龙眼（Dimocarpus longan Lour.）是我国著名的热带亚热带特色木本果树,龙眼果实富含酚类等次生代谢物,被誉为“南方人参”。龙眼原产于中国和东南亚,在东南亚、南亚、澳大利亚和夏威夷等地均有较大规模的种植[1]。我国栽培龙眼的历史可追溯到2000多年以前,种植龙眼的省（区）包括广东、广西、福建、四川、云南和海南,但主产区在广东、广西和福建3个省（区）[2]。龙眼合子胚的生长发育状况与其产量、种子大小、果实品质等生产性状息息相关,由于龙眼树体高大,合子胚被果实胚囊包裹在中间,并且在子叶胚形成前合子胚极其细小,无法实时观测合子胚的发育状况,导致龙眼合子胚发育中期阶段之前的材料取材困难[3]。同时,龙眼具有童期长、遗传背景复杂、高度杂合的特点,极大限制了分子生物学在龙眼合子胚胚胎发育研究上的应用。植物体细胞胚胎（体胚）发生过程和合子胚胚胎发生过程的发育阶段高度相似[4,5],体胚发生是植物胚胎发生特别是胚胎发育早期分子调控机制研究的模式系统[6]。赖钟雄等[7,8]建立的龙眼体胚发生系统具有高度同步、高频率发生和再生能力强等特点,是研究木本植物胚胎发生的优良实验系统。20多年来,福建农林大学园艺植物生物工程研究所在龙眼体胚发生系统研究的基础上,对其分子调控机制进行了大量研究,包括龙眼体胚发生相关基因克隆、全基因组鉴定,体胚发生相关基因表达模式与功能研究,蛋白质组学分析,全转录组测序分析,DNA甲基化研究,龙眼体胚发生过程lncRNA、microRNA、miPEP、cirRNA研究,龙眼体胚遗传转化研究等。Lin等[9]于2017年首次完成了龙眼全基因组测序,建立了无患子科植物的第一个全基因组数据库,为研究龙眼体胚发生的分子调控机制提供完整的基因组信息。本文就龙眼体胚发生各方面的研究进展进行综述。
1 龙眼体胚发生研究进展
1.1 龙眼胚性愈伤组织诱导与离体保存
在20世纪80年代初,研究人员就已经开始进行龙眼体胚发生与植株再生等方面的研究。魏文雄等[10]以‘东壁’和‘红核子’幼胚子叶为外植体首次诱导出愈伤组织,但仅在少数愈伤组织中产生胚性细胞,胚性细胞通过体胚发生途径获得完整植株;杨永青等[11]以‘东壁’花药为材料诱导胚性愈伤组织（embryogenic callus, EC）,由EC分化的胚状体再萌发成正常花粉植株,经根尖细胞镜检获得单倍体龙眼植株（n=15）;周丽侬等[12]以无菌初生幼苗和自然萌发实生苗的不同组织部位为外植体,诱导获得愈伤组织,但只有茎段诱导的愈伤组织可分化成芽,以及侧芽和顶芽诱导的部分愈伤组织可分化成根;杨永青等[13]从焦核龙眼幼胚的离体培养中获得胚状体,通过体胚发生途径获得再生植株,实现焦核龙眼的胚胎挽救。此外,Litz[14]从树龄超过30年的龙眼树幼叶离体培养中获得EC,经体胚发生途径获得再生植株。因此,已经成功从龙眼的子叶幼胚、花药和叶片等组织部位诱导出龙眼EC,并经体胚发生途径获得了再生植株,但部分胚性愈伤组织的稳定性和体胚发生能力较差,甚至出现畸形胚,体胚发生频率较低、数量较少,制约了龙眼体胚发生过程的生理生化及分子生物学等系统研究。
20世纪90年代初,赖钟雄等[1, 8]以‘红核子’‘油谭本’‘东壁’‘十二月龙眼’‘九月乌’等龙眼未成熟果幼胚和‘东壁’等龙眼的花药为外植体,诱导出CI类型,CIIa、CIIb类型,CIII类型的愈伤组织,CIIa、CIIb类型愈伤组织经4~5次继代培养也可选择出松散型的CIII型愈伤组织,CIIa、CIIb类型和CIII类型的愈伤组织体胚发生能力极强,经过1个月左右的培养,每克鲜样可分化出约1万个胚状体;以MS为基本培养基分别添加1.0 mg/L 2,4-D与1.0 mg/L 2,4-D、0.5 mg/L KT、5.0 mg/L AgNO3对松散型胚性愈伤组织进行交替培养,可达到长期继代保存松散型胚性愈伤组织的目的。叶炜等[15]参照此法,成功从51份龙眼种质中诱导获得胚性愈伤组织,并进行长期继代保存。林秀莲等[16]通过对离体保存的龙眼EC及其体胚发生过程染色体数目变异的研究,发现二倍体龙眼离体培养物中存在单倍体、三倍体、四倍体、非整倍体等广泛的变异,这种变异现象从EC诱导开始就存在,并且变异率会随离体培养时间的增加而升高,但最终趋于稳定。
1.2 龙眼高频体胚发生及植株再生
赖钟雄等[7]在获得3种类型胚性愈伤组织的基础上,明确了愈伤组织的类型、蔗糖浓度和光照条件是龙眼体胚发生过程的关键调控因子,成功建立了龙眼体胚发生系统。赖钟雄等[17]从不同龙眼品种外植体中诱导筛选的CIII型龙眼EC通过液体培养方式都能在2周左右建立胚性悬浮细胞系,采用分别附加AgNO3和肌醇的液体培养基交替培养及固体-液体轮回培养的方式实现了胚性悬浮细胞系的长期保持,胚性悬浮细胞转移至固体培养基或在液体浅层培养均可获得大量胚状体,固体培养基上的胚状体大小不一致,液体浅层培养的大小比较一致,体胚成熟后获得再生植株。龙眼松散型胚性愈伤组织经过分离获得单细胞悬浮细胞系,龙眼的单细胞采用液体浅层培养方式,先形成多细胞团,再发育形成早期球形原胚结构、球形胚结构和子叶形胚结构,最终获得再生植株[18]。此外,龙眼胚性培养细胞及胚性悬浮细胞可获得高产和高活力的原生质体,与悬浮单细胞培养类似,龙眼原生质体通过体胚发生途径形成再生植株[19]。赖钟雄等[20]采用电融合方法将龙眼和荔枝的原生质体进行融合,融合率超过20%,融合产物经初步培养形成多细胞团。黄浅等[21]进行荔枝龙眼原生质体的电融合研究,融合率高达30%以上,建立了荔枝和龙眼原生质体的电融合技术体系,融合产物经初步培养形成多细胞团。龙眼这种极强体胚发生和植株再生能力在木本植物中是十分罕见的,这种优良的体胚发生体系可作为研究植物体胚发生尤其是木本植物体胚发生的模式实验系统。
1.3 龙眼体胚发生同步化调控与组织形态学观察
体胚发生的同步化调控是建立龙眼体胚发生系统的关键环节,在龙眼EC诱导及高频体胚发生的基础上,陈春玲等[22]进行了龙眼体胚发生的同步化调控研究,发现龙眼EC在分别添加0.5、0.3、0.1、0 mg/L 2,4-D的MS培养基（蔗糖2%）中培养,可分别获得高度同步化的不完全胚性紧实结构、胚性紧实结构、球形胚和非胚性愈伤组织,将龙眼EC转移至MS基本培养基（蔗糖5%）上培养可获得高度同步的早期子叶形胚和成熟子叶胚,组织形态学研究表明龙眼体胚发生主要是单细胞内起源。王凤华等[23]将球形胚接种于蔗糖含量为2%的MS基本培养基上培养,在培养至第8~9天和第10~12天分别获得大量同步化的心形胚和鱼雷形胚;将龙眼EC接种于蔗糖含量为2%的MS基本培养基上培养40 d获得大量同步化的子叶形胚,子叶形胚接种于蔗糖含量为5%的MS基本培养基上培养约75 d可获得成熟体胚。方智振等[24]在获得高度同步化的球形胚（0.1 mg/L 2,4-D）基础上,将球形胚接种于添加0.07、0.05、0.06、0 mg/L 2,4-D的MS基本培养基中,分别获得同步化的心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚。因此,2,4-D浓度、蔗糖浓度以及培养时间对龙眼体胚同步化调控具有重要的影响,通过对这3个因子的调控可获得同步化的各个发育阶段胚性培养物,为龙眼体胚发生过程的生理生化变化与代谢物积累、全转录组学分析、蛋白质组学分析、体胚发生相关基因的表达调控和功能分析等研究奠定基础。
2 龙眼体胚发生过程生理生化变化与代谢物积累
植物激素的诱导与调节是体胚发生和发育的关键因素,而内源激素的代谢与动态平衡对细胞分化至关重要。赖钟雄等[3]的研究表明,龙眼胚性愈伤组织中内源激素含量高于非胚性愈伤组织内源激素的含量,从龙眼胚性愈伤组织阶段至子叶形胚阶段内源IAA含量维持在较高水平,且远高于非胚性愈伤组织阶段,而在成熟子叶胚阶段则急剧下降;在非胚性愈伤组织阶段的内源GA3含量较高,随着体胚的进一步发育,内源GA3的含量逐渐下降;与内源IAA和GA3相比内源ABA的含量总体较低,在体胚发生过程ABA含量从球形胚阶段开始相对较高,内源玉米素含量的变化趋势与IAA相似,只是在成熟子叶形胚阶段其含量仍维持在较高水平;除GA3外,内源激素在胚性愈伤阶段II和球形胚阶段的含量较高,呈现类“M”的变化趋势。龙眼体胚发生过程内源多胺含量的研究表明,内源多胺与内源激素含量的变化趋势相似,都呈现类“M”的变化趋势[25]。通过对龙眼体胚发生过程的内源激素和多胺的研究表明,胚性愈伤阶段II和球形胚是其生理生化变化的转折阶段,虽然胚性愈伤阶段I和阶段II在组织形态学上没有差别,但生理生化上已经发生明显的变化[3]。此外,高浓度蔗糖、光照条件、渗透剂聚乙二醇（PEG）、椰乳和脱落酸等培养因子对龙眼体胚成熟过程中的可溶性糖、淀粉含量也具有明显的调控作用[26]。陈春玲[27]的研究结果表明,酯酶、过氧化物酶和淀粉酶同工酶酶谱在龙眼体胚发生过程中的规律性变化,反应出龙眼体胚发生过程各个阶段遗传信息表达的选择性和顺序性。乙醇脱氢酶的含量在龙眼体胚发生过程中逐渐降低[28],而抗坏血酸过氧化物酶同工酶含量在胚性愈伤组织、球形胚、子叶形胚阶段逐渐递增[29]。陈义挺等[30]研究表明,随着龙眼体胚早期发生（松散型胚性愈伤组织、胚性愈伤II、不完全胚性紧实结构、胚性紧实结构、球形胚）过氧化物酶（POD）活性呈下降趋势,低温或高温处理下POD酶活性显著高于对照,高温或低温均可明显影响POD同工酶谱带的出现和表达,POD酶活性及其同工酶谱的规律性变化可能与龙眼体胚发生早期的细胞分化和体胚发育维持具有密切的关系。
光调控是一种改变植物细胞功能性代谢产物合成的重要方法,采用不同光质处理龙眼EC结果表明,蓝光和白光可以促进龙眼EC中多糖、生物素、生物碱和类黄酮的积累,其中蓝光的效果最明显;与白光和黑暗处理相比,蓝光处理下龙眼EC中超氧化物歧化酶、过氧化物酶、苯丙氨酸解氨酶活性和过氧化氢酶含量显著升高,说明光照能激活龙眼EC中的抗氧化系统[31]。李汉生等[32]采用生物反应器放大培养龙眼悬浮细胞,研究蓝光和黑暗培养下类黄酮的积累,发现蓝光培养9 d后类黄酮含量增长了0.77 mg/g。廖斌等[33]研究不同光照条件对生物反应器中龙眼悬浮细胞生长及柯里拉京代谢合成的影响,结果表明黑暗条件利于龙眼胚性悬浮细胞生长及细胞内柯里拉京的积累,培养液pH和溶氧是龙眼胚性悬浮细胞生长及柯里拉京合成的重要调控因子。崔彤彤[34]研究发现不同培养时间、温度和水杨酸（SA）浓度及SA的添加时间对龙眼EC中类黄酮和类胡萝卜素积累具有显著的影响,且在不同温度和SA浓度下培养第30天时龙眼EC中SOD、CAT、POD细胞保护酶活性也发生显著变化。研究表明,基本培养基和植物生长调节剂可影响龙眼EC中类黄酮和类胡萝卜素的积累[35];真菌诱导子种类、诱导时间和浓度影响龙眼EC中多糖的积累,100 mg/L龙眼拟茎点霉诱导子诱导15 d时龙眼EC多糖含量最高,比对照提高了61.34%[36];此外,真菌诱导子的种类、诱导时间和浓度影响龙眼EC中类黄酮、类胡萝卜素和单宁的含量[37]。因此,在龙眼体胚不同发育阶段、培养时间、培养方式、培养基成分、光照条件、植物生长调节剂和真菌诱导子等培养条件与龙眼胚性细胞内代谢物质的积累具有密切的关系。
3 龙眼体胚发生分子调控机制
3.1 龙眼体胚发生蛋白质组学研究
陈春玲等[38]采用IEF和SDS-PAGE技术分析NEC、EC-Ⅰ、EC-Ⅱ、ICpEC、CpEC、GE、pro-CE、CE 8个阶段的差异表达蛋白,在等电点pI差异上,EC、pro-CE阶段分别检测出pI 5.1、pI 5.4和pI 4.4特异蛋白;在蛋白质相对分子量差异上,8个阶段的蛋白质相对分子量分布在6~110 kDa之间,13.9 kDa蛋白是NEC阶段的特异蛋白,分子量为6.2 kDa和6.9 kDa的蛋白质为CE阶段新发现的特异表达蛋白。参照此法,王凤华[39]研究了龙眼体胚发生过程的差异表达蛋白,在胚性愈伤组织、球形胚、鱼雷形胚、子叶形胚、成熟胚阶段分别检测出1、2、6、4、4个阶段特异表达蛋白。李冬梅[26]研究表明,龙眼体胚成熟过程和每个成熟阶段均能检测到特异表达蛋白,龙眼体胚成熟过程蛋白质合成在黑暗+低糖+ABA共同培养条件下最活跃。安娜等[40]研究表明,龙眼体胚发生过程pI 4~5的酸性蛋白逐渐减少,而pI 5~6的酸性蛋白逐渐增加,在体胚成熟阶段,分子量大的蛋白质数量明显减少,而分子量小的蛋白质数量逐渐增多。郭玉琼[41]分析龙眼球形胚低温预培养过程的蛋白质,鉴定了特异表达蛋白LLT1、LLT2、LLT3、LLT4;何园[42]在龙眼子叶胚成熟过程中鉴定出29个差异表达蛋白,涉及蛋白质合成、能量和糖类代谢、胁迫应答和抗氧化等过程的相关蛋白;赖呈纯[43]进行龙眼体胚发生早期蛋白质组学研究,获得148个差异表达的蛋白质,最终从118个差异蛋白质的质谱鉴定中鉴定出45个差异表达蛋白质;方智振[44]在龙眼体胚发生中期蛋白质组学研究中发现,蛋白质的种类随着龙眼体胚的发育进程逐渐减少,从76个差异表达蛋白质中选取66个进行质谱分析,共鉴定出35个差异表达蛋白质,其中51%的蛋白质都涉及代谢途径,说明龙眼体胚发生中期蛋白质的代谢比较活跃;随着体细胞胚的发育,细胞不断分化,体细胞胚中表达的蛋白种类减少,氧化胁迫相关蛋白、RAN2和GTPase ObgE与龙眼体细胞胚发生的调控有关[45];李然等[46]研究表明,龙眼EC生长过程蛋白质点数总体升高,pI介于4~7,蛋白分子量介于14~97 kDa,30~66 kDa的蛋白质在龙眼EC生长过程具有相对较高的表达量。因此,基于双向电泳技术的蛋白质组学研究,揭示了龙眼体胚发生过程的差异表达蛋白质,共鉴定了162个差异表达蛋白质,分析了差异表达蛋白所涉及的相关代谢过程,说明差异表达蛋白参与龙眼体胚发生过程的调控。
虽然前期研究已经鉴定了部分与体胚发生相关的蛋白,揭示了它们在龙眼体胚发生过程的潜在调控作用,但所鉴定的蛋白质数量有限,无法全面挖掘差异表达蛋白在龙眼体胚发生过程的调控网络。因此,陈裕坤[47]进行了iTRAQ标记的龙眼体胚发生早期蛋白质组学测序分析,在NEC、EC、ICpEC、GE 4个阶段中共鉴定了5035个蛋白质,代谢途径与次级代谢物的合成是所鉴定蛋白质主要富集的KEGG代谢通路;在NEC与EC、ICpEC、GE成对比较中分别鉴定出82、78、103个差异表达蛋白质,在EC与ICpEC、GE成对比较中分别鉴定了73、160个差异表达蛋白质,在ICpEC_与GE成对比较中鉴定了116个差异表达蛋白质;龙眼体胚发生早期阶段差异表达的LEC1-like、几丁质酶CHI5/-4、阿拉伯半乳聚糖AGP8和糖蛋白EP1等蛋白可能对体胚发育早期具有调控作用;同时,糖类与能量代谢相关蛋白质在龙眼体胚发生早期的差异性表达极为显著,糖酵解、酒精发酵、戊糖磷酸途径、三羧酸循环的差异表达蛋白质在球形胚阶段基本都表现出显著上调的趋势,糖类与能量代谢相关蛋白质可能参与龙眼体胚发生早期的调控。生长素、脱落酸和赤霉素等激素相关蛋白,胁迫应答蛋白CAT、POD、APX、GPX等,脂质代谢、蛋白质代谢、以及细胞骨架结构相关蛋白在龙眼体胚发生早期均发生显著的差异表达,可能与龙眼体胚发生和体胚早期的发育有着密切的关系。基于iTRAQ技术的龙眼体胚发生早期蛋白质组高能量测序分析,鉴定出的蛋白质数量远高于之前的研究,也能更精确地获得不同发育阶段间蛋白质的变化,从蛋白质水平解析龙眼体胚发生早期的分子调控机制。
3.2 龙眼体胚发生全转录组学研究
Lai等[48]对龙眼胚性愈伤组织进行Solexa测序分析,在龙眼胚性愈伤组织中共有17 306个基因,共涉及199个KEGG途径,其中基因序列长度高于1000 bp的体胚发生相关基因有328个,对所筛选的23个基因在体胚发生过程的表达分析表明,候选基因在龙眼体胚发生过程差异表达,差异表达基因是龙眼体胚发生的潜在调控因子。虽然从龙眼胚性愈伤组织转录组测序中挖掘了一些体胚发生相关基因,但未能阐明体胚发生过程差异表达或发育阶段特异表达基因及其代谢途径等调控作用,龙眼体胚发生过程分子调控网络还有待构建。因此,Chen等[49]开展了龙眼体胚发生早期转录组分析,获得大量差异表达基因,初步构建了龙眼体胚发生早期的分子调控网络;转录组分析发现,生长素和细胞分裂素等激素信号途径在龙眼体胚发生过程的重要调控作用,类黄酮主要在非胚性愈伤组织中富集,而脂肪酸则主要富集在体胚发生早期,胚性愈伤组织中表达最高,随后略有降低;LTP、CHI、GLP、AGP、EP1等胞外蛋白编码基因、DNA复制和细胞周期相关基因在龙眼体胚发生早期差异表达显著,可能与龙眼体胚发生具有密切的关系;将龙眼体胚发生早期转录组与龙眼9个组织部位转录组联合分析,发现LEC1、L1L、PDF1.3、GH3.6、AGL80、PIN1、BBM、WOX9、WOX2、ABI3、FUS3、LEC2等27个基因仅在EC、ICpEC、GE阶段表达量极高,在NEC阶段表达量极低或不表达,可作为龙眼体胚发生早期的分子标记基因;此外,还鉴定了LEA5、CNOT3、DC2.15、PR1-1、NsLTP2等28个在NEC阶段特异表达的分子标记基因,这些发育阶段特异表达的分子标记基因可能是龙眼体胚发生的关键调控因子。在龙眼EC和体胚发生早期转录组测序基础上,该实验室还开展了不同光质、5-氮胞苷（5-azac）处理的转录组测序分析。Li等[31]研究了蓝光、白光处理下龙眼胚性愈伤组织中功能性代谢产物积累的转录组学,初步构建了影响龙眼功能性代谢产物的蓝光信号网络：在黑暗+蓝光和黑暗+白光中分别鉴定出4463和1639个差异表达基因,基于次级代谢图谱分析发现,差异表达基因主要富集在“莽草酸途径”“苯丙烷类化合物途径”“单酚途径”“木质素和木脂素类途径”“类黄酮途径”;差异基因成对比较也说明了蓝光比白光更显著地影响龙眼EC代谢途径和其它过程;同时,PIF4、AFR、MYC2是龙眼EC中受光照影响最为显著的转录因子。陈荣珠[50]研究了5-氮胞苷处理的龙眼EC转录组测序,共获得1617个差异表达基因,其主要富集在植物病原互作、植物激素信号转导、植物MAPK信号通路、淀粉和糖代谢及丁酸盐代谢等通路;5-氮胞苷处理可降低龙眼的DNA甲基化水平,促进龙眼体胚发生相关基因（FUS3、ABI3、FT1、GABA-T3、CAS、GLP等）和AGO4基因的表达,从而促进龙眼早期体胚发生。
Lin等[51]进行了龙眼体胚发生过程miRNA组学分析,鉴定了643个保守miRNA和29个新的miRNA,从其中272个miRNA预测出2063个靶基因,龙眼体胚发生过程qRT-PCR表明dlo- miR156家族及dlo-miR166c*与龙眼体胚早期的发育关系密切,dlo-miR26、dlo-miR160a、dlo-miR159等可能参与心形胚和鱼雷形胚的形态建成,dlo-miR4a、dlo-miR24、dlo-miR167a、dlo-miR168a*等小RNA可能参与子叶胚发育过程的调控,其中dlo-miR167a、dlo-miR808、dlo-miR5077可能是胚胎成熟所必需的基因。Xu等[52]对龙眼体胚发生早期进行miRNA测序,从106个不同的miRNA家族和1087个新miRNA中共鉴定出289个已知miRNA,这些已知的miRNA集中在GE阶段表达;许多miRNA在EC、ICpEC、GE阶段大量且特异性地表达,一些miRNA及其预测的靶基因主要富集在木质素代谢途径;通过RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增进一步明确了dlo-miR166a- 3p和DlHD-zip8、dlo-miR397a和DlLAC7、dlo-miR408-3p和DlLAC12之间存在相互调控的关系。Li等[53]对不同光质处理的龙眼EC进行miRNA测序分析,从30个miRNA家族中鉴定111个miRNA,miRNA靶基因KEGG富集分析表明,光对龙眼功能性代谢产物的合成涉及植物激素信号转导、MAPK信号转导等多种响应途径;此外,miR171D_1、miR394a、miR396b-5p、miR5139可能参与蓝光处理下胚性愈伤组织中功能性代谢产物的代谢过程,miR171D_1、miR319e、miR394a、miR395b_2、miR396e可能参与白光处理下胚性愈伤组织中功能性代谢产物的代谢过程;miR171f_3、miR390e、miR396b-5p通过分别靶定DELLA、BRI1、EBF1/2与EIN3基因参与蓝光信号途径,进而调控龙眼胚性愈伤组织中功能代谢产物的累积。
长链非编码RNA（lncRNAs）参与可变剪切、转录干扰、DNA甲基化调控和蛋白修饰等过程,在基因转录、翻译和表观遗传等水平上发挥重要的调控作用。为探究lncRNAs在龙眼体胚发生过程所发挥的调控作用,Chen等[54]开展了龙眼体胚发生早期lncRNA高通量测序分析,共鉴定6005个表达的lncRNA,其中4790个在3个阶段均有表达,在EC、ICpEC、GE阶段特异表达的lncRNA分别有160、154、376个,结合不同阶段差异lncRNA成对比较,说明龙眼GE的形成可能需要大量的lncRNA来启动;对体胚发生早期表达的6005个lncRNA进行注释,1404个lncRNA属于506个非编码RNA家族、4682个lncRNA被预测为靶向蛋白编码基因,其中靶基因包括顺式调控靶基因5051个（5712对）,反式调控靶基因1605个（3618对）;KEGG分析发现,龙眼体胚发生早期lncRNAs的差异表达靶基因主要参与“植物- 病原体互作”和“植物激素信号”通路中;在lncRNA-miRNA-mRNA关系预测中,40个lncRNA被预测为15个miRNA的内源miRNA诱捕靶标（eTMs）,7个lncRNA被鉴定为潜在的miRNA前体,并且通过miR172a、miR159a.1和miR398a的瞬时表达证实了lncRNA-miRNA- mRNA之间的调控关系;因此,lncRNA作为miRNA的eTMs可能是龙眼早期SE的重要调控机制。
3.3 龙眼体胚发生过程DNA甲基化研究
植物体胚发生过程伴随着DNA甲基化水平的变化,DNA甲基化水平对植物体胚发生过程具有重要的调控作用。研究表明,DNA甲基化水平影响植物的体胚发生,在柑橘中具体胚发生能力的愈伤组织比无体胚发生能力的愈伤组织的DNA甲基化水平更低[55],刺五加中胚性愈伤组织比非胚性愈伤组织的DNA甲基化水平也更低[56],蒺藜苜蓿中体胚发生依赖一定程度的DNA甲基化水平,去甲基化试剂5-氮胞苷处理会阻止其体细胞胚的产生从而影响植株的再生能力[57]。近年来,龙眼体胚发生过程DNA甲基化相关的研究得到了比较深入的研究。Argonaute蛋白（AGO）是miRNA加工合成途径中的关键蛋白,参与介导DNA的甲基化过程。杨曼曼[58]从龙眼EC中克隆了AGO家族4个成员DlAGO1、DlAGO2、DlAGO5、DlAGO6的cDNA全长序列,结合其在龙眼体胚发生过程和不同组织部位中的表达模式分析,初步探究了AGO家族可能参与龙眼体胚发生过程及其它生长发育过程的调控[59,60]。陈荣珠[50]进行了龙眼AGO家族的10个成员的全基因组鉴定,分别分布于第1、4、8、10、12、13、14和15号染色体,并对DlAGO4[61]、DlAGO7、DlAGO10[62]和DlAGOMEL1进行克隆与表达模式分析、启动子功能研究,说明其可能参与调控龙眼体胚发生过程;此外,5-azac结合2,4-D处理龙眼EC有利于球形胚的产生,低浓度5-azac处理促进DlAGO4的表达。5-azac处理龙眼EC的转录组分析,揭示了龙眼DNA甲基化水平的降低促进体胚发生相关基因和DlAGO4的上调表达,从而促进龙眼体胚发生。陈晓慧[63]从龙眼EC
中克隆lmiRNA介导甲基化通路中的关键因子Dicer-like（DCL）的4个成员DlDCL1-4及其启动子,实时荧光定量分析表明,一定浓度5-azac处理后DlDCL3和DlDCL4的表达量下降,而DlDCL1在0.3 μmol/L 5-azac,DlDCL2在0.5 μmol/L 5-azac处理时表达量最大,说明DlDCLs不同成员均能响应5-azac处理[64,65]。白玉[66]从龙眼EC克隆lmiRNA介导甲基化通路中的关键因子DlDRM1[67]和DlDRM2的克隆与表达分析,推测龙眼愈伤非胚性与胚性的转化可能与DlDRM1基因的表达有关,而DlDRM2在ICpEC中的调控作用最为显著,5-azac可能通过促进DlDRM1表达,抑制DlDRM2的表达,从而参与龙眼体胚发生过程的调控。
Chen等[68]在龙眼基因组数据库鉴定了龙眼DNA甲基化相关基因,利用全基因组亚硫酸氢盐测序技术（BS-Seq）绘制龙眼EC、ICpE、GE 3个阶段基因组中单碱基分辨率的胞嘧啶甲基化图谱,显示龙眼体胚发生早期中EC、ICpEC和GE整体5 mC水平分别为24.59%、19.65%和19.74%,表明龙眼体胚早期是一个DNA甲基化降低的过程,在ICpEC阶段DNA甲基化水平最低,随后在形成GE时甲基化水平又有所增加,说明细胞从无组织状态的EC转变呈有形态结构的ICpEC过程中甲基化水平降低;龙眼体胚发生甲基化程度不同的主要原因是大量CHH位点甲基化的获得或丢失造成的;对CHH-DMRs相关基因GO富集分析表明,DNA甲基化可能在影响体胚发生过程中的DNA整合、核酸结合、蛋白转运等方面发挥着重要作用;此外,5-azac处理龙眼EC可促进其体胚发生。
3.4 龙眼体胚发生相关基因克隆与表达分析、全基因组鉴定和功能研究
植物体胚发生和发育过程涉及大量特异基因的选择性表达[6]。王凤华等[69]采用DDRT法首次从龙眼体胚中分离获得5条cDNA片段,实时荧光定量分析表明同甜椒和番茄APX同源的基因片段longan1在胚性愈伤组织和球形胚阶段特异表达。随后,研究人员进行了龙眼胚性培养物中体胚发生相关基因克隆及其表达分析的研究：如细胞周期调节基因CDC48[70];Adh、CAT、POD、APX、GPX等抗氧化相关基因,SOD家族20个成员及其中6个成员的启动子[71],谷胱甘肽代谢γ-ECS、GSHS、GR、GPX、GST基因[72];胚性相关基因SERK1、LEC1、AGL15、14-3-3、CHI-I、CHI-III及其启动子[73],WUS、CLV1、CLV2、CRN[74];激素代谢与信号转导途径TIR1、ABP1、ARF1、ACS、ACO、ETR1、ERS基因[75],ARF家族7个成员[76],生长素受体基因TIR1及其启动子[77,78];能量代谢相关基因ATP β subunit、TPI[43];细胞程序性死亡相关基因CP、COX Vb和Caspase[79];WRKY家族10个成员[80],NBS- LRR家族46个成员[81];DlRemorin1-5[82]、DlGRAS4和DlGRAS54[83]等体胚发生过程差异表达基因,以及43个开花时间相关基因[47];此外,方智振[44]克隆了Ran家族31条全长cDNA,并研究Ran的3'端转录多态性、可变剪接体及其在体胚发生过程的表达分析[84,85],克隆了Ran3A、Ran3B启动子[86];Tian等[87,88]研究了DlRan3A和DlRan3B表达模式及其启动子的功能;Chen等[89]研究发现,种子特异表达基因DlMFT在龙眼体胚发生和合子胚发育过程中表达量显著上升,可能具有促进胚胎发育的作用,而在种子发育过程中表达量显著下降可能具有抑制种子萌发的功能。Lin等[90]对龙眼体胚发生过程及不同培养条件下多内参基因的筛选,为龙眼体胚发生过程、不同组织部位、外源激素处理等条件下基因的表达调控模式分析和基因功能研究奠定了基础。
自2017年首次完成龙眼全基因组测序[9]以来,龙眼基因家族的全基因组鉴定与表达分析得到了大量的研究,如ERF基因家族108个成员[91]、AP2/ERF超家族125个成员[92]、Sm基因家族29个成员[93]、Hsf基因家族[94]、GRF基因家族[95]、龙眼HDAC基因家族[96]、BRI家族[97]、漆酶家族成员[98]、Aquaporin基因家族[99]、纤维素合成酶CESA基因家族[100]、SDG基因家族[101]、RNA甲基化相关基因[102]、类受体蛋白激酶CRK家族[103]、MSIL基因家族[104]、4CL基因家族[105]、HD-Zip基因家族[106]等。基于龙眼基因组数据库,龙眼基因家族成员的鉴定及其表达分析得到了广泛的研究,完善了龙眼体胚发生的分子调控网络,为龙眼体胚发生相关基因的功能研究奠定了基础。
林玉玲[107]研究了龙眼体胚发生过程miRNA的表达调控机制,发现在体胚发生过程差异表达的miRNA可能通过与靶基因SOD家族的调控作用,从而影响龙眼体胚发生过程。Lin等[108]进行了龙眼体胚发生过程miRNA内参基因的筛选,为龙眼体胚发生过程miRNA的表达调控机制及其功能研究奠定基础。王亚婷[109]克隆dlo- miR156a-1、dlo-miR156a-2、dlo-miR166a、dlo- miR397a初级体及其靶基因laccase、β-tubulin,分析dlo-miR156a、dlo-miR166a、dlo-miR397a及靶基因β-tubulin表达模式。林丽霞[76]研究表明dlo-miR160负调控ARF10、ARF16、ARF17,dlo-miR167负调控ARF6和ARF8,dlo-miR390负调控TAS3,TAS3负调控ARF3、ARF4。Lin等[110]研究表明dlo-miR160a、dlo-miR160a、dlo-miR160d分别在鱼雷型胚、球形胚和子叶形胚阶段表达量出现峰值,可能对龙眼体胚发生中期和晚期阶段具有调控作用;eTM-miR160-ARF10/16/17在体胚发生过程中起潜在调控作用,所鉴定的4个miR160的eTM,有2个对miR160a与靶基因的结合可能具有破坏作用,并参与生长素和脱落酸信号转导途径。Lin等[111]研究了eTM-miR167- ARF6/8在龙眼体胚发生过程的功能,所鉴定的2个miR167的eTM在球形胚阶段表达量最大,但在不完全胚性紧实结构和鱼雷型胚阶段几乎不表达;龙眼体胚发生后期,eTM可能通过裂解靶基因ARF8从而对dlo-miR167的表达起负调控作用。TIR1与dlo-miR393互作关系研究发现,dlo- miR393可能通过抑制TIR1-3的转录进而影响龙眼体胚发生过程[78]。同时,研究人员对龙眼microRNA分子特性及其表达模式进行了分析,如miR403[112]、miR395[113]、miR166家族成员[114]、miR397家族成员[115]、miR159家族成员[116]、miR171家族成员[117]、miR172家族成员[118]等;张清林等[119]克隆了龙眼体胚发生早期miR166的初级体并进行表达分析;苏立遥等研究了miR403及其候选靶标对外源激素的响应模式以及在龙眼体胚中的表达模式[120]、eTM和microRNA319及其调控靶标在龙眼体胚发生早期的表达模式[121]。此外,Zhang等[122]研究了龙眼miR166的结构和龙眼体胚发生过程的表达模式及功能,发现miR166与ATHB15在龙眼体胚发生早期呈负调控关系,高水平表达miR166a.2可能有利于维持疏松的龙眼愈伤组织,而高水平表达ATHB15有利于球形胚的形成。
李汉生[123]在龙眼EC过表达和抑制表达miR390e,发现miR390e能够剪切DlBRI1-3从而抑制DlBRI1-3的转录,影响龙眼功能性代谢产物的合成。陈裕坤[47]将DlMFT、DlTFL1、DlSHR异源表达于本氏烟,发现龙眼DlMFT能抑制种子的萌发但不影响植物的开花时间,龙眼DlTFL1具有调控植物开花时间的功能;DlSHR不仅影响转基因植株的根系辐射状分布,还会影响植物的生长发育过程,如出现生长较慢、开花推迟、根少且粗大、根光滑几乎无毛、叶和茎部出现一定程度的扭曲、叶表皮毛粗大等表型;qRT-PCR表明过表达DlSHR植株中根辐射状基因SCR及赤霉素相关的GAI基因表达极显著增加,DlSHR可能通过控制SCR和GAI等下游基因的表达影响根系的结构及叶片形态。
4 龙眼胚性愈伤组织受体系统的遗传转化研究
龙眼遗传转化研究已经开展了近20年,但相关研究进展缓慢。陈裕坤等[124]和田奇琳[125]采用根癌农杆菌侵染龙眼实生幼苗去顶和去顶芽部位获得阳性转基因植株。但是,以龙眼胚性愈伤组织为受体材料的转基因研究目前还未能成功获得完整的转基因龙眼植株;曾黎辉[126]利用发根农杆菌侵染龙眼1月龄成熟胚和无菌初生苗,诱导出毛状根后再培养得到3株转基因植株,但转基因植株的表型出现异常。通过组织、细胞形态学研究发现,龙眼胚性愈伤组织的体胚发生主要为单细胞内起源,这可能造成外源基因转化至胚性细胞中的效率较低[22]。因此,很有必要对龙眼体胚不同发育阶段的受体材料进行筛选,并对其遗传转化方法进行优化。赖钟雄[127]采用基因枪转化法将PBI121质粒转化至龙眼胚性细胞中,获得Kan抗性细胞,经GUS检测表明gus基因已经整合至龙眼胚性愈伤组织中,抗性细胞接种至分化培养基中获得了胚状体。张妙霞[128]采用根癌农杆菌介导法将PEAS基因导入龙眼胚性愈伤组织中,获得5个龙眼抗性细胞系。郑启发等[129]用金刚沙对液体悬浮培养的胚性愈伤组织进行创伤,结合根癌农杆菌侵染法,将含有AP1和POD基因的质粒导入悬浮培养系细胞中,最终获得转化AP1和POD基因的阳性龙眼胚状体。徐清锋[130]采用根癌农杆菌介导法将ACS反义基因转化龙眼胚性愈伤组织,经GUS染色及PCR检测获得阳性转基因愈伤组织。曾丽兰[131]利用农杆菌介导转化系统将龙眼FSD-pro4转化至龙眼胚性愈伤组织中,经过抗性筛选及PCR鉴定获得阳性转基因愈伤组织。张冬敏[132]利用根癌农杆菌侵染法,将DlWUS瞬时过表达于龙眼EC,并初步验证了龙眼EC过表达DlWUS抑制DlCLV1、DlCLV2、DlCRN的表达。赖瑞联[133]借助脂质体转染剂成功将miR393- agomir及其高效阻断剂miR393-antagomir转化至龙眼胚性愈伤组织中,初步建立了外源miRNA转化龙眼胚性愈伤组织的高效体系。因此,已初步建立起以龙眼胚性愈伤组织为转化系统的转基因方法,但其转化效率、转基因细胞系的体胚发生和植株再生能力等还存在一定的问题,今后在转基因方法和转基因体系优化方面还有待深入研究。
5 展望
龙眼体胚发生不仅是植株体外再生的重要途径之一,还是研究龙眼分子生物学的优良体系,为龙眼分子生物学研究奠定基础和提供良好平台。龙眼体胚发生过程的生理生化变化进一步明确了内源激素代谢与动态平衡对龙眼体胚发生具有重要的作用;研究结果已经表明,不同的培养基成分、不同光质、不同外源添加物和不同培养阶段影响龙眼体胚中功能性代谢物的积累,借助生物反应器初步建立了龙眼胚性细胞的大量培养,将来可应用于龙眼功能性代谢物如龙眼多糖、类黄酮、生物碱等的规模生产。龙眼体胚发生早期和中期的蛋白质组学、全转录组学和DNA甲基化研究,挖掘了大量体胚发生过程差异表达的蛋白质和基因,从mRNA、miRNA、lncRNA、蛋白质和DNA甲基化水平分析了龙眼体胚发生的分子机制;破译龙眼基因组为龙眼体胚发生的分子机制研究搭建了重要的基因组信息平台,体胚发生相关基因克隆、基因家族的全基因组鉴定与表达分析,进一步丰富了龙眼体胚发生的分子机制。但龙眼体胚发生中期至体胚成熟期的分子调控网络有待完善,龙眼体胚发生的表观调控网络有待于进一步解析,龙眼体胚发生过程的代谢组学、cirRNA、单细胞测序、空间转录组测序和染色体外环状DNA（eccDNA）等研究还有待开展（单细胞测序、空间转录组测序等部分工作正在进行中）。龙眼体胚发生相关基因的功能研究目前还比较依赖于异源表达模式植物,在龙眼胚性愈伤组织上的转化以瞬时表达为主,将来可通过优化龙眼体胚转化方法,将龙眼体胚发生过程显著差异表达或阶段特异性表达的基因转化至胚性愈伤组织中,获得过表达与突变体细胞系或株系,可进一步揭示体胚发生关键基因在龙眼体胚发生过程的功能及其调控机制。最近,我们实验室采用PacBio Sequel又完成了‘红核子’龙眼基因组三代测序（待发表）,基因组序列原始草图长度0.49 Gb,初步组装的ContigN50达到5.71 Mb,共327条Contigs。利用Hi-C技术进一步辅助基因组组装至染色体水平,通过对Contigs进行排序,最终构建成15条Superscaffolds（包含300条Contigs）,总长0.45 Gbp,Contigs N50为4.4 Mb,Superscaffold N50为27.7 Mb,占原始基因组长度的91.69%;随后对其全基因组构建互作图谱,符合互作规律,表明该物种Hi-C辅助组装结果良好。同时,进一步利用Hi-C技术研究龙眼体胚发生早期染色质三维结构,发现在胚性愈伤组织（EC）分化发育成球形胚（GE）过程中,其三维染色质结构发生了大规模重组;从EC分化到不完全胚性紧实结构（ICpEC）过程,染色质结构变得更加致密,B Compartment之间的互作增强,同时该区域的开放性增强,A Compartment染色质间互作减弱。龙眼基因组三代测序提供了更加完整和全面的基因组信息,为进一步揭示龙眼体胚发生的分子机制提供了强有力的技术平台,特别是龙眼体胚发生过程的Hi-C测序,揭示了龙眼体胚发生过程的基因组动态变化规律,对于揭示植物早期体胚发生的分子机制,提供了新的线索。