物ToMMV-TiLhaLJ在同一分支上,而美国加州分离物ToMMV-CA16-01与南卡州分离物ToMMV- SC13-05处于同一分支中,墨西哥分离物ToMMV-MX5与美国纽约分离物ToMMV- NY-13处于同一分支中,美国佛罗里达州分离物ToMMV-10-100单独形成分支。相对而言,中国海南分离物ToMMV-HN与中国2个辣椒分离物亲缘关系较近,与美国加州和南卡州番茄分离物次之,而与西班牙和巴西番茄分离物亲缘关系较远。
3 讨论
ToMMV高度保守,本研究发现该病毒海南番茄（圣女果）分离物（ToMMV-HN）与其他分离物基因组各开放阅读框和非编码区在核苷酸和氨基酸水平上极为相似（相似性为98.0%~100%和99.2%~100%）,但与同属其他病毒存在较大差异（基因组核酸相似性79.0%~84.7%）,这为病毒分子检测技术的研发和抗病品种的选育提供了便利。本研究还发现该病毒海南番茄（圣女果）分离物（ToMMV-HN）与云南和西藏辣椒分离物在亲缘关系上极为相近,由此推测侵染海南番茄的毒源与侵染云南和西藏辣椒的毒源可能相同或相似,但此推测尚需更多的研究及调查资料支持。
本研究中,小RNA深度测序检测到3种同属于烟草花叶病毒属的病毒,但RT-PCR仅验证了其中的一种病毒,这一结果表明,小RNA测序技术检测病毒时可能发生一定程度的误判[21]。由于小RNA测序所得序列较短,在进行数据库搜索时,其中某些片段会比对到亲缘关系相近的其他病毒,因此,在进行病毒检测时,小RNA深度测序技术需与RT-PCR等方法结合使用。