随着畜牧业的发展,大量抗生素被用来预防、治疗畜禽疾病,以及促进动物生长。2013年,我国用于畜禽养殖业的抗生素使用量约为8.5 t[1]。研究表明,畜禽摄入的一部分抗生素会在生物体内蓄积,并通过食物链传递到人类,25%~75%的抗生素以原药的形式随畜禽粪便排出体外[2,3,4]。土霉素作为水产及畜禽养殖中使用最广泛的广谱抗生素,由于其半衰期长、不易降解、在动物体内代谢较慢等特点导致土霉素在环境中残留浓度较高。王冉等[5]经调查研究后发现,我国施肥后的土壤表层抗生素含量较高,土霉素含量达200 mg/kg。土壤中的土霉素经地表径流、雨水淋滤等过程进一步污染地表水和地下水。
抗生素的滥用不仅对施药动物产生不利影响[6],自然水体和土壤动物[7,8]、微生物[9,10]以及陆生[10,11]、水生植物[12]在抗生素胁迫下都会受到一定影响。王盼亮等[13]采用水培试验研究四环素类抗生素对小白菜幼苗生长的毒性效应发现,当抗生素暴露浓度为16 mg/L时,抗生素对小白菜种子的芽伸长表现出促进作用,同时抑制其根伸长。而Pan等[14]发现黄瓜、西红柿、生菜和胡萝卜种子根伸长和芽伸长抑制强度均随抗生素浓度升高而增强,徐秋桐等[15]也得出了相似的结论。说明不同试验结论之间差异性较大。
作为一种多孔、高度疏水且比表面积巨大的吸附剂,生物质炭已经广泛运用于增强土壤肥力、控制环境污染物（抗生素、农药、重金属）运移以及调控土壤理化性质当中[16,17]。生物质炭中可溶于水的组分称作溶解性黑炭,约占淡水环境中溶解性有机物含量的10.6%[18],具有很强的环境迁移能力。生物质炭施用于土壤后,短期内势必会引起局部土壤中溶解性有机物（DOM）含量的增多。研究表明,DOM对抗生素有一定的吸附作用[19],进而减轻抗生素对土壤植物的生态毒性。Albero等[20]研究了施肥条件下7种兽药抗生素在土壤中的生物有效性后发现,对比未施肥土壤,施肥增强了土壤对抗生素的吸附能力,降低了抗生素在土壤中的生物有效性。前人研究大多侧重于DOM对土壤、活性炭、生物质炭吸附环境污染物的影响[21],有关DOM对抗生素生物毒性影响方面的研究报道尚不多见。为此,本研究以小白菜为受试生物,分别在水溶液和土壤介质中研究了DOM对土霉素生物毒性的影响,探究了DOM修复抗生素污染的可行性,旨在评价生物质炭作为土壤改良剂可能引起的生态毒性,为抗生素污染防治提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
供试作物为‘揭农三号’甜白菜（Brassica rapa var. glabra）,由保丰种子商行培育。试验前先由H2O2浸泡消毒,去除杂物和发育不良的种子后备用。
供试抗生素为土霉素,纯度为98%,购自Adamas-beta公司。
供试土壤采自海南大学热带农林学院基地,为无污染源农田0~20 cm的海南热带砖红壤。土壤pH 5.31,含水率为15.6 g/kg,有机质含量为2.98 g/kg,全氮、全钾、全磷含量分别为4.21%,0.76%和0.15%。供试土壤无土霉素检出。自然风干后研磨,过2 mm筛备用。
为充分资源化利用海南省热带农业废弃物,使其产生环境、经济和社会效益,达到“以废治废”的目的,选用木薯渣作为制备生物质炭的原材料。木薯渣经自然风干后粉碎,限氧条件下在马弗炉中以200 ℃预炭化2 h后,将温度分别上升至350 ℃、500 ℃、650 ℃,炭化3 h,待自然冷却至室温后取出,制得3种木薯渣生物质炭。根据生物质炭热解温度分别标记为MS350、MS500和MS650,过100目尼龙筛,置于干燥密封玻璃罐保存。将过100目筛后的木薯渣生物质炭和超纯水按照1∶50（g/mL）的固液比混合置于锥形瓶内,密封。于25 ℃,200 r/min的条件下振荡24 h。取上清液过0.45 μm水系滤膜所得溶液为DOM。根据生物质炭的制备温度将提取的DOM分别标记为DOM350、DOM500、DOM650。提取得到的DOM放置于4 ℃冰箱密封避光保存。贮存时间不超过2周。
1.2 方法
1.2.1 水培实验 实验共分为4组：（1）空白对照;（2）添加土霉素（添加浓度为10、20、30、40、50 mg/L）;（3）添加3种不同温度下制备的DOM（DOM350、DOM500、DOM650。DOM添加浓度分别为10、25、50 mg/L）;（4）土霉素与DOM共同作用（土霉素浓度设定为30 mg/L,DOM添加浓度分别为10、25、50 mg/L）。空白对照组添加10 mL的去离子水。在直径为90 mm的玻璃培养皿中放入2层定性滤纸,将小白菜种子均匀放置在滤纸上,每皿20粒,保持种子培根末端与生长方向呈一直线,盖好培养皿,每个处理设置3个平行,在25 ℃下避光培养7 d,定期补充培养皿内水分。
1.2.2 土培实验 称取50 g土壤样品于90 mm的硬质玻璃培养皿内。实验共分为4组：(1)空白对照;(2)添加土霉素（浓度分别为0、2、10、20、60、100 mg/kg）;(3)添加3种不同温度制备的DOM（DOM350、DOM500、DOM650。DOM添加浓度分别为10、25、50 mg/L）;(4)土霉素与DOM共同作用（土霉素的添加浓度为0、2、10、20、60、100 mg/kg。添加DOM浓度分别为10、25、50 mg/L）。每个处理3个平行,并用恒重法的方式保持土壤的最大持水量的60%,稳定48 h后在每个培养皿内加入20粒种子。放入人工气候培养箱中于25 ℃暗处培养,观察种子发芽率并每天记录,观察至第7天结束。
1.2.3 测定指标 测定指标包括小白菜发芽率、根伸长、芽伸长长度。试验结束后,计算平均值、抑制率及标准偏差,并以浓度-抑制率绘制曲线进行拟合并绘图。
发芽率=发芽种子数/供试种子总粒数× 100%
根伸长抑制率=[(对照种子平均根长-处理种子平均根长)/对照种子平均根长]×100%
芽伸长抑制率=[(对照种子平均芽长-处理种子平均芽长)/对照种子平均芽长]×100%
1.3 数据处理
采用Excel软件和SPSS 22软件进行数据统计分析以及图表绘制。采用单因素方差分析比较不同处理对小白菜种子发芽率、根伸长和芽伸长抑制率的影响;采用Duncan法进行多重比较。
2 结果与讨论
2.1 不同浓度土霉素对小白菜发芽率的影响
由图1A可知,水溶液培养条件下小白菜种子萌发受土霉素影响较小。除土霉素添加浓度为50 mg/L与其他处理发芽率差距较大以外,其他处理中小白菜种子发芽率基本相同（P<0.05）,发芽率趋势趋于平缓。说明种子发芽率不宜作为反映土霉素生理毒性的指标。
根据预实验种子发芽情况可知,播种后种子在第3天开始发芽,因此统计发芽率从第3天开始。根据前人研究可知种子的发芽率观察一般是开始于48 h之后[22]。由图1B可知,向土壤添加浓度小于10 mg/kg的土霉素溶液对小白菜种子发芽具有轻微的促进作用;而当土壤中土霉素浓度高于20 mg/kg时,种子发芽率明显被抑制（P<0.05）。这是由于土霉素在土壤中浓度太高以至于超过了种子萌发耐受极限,导致小白菜种子发芽率降低[23]。但随着天数的增加,土霉素抑制发芽率的效应逐渐减弱。这是因为土壤具有一定的自净作用。土壤吸附土霉素的量随接触时间的增长而增加;未被吸附的部分土霉素被降解[24,25],土霉素在土壤中的浓度降低,种子的发芽率逐渐趋于平缓。
2.2 不同DOM对小白菜发芽率的影响
土壤培养条件下,添加DOM对小白菜萌发的影响如图2B所示。由图可知,在土壤培养条件下,DOM350会延缓小白菜种子萌发速率,土壤中添加DOM350后,小白菜种子在第三天时发芽率为10.60%,低于加入了DOM500处理组发芽率大约40%。在第7天时种子发芽率为81.30%,略高于CK组。DOM650的处理效果和DOM350没有较大差异,其第3天和第7天种子发芽率均小于DOM500。整体上来看,DOM的加入不同程度地提高了小白菜种子的发芽率,证明DOM在一定程度上可以促进种子发芽（P<0.05）。
2.3 DOM对土霉素胁迫下种子发芽率的影响
由图3可知,在水溶液培养实验过程中,土霉素对小白菜种子萌发的生物毒性不会随添加DOM浓度的升高而发生大幅度的变化,但总体来说都起到不同程度的促进作用（P<0.05）。DOM350对30 mg/L土霉素胁迫下小白菜种子的萌发促进程度为1.66%~6.67%;DOM500对30 mg/L土霉素胁迫下小白菜种子的萌发促进程度为6.67%~10.00%;DOM650对30 mg/L土霉素胁迫下小白菜种子的萌发促进程度为0.00%~ 7.50%。较未添加DOM处理的小白菜种子的发芽情况,DOM会缓解土霉素对小白菜种子的生物毒性。该结论与2.2中DOM对小白菜发芽率的影响实验中得到的结论一致。DOM对土霉素的吸附作用降低了土霉素的生物毒性[28],从而促进了小白菜种子的萌发。这与Song等[29]的研究结论相似。
土培条件下3种DOM溶液在土霉素胁迫下对发芽率影响表现为低浓度促进,高浓度抑制的现象（图4）。研究表明,适量抗生素可刺激土壤微生物活性,进而增强土壤有机炭的矿化,促进植物生长;而抗生素浓度过高会抑制土壤酶和植原体的活性,对植物生长发育造成影响[30]。实验结束后,种子的发芽率已经基本稳定,大约在70%~90%之间。可能是此时DOM已经吸附土壤中的土霉素,而且已经达到稳定的状态[31]。不同土霉素浓度处理下种子发芽率差距较实验前期减少,但过高浓度土霉素还是会对种子发芽率有抑制作用。因此适宜浓度的土霉素则可以小幅度地提高种子发芽率。当实验进行到第7天时,土霉素-DOM650共存体系中小白菜种子的发芽率最低,这可能是因为生物质炭的炭化温度越高,土霉素在土壤中的吸附能力越弱,土霉素在土壤中的吸附量也随之减少,从而影响发芽率[32]（P<0.05）。
2.4 土霉素和DOM对小白菜根伸长胁迫作用
水培条件下3种不同浓度DOM对土霉素胁迫种子根伸长的影响如图5所示,根伸长抑制率与DOM浓度之间的回归方程如表1所示。由图5可知,在水溶液培养条件下,DOM对土霉素胁迫小白菜种子根伸长的影响不明显（<10%）,在实验浓度范围内,3种DOM的浓度越小,DOM对土霉素胁迫小白菜种子根部毒性的缓解作用越强。DOM在水溶液培养条件下对土霉素生物毒性的缓解能力明显低于其在土壤培养条件中的缓解能力。这可能是因为当土霉素进入土壤环境后,土壤颗粒具有的吸附位点对土霉素有一定的吸附作用[33,34],一定程度上阻碍了土霉素在土壤环境中的迁移转化,降低了土霉素的生物毒性。与土壤环境不同,在水溶液培养条件下不存在由于土壤颗粒对土霉素的吸附作用而产生的毒性缓冲作用,小白菜种子的根完全暴露在土霉素溶液当中,根部的生长发育直接受到土霉素的毒性作用。当外源污染物存在于环境中时,根系微生物活性受抑制,营养物质转化受阻,进而导致作物根尖细胞有丝分裂数减少,分裂速度减慢,导致根伸长被抑制。因此,根对土霉素污染的反应更敏感和直接[35,36,37,38]。过高的DOM浓度同样会对植物种子根部生长产生一定的抑制作用。
图5 水培条件下DOM与OTC共同胁迫种子根伸长抑制率Fig. 5 Effect of co-existence OTC and DOM on the inhibition rate of root elongation under hydroponic condition |
表1 DOM对土霉素胁迫下小白菜种子根伸长影响的回归方程Tab. 1 Regression equation for seed root elongation under the effect of DOM and oxytetracycline stress grown in water |
| 样品 Samples | 拟合方程 Regression equation | R2 | P |
|---|---|---|---|
| DOM350 | RI=0.0091X2-0.5427X+72.893 | 0.8045 | P>0.05 |
| DOM500 | RI=0.0129X2-0.6624X+72.433 | 0.7491 | P>0.05 |
| DOM650 | RI=0.0081X2-0.3399X+73.721 | 0.9898 | P<0.01 |
Note: RI presents the inhibition rate of root elongation; X presents the concentration of oxytetracycline. | |
注：RI为根伸长抑制率;X为土霉素浓度。 |
如图6所示,在土壤培养条件下,土霉素浓度为0~20 mg/kg时,小白菜种子根伸长抑制率为负值,说明土霉素在一定浓度区间范围可以促进种子根伸长。当土霉素浓度大于40 mg/kg时,土霉素对小白菜种子根伸长抑制率约为12.94%,对小白菜根部伸长抑制程度随土霉素的浓度升高而增加。3种溶解性有机物缓解了土霉素对小白菜根伸长的抑制作用。土霉素浓度越高,3种溶解性有机物对其生物毒性的缓解能力越强,DOM350、DOM500和DOM650的缓解能力分别为5.00%~27.63%、12.77%~53.13%和2.07%~ 40.30%。由表2根据DOM对土霉素胁迫下小白菜种子根部伸长浓度-抑制率拟合线性方程可知,添加3种生物质炭源DOM均对小白菜根部土霉素耐受能力具有不同程度的增强效果。与不添加DOM的处理对比,在小白菜种子萌发过程加入DOM350,DOM500,DOM650后,根部伸长IC50分别提高了60.17%,146.29%,28.09%。研究表明,DOM对环境中的抗生素、农药等有机污染物具有一定的吸附作用。DOM可以通过π受位点与有机污染物结合,或对土壤、生物质炭等多孔隙吸附剂产生堵孔效应,阻碍了有机污染物的解吸作用[39,40],从而影响有机污染物在环境中的生物有效性[41]。
图6 土培条件下3种不同浓度DOM对土霉素胁迫种子根伸长的影响Fig. 6 Effect of co-existence OTC and DOM on the inhibition rate of root elongation under soil culturing |
表2 DOM对土霉素胁迫下小白菜种子根伸长影响的回归方程和IC50Tab. 2 Regression equation and IC50 for seed root elongation under the effect of DOM and oxytetracycline stress |
| 样品 Samples | 拟合方程 Regression equation | R2 | IC50 | P |
|---|---|---|---|---|
| CK | RI=0.609X-13.330 | 0.8920 | 103.99 | <0.01 |
| DOM350 | RI=0.416X-18.541 | 0.8080 | 164.76 | <0.05 |
| DOM500 | RI=0.259X-24.369 | 0.8756 | 287.14 | <0.01 |
| DOM650 | RI=0.508X-17.668 | 0.8560 | 133.20 | <0.01 |
Note: RI presents the inhibition rate of root elongation; X presents the concentration of oxytetracycline. | |
注：RI为根伸长抑制率;X为土霉素浓度。 |
2.5 土霉素和DOM对小白菜芽伸长胁迫作用
DOM大幅度地降低了土霉素对小白菜种子芽伸长的生理毒性（图7）,3种DOM对小白菜种子芽伸长影响的回归方程见表3,拟合程度均大于0.8。随着DOM浓度的增加,小白菜种子芽伸长的抑制率由正转负,说明较高浓度的DOM对小白菜种子芽伸长有较强的促进作用。DOM350、DOM500和DOM650的缓解幅度分别为33.89%~61.92%、25.52%~63.59%和51.87%~ 72.38%。当DOM浓度为10 mg/L时,仅DOM650可消除土霉素对小白菜芽伸长的抑制作用并促进小白菜芽伸长。随着DOM施加浓度的增大,3种DOM均可以消除土霉素对小白菜芽伸长的抑制作用。其中DOM650对小白菜种子芽伸长的促进作用最强。
图7 水培土霉素-DOM共存对小白菜芽伸长胁迫作用Fig. 7 Effect of co-existence OTC and DOM on the inhibition rate of shoot elongation under hydroponic condition |
表3 水溶液培养条件下DOM对土霉素胁迫下小白菜种子芽伸长影响的回归方程Tab. 3 Regression equation for shoot elongation under the stress of DOM and oxytetracycline under hydroponic condition |
| 样品 Samples | 拟合方程 Fitting equation | R2 | P | n |
|---|---|---|---|---|
| DOM350 | RI=-1.1166X+17.975 | 0.8224 | P<0.01 | 12 |
| DOM500 | RI=-1.2036X+22.753 | 0.9302 | P<0.01 | 12 |
| DOM650 | RI=-1.5691X+12.567 | 0.8230 | P<0.01 | 12 |
Note: RI presents the inhibition rate of shoot elongation; X presents the concentration of oxytetracycline. | |
注：RI为芽伸长抑制率;X为土霉素浓度。 |
由图8可知,土壤培养条件下土霉素胁迫下小白菜种子芽伸长抑制率的影响呈低浓度（小于20 mg/kg）促进,高浓度（大于20 mg/kg）抑制的趋势。其趋势与2.4实验中根伸长趋势相一致。当土霉素浓度处于较低水平时,添加DOM会促进种子芽伸长。不仅因为此时种子细胞分裂素增多,芽伸长速度快,也由于DOM吸附了土壤中的土霉素。当土霉素浓度较高时,芽伸长受土霉素抑制,但DOM溶液可以减轻土霉素毒性对种子芽伸长的抑制作用。由表4根据DOM对土霉素胁迫下小白菜种子芽伸长浓度-抑制率拟合线性方程可知,添加3种生物质炭源DOM均对小白菜芽的土霉素耐受能力具有不同程度的增强效果。与不添加DOM的处理对比,在小白菜种子萌发过程加入DOM350,DOM500,DOM650后,芽伸长IC50分别提高了16.69%、114.49%、29.56%。这可能是芽生长过程所需的营养和能量主要来自胚内的养分供应,受外界土壤中土霉素影响不大[42]。
图8 土培土霉素-DOM共存对小白菜种子芽伸长胁迫作用Fig. 8 Effect of co-existence OTC and DOM on the inhibition rate of shoot elongation under soil culturing |
表4 土壤培养条件下DOM对土霉素胁迫下小白菜种子芽伸长影响的回归方程和IC50Tab. 4 Regression equation and IC50 for shoot elongation under the stress of DOM and oxytetracycline under soil culturing |
| 样品 Samples | 拟合方程 Fitting equation | R2 | IC50 | P |
|---|---|---|---|---|
| CK | RI=0.0862X-7.9438 | 0.8825 | 672.20 | P<0.01 |
| DOM350 | RI=0.0808X-13.379 | 0.9340 | 784.39 | P<0.01 |
| DOM500 | RI=0.0461X-16.468 | 0.8466 | 1441.82 | P<0.01 |
| DOM650 | RI=0.0749X-15.232 | 0.8449 | 870.92 | P<0.01 |
Note: RI presents the inhibition rate of shoot elongation; X presents the concentration of oxytetracycline. | |
注：RI为芽伸长抑制率;X为土霉素浓度。 |
3 讨论
根据高等植物的生长情况监测和判断土壤的污染程度,是从生态学角度衡量土壤健康状况,评价土壤质量的重要方法之一[43]。本研究通过观察土霉素、生物质炭源溶解性有机物（DOM）和土霉素-DOM共存体系对小白菜种子萌发、根伸长和芽伸长的影响。研究发现,小白菜种子萌发的发芽率受低浓度土霉素的影响较小,一方面是由于抗生素的生物毒性明显比工业化学品缓和,另一方面是因为在培养前期,种皮起到了阻挡种子胚芽与抗生素直接接触的屏障作用,同时种子发芽所需的营养物质由胚乳提供。当土霉素浓度升高可对小白菜种子萌发产生显著性影响（P< 0.05）,说明高浓度抗生素会对种子萌发产生毒性。
水培条件下,DOM对小白菜芽伸长呈现大幅度的促进作用,并随DOM浓度的升高而增强;而对小白菜根伸长影响较小,低浓度的DOM对受土霉素胁迫的小白菜根部伸长存在促进作用,但随着DOM浓度的升高,DOM对土霉素胁迫小白菜根生长的缓解作用逐渐减弱。在实验浓度范围内,除DOM350、DOM500和DOM650对土霉素胁迫小白菜种子根生长都存在不同程度的促进作用。Tian等[46]研究了DOM输入土壤后对土壤酶活性的影响后发现,不同成分的DOM与土壤酶活性之间相关性不同,结合本实验发现不同DOM浓度对种子根部生长会产生一定的抑制作用,可能是因为DOM350与DOM500、DOM650的组成成分不同,阻碍了土壤中营养物质的转化过程,减慢了小白菜根尖细胞有丝分裂速度,导致根生长受到抑制。DOM对高浓度土霉素毒性有缓解作用。证明适当地施用生物质炭可降低土霉素对小白菜的生物毒性,但施用量不宜过高。