茶园是以茶树种植为主的,人为干扰较大的次生生态系统。随着茶树种植时间的延长,茶园生态系统开始出现退化现象,这种现象的产生,一方面是茶树本身自然衰老,另一方面是茶树连年种植后,土壤环境发生变化,不利于茶树生长的因素积累,土壤自毒作用加剧[1,2,3,4]。王海斌等[5,6,7]研究不同树龄茶树对根际土壤的微生态系统的影响发现,随着茶树树龄的增加,茶树根际土壤酸化程度加剧,自毒潜力升高,根际土壤中的营养循环相关酶活性降低,微生物多样性程度下降,病原菌总量增加,反之益生菌总量下降,茶树的生长受阻,茶叶的品质指标——茶多酚、咖啡碱、茶氨酸呈现下降趋势。Ye等[8,9]探讨不同树龄铁观音茶树的品质差异时也发现,随着茶树树龄的增加,茶树根际土壤的自毒潜力加剧,茶树叶片的品质指标呈现下降趋势,此外其进一步分析发现,随着茶树树龄的增加,酸类物质大量累积。Jia等[10,11]采用SPE-HPLC分析不同树龄茶树根际土壤6种酸类物质含量时发现,随着茶树树龄的增加茶树根际土壤酸类物质积累不断上升;其次,采用GC-MS对不同树龄茶树根际土壤物质进行鉴定也发现,茶树根际土壤中13种物质随着茶树树龄增加显著上升,其中包含9种酸类物质。可见,随着茶树树龄的增加,茶树根际土壤呈现酸化现象,不利于茶树生长的有害物质大量积累,茶树生长受阻。叶片是茶树作为经济作物在制茶过程中的主要原料,茶叶的品质高低决定了茶叶的经济效益与价值。然而,随着茶树树龄的增加茶树生长受阻,是否会对茶叶的品质产生影响,而且影响茶树生长及茶叶品质的物质以哪种类别为主,目前该方面的研究还鲜有报道。据此,本研究以0、3、9、25 a的铁观音茶树根际土壤为材料,采用5种不同极性树脂（ADS-7、ADS-21、ADS-F8、ADS-17、ADS-8）进行吸附并洗脱。土壤洗脱液一方面用于自毒潜力评价,一方面用于处理新种植的茶树并测定茶树叶片内源激素及其氨基酸含量,以此评价不同树龄茶树根际土壤在不同极性树脂吸附洗脱后,洗脱液中物质的自毒潜力及其对茶树生长和品质的影响,以期为茶园土壤退化的修复提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
以铁观音原产地福建省泉州市安溪县龙涓乡为研究地点,收集已种植3、9、25 a的铁观音茶树根际土壤,以未种植铁观音茶树的土壤（0 a）为对照,用于茶树根际土壤物质的提取及不同极性树脂的吸附与洗脱并用于生物测试。取样点位于东经117°93′、北纬24°97′,平均海拔650~ 800 m,年降雨量1800 mm,相对湿度80%左右,年平均气温在16~18 ℃。取样点茶园土壤的基本理化指标为,有机质8.34 g/kg、全氮2.17 g/kg、全磷1.05 g/kg、全钾1.46 g/kg、速效氮25.3 mg/kg、速效磷56.7 mg/kg、速效钾264.6 mg/kg。根际土壤取样,参考Fujii等[12]的方法,随机选择树龄为3、9、25 a的铁观音茶树各100株,去除土壤表层枯枝落叶,挖出茶树,收集茶树根际土壤,样品量约为15 kg,每个样品3个重复,以未种植过铁观音茶树的土壤为对照（0 a）,首先去除地表植被和凋落物后,收集15~25 cm深度的土壤,多点随机收集,样品量约为15 kg,每个样品3个重复。
1.2 方法
1.2.1 不同极性树脂洗脱液的生物测试 将收集的土壤置于阴凉处自然风干,研磨,过40目筛。分别称取不同树龄茶树根际土壤及对照土壤各5 kg,加入20 L蒸馏水,360 W下超声提取1 h（期间每隔10 min均匀搅拌1次）,其后以120 r/min速率振荡1 h,重复5次,过滤,收集提取液并于45 ℃条件下旋转蒸发浓缩至5 L,使每毫升浸提液含有1 g土壤物质[13]。
将不同极性的树脂（ADS-7、ADS-21、ADS- F8、ADS-17、ADS-8均购自天津南开合成科技有限公司）用100%的乙醇浸泡24 h活化,用蒸馏水浸泡并清洗至没有乙醇。取茶树根际土壤提取浓缩液5 L,分成5组,每组1 L,分别采用5种不同极性树脂进行静态吸附。具体操作如下：将200 g树脂加入1 L提取浓缩液中,将其置于摇床上120 r/min,振荡吸附24 h,去除上清液,加入600 mL甲醇并将其置于摇床上120 r/min,洗脱12 h,将收集的甲醇洗脱液过滤并浓缩至200 mL。
生物测试：取直径为9 cm的培养皿,垫上一层滤纸,将不同极性树脂吸附后的洗脱液5 mL分别均匀地添加到滤纸上,以添加5 mL甲醇的培养皿为对照,将培养皿置于通风橱中,待有机溶剂挥发干后,每个培养皿分别添加5 mL无菌蒸馏水,然后分别播入10粒预萌发的莴苣,3次重复,置于人工气候箱中。培养温度为25 ℃,每天光照12 h（7：00~19：00）,培养3 d后测定其干重。不同树脂洗脱液对受体莴苣的影响采用相对抑制率（inhibition rate,IR）来评价,计算公式为,IR = (1–处理值/对照值)×100%。
1.2.2 茶树种植,外源添加不同极性树脂洗脱液 分别取不同年限茶树根际土壤经不同极性树脂（ADS-7、ADS-21、ADS-F8、ADS-17、ADS-8）吸附后的洗脱液50 mL,于45 ℃条件下旋转蒸发浓缩至10 mL,然后加无菌蒸馏水定容至2 L,于-20 ℃保存备用。
将未种植过茶树的土壤风干并研磨、过40目筛;土壤的基本理化指标为,有机质9.02 g/kg、全氮1.03 g/kg、全磷0.56 g/kg、全钾1.85 g/kg、速效氮89.46 mg/kg、速效磷15.28 mg/kg、速效钾179.62 mg/kg。将研磨后的土壤装入盆中,每盆10 kg,选择一年生长势相对一致的铁观音茶苗,分别移栽到盆中,每盆6株;茶苗移栽恢复生长30 d后,将茶苗种植土壤适当搅动使土壤松动,将配置好的树脂洗脱液缓慢倒入盆中土壤,尽量使处理液在土壤中分布均匀,每盆添加量2 L。常规种植茶树60 d,收集茶树植株倒二叶用于茶树叶片内源激素及氨基酸含量测定,每种处理种植3盆,即3个重复。
1.2.3 茶树叶片内源激素含量测定 取茶树叶片鲜叶1 g,加入5 mL 80%甲醇和1 mmol/L 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚冷却缓冲液研磨萃取,匀浆于4 ℃放置4 h,4000 r/min离心5 min。将上清液转移到另一试管中,再与提取缓冲液混合,4000 r/min离心5 min,上清液用ELISA试剂盒（北京北农威天生物技术有限公司）测定内源激素吲哚乙酸（IAA）、玉米素核苷（ZR）、脱落酸（ABA）含量[14],且均以鲜重计。
1.2.4 茶树叶片氨基酸含量测定 茶树叶片中氨基酸含量测定,参照国家食品药品监督管理总局、国家卫生和计划生育委员会制定的标准《食品中氨基酸的测定》（GB/T 5009. 124-2016）[15]制备好待测液;具体方法为：取茶叶样品3 g置于500 mL锥形瓶中,加入450 mL沸水蒸馏水并置于沸水浴中浸提45 min（每5 min摇一次）,趁热过滤,冷切,定容至500 mL,每个样品重复3次。待测液采用日立L-8900氨基酸自动分析仪测定。
茶氨酸含量测定参照中华人民共和国国家标准（GB/T 23193-2008）[16],具体方法为：取0.1 g茶叶样品,加入10 mL去离子水并置于90 ℃中水浴15 min,1000 r/min下离心10 min,待测,每个样品重复3次。仪器测试条件为：流速0.25 mL/min,压力35 bar,反应温度130 ℃,上样量10 μL,检测波长338 nm。
1.3 数据处理
采用Excel和DPS软件对实验数据进行方差分析和显著性分析。
2 结果与分析
2.1 不同极性树脂洗脱液对受体莴苣的生物测试分析
由图1可看出,不同极性树脂洗脱液对受体莴苣生物测试结果表明,不同极性树脂洗脱液对受体的干重存在一定的抑制作用,表现为对受体干重的抑制率,ADS-7>ADS-21>ADS-F8>ADS-17> ADS-8。不同年限茶树根际土壤经树脂吸附后洗脱液对受体干重的抑制率则表现为,25 a>9 a>3 a> 0 a。由此可见,随着茶树树龄的增加,茶树根际土壤对受体的抑制作用增强,其中25 a茶树根际土壤经ADS-7树脂吸附的洗脱液抑制作用最强。
2.2 不同极性树脂洗脱液对茶树叶片内源激素含量的影响
不同极性树脂洗脱液外源添加处理茶树后,茶树叶片内源激素测定结果表明（图2~图4）,相同树脂处理下,茶树叶片的IAA和ZR含量随着茶树树龄的增加呈现显著下降趋势,而ABA含量则呈现显著上升的趋势。其中以ADS-7树脂洗脱液处理后对茶树叶片内源激素含量的影响最大,即随着茶树树龄的增加（0~25 a）,ADS-7树脂洗脱液处理后,茶树叶片的IAA和ZR分别从191.18 ng/g 下降至119.84 ng/g和170.24 ng/g下降至89.26 ng/g,而ABA含量则从245.96 ng/g上升至497.62 ng/g。其次,分析发现,当茶树树龄相同,不同极性树脂依然以ADS-7树脂洗脱液处理后,茶树叶片的IAA和ZR含量最低,ABA含量最高。可见,不同树脂洗脱液对茶树叶片内源激素含量存在着一定的影响,其中以ADS-7树脂洗脱液影响最大,特别是25 a树龄茶树根际土壤的ADS-7树脂洗脱液。
图2 不同极性树脂洗脱液处理后茶树叶片吲哚乙酸含量不同小写字母表示不同年限土壤相应指标差异显著（P<0.05）。 Fig. 2 The contents of IAA in tea leaves after treated by different polarity resin eluent Different lowercase letters significa indicate significant differences among the different cropping years (P<0.05). |
图3 不同极性树脂洗脱液处理后茶树叶片玉米素核苷含量不同小写字母表示不同年限土壤相应指标差异显著（P<0.05）。 Fig. 3 The contents of ZR in tea leaves after treated by different polarity resin eluent Different lowercase letters indicate significant differences among the different cropping years (P<0.05). |
2.3 不同极性树脂洗脱液对茶树叶片氨基酸含量的影响
茶树叶片氨基酸含量分析结果见表1,不同极性树脂洗脱液处理后,茶树叶片中的18种氨基酸含量发生一定的变化。进一步分析不同树脂洗脱液处理后,茶树叶片氨基酸含量与茶树树龄的相关性,结果表明,ADS-8树脂处理后,苏氨酸、赖氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、茶氨酸及总体氨基酸含量等与茶树树龄呈显著或极显著的负相关,而蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、半胱氨酸含量则呈显著或极显著的正相关;ADS-17树脂处理后,丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、组氨酸、精氨酸、茶氨酸及总体氨基酸含量等与茶树树龄呈显著或极显著的负相关,而缬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸含量则呈显著或极显著的正相关;ADS-F8树脂处理后,苏氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、茶氨酸及总体氨基酸含量等与茶树树龄呈显著或极显著的负相关,而蛋氨酸、亮氨酸含量则呈显著或极显著的正相关;ADS-21树脂处理后,苏氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、茶氨酸及总体氨基酸含量等与茶树树龄呈显著或极显著的负相关,而缬氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸含量则呈显著或极显著的正相关;ADS-7树脂处理后,苏氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、茶氨酸及总体氨基酸含量等与茶树树龄呈显著或极显著的负相关,而蛋氨酸、半胱氨酸含量则呈显著或极显著的正相关。
表1 不同极性树脂洗脱液处理后茶树叶片氨基酸含量Tab. 1 The contents of amino acid in tea leaves after treated by different polarity resin eluent mg·g-1 |
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可见,不同极性树脂处理后,茶树叶片氨基酸含量发生了显著的变化;此外,不同树脂处理下,随着茶树树龄的增加,茶树叶片氨基酸总量呈现下降趋势,并呈现为不同树脂处理对茶树叶片氨基酸含量影响趋势为ADS-7>ADS-21>ADS-F8>ADS- 17>ADS-8,而不同树龄茶树根际土壤对茶树叶片氨基酸含量影响趋势则为25 a>9 a>3 a>0 a。
2.4 不同极性树脂洗脱液对茶树叶片不同类别氨基酸含量的影响
根据氨基酸的亲水性高低,可将氨基酸分为疏水氨基酸（缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸）和亲水氨基酸（苏氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸、茶氨酸）。分析结果表明（图5,图6）,不同树脂洗脱液处理下,随着茶树树龄的增加,疏水氨基酸占比呈现上升趋势,其中以ADS-7树脂处理后的茶树叶片含量最高。而在亲水氨基酸含量上,随着茶树树龄的增加,总体呈下降趋势,但ADS-8、ADS-17、ADS-F8树脂处理下,不同树龄茶树叶片亲水氨基酸含量不存在显著差异,ADS-7树脂处理下则存在显著差异。可见,不同树脂处理后,随着茶树树龄的增加,茶树叶片中可溶解的氨基酸占比下降,反之不可溶解氨基酸占比则上升。
图5 不同极性树脂洗脱液处理后茶树叶片疏水氨基酸含量不同小写字母表示不同年限土壤相应指标差异显著（P<0.05）。 Fig. 5 The contents of hydrophobic amino acid in tea leaves after treated by different polarity resin eluent Different lowercase letters indicate significant differences among the different cropping years (P<0.05). |
根据氨基酸的在茶叶品评中所起的作用,可将氨基酸分为甜味氨基酸（谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、茶氨酸）、鲜味氨基酸（谷氨酸、茶氨酸）、苦味氨基酸（缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸）。分析结果表明（图7~图9）,不同树脂处理下,随着茶树树龄的增加,茶树叶片甜味氨基酸和鲜味氨基酸含量占比呈现下降趋势,而苦味氨基酸则呈现上升趋势;其次,以ADS-7树脂处理后的茶树叶片甜味、鲜味、苦味氨基酸含量占比变化最大,表现为随着茶树树龄的增加,甜味氨基酸占比从79.20%下降至64.46%,鲜味氨基酸占比从74.88%下降至60.34%,苦味氨基酸占比从3.42%上升至12.31%。可见,不同树脂处理后,随着茶树树龄的增加,茶树叶片中不同类别氨基酸含量发生了显著的变化。
图7 不同极性树脂洗脱液处理后茶树叶片甜味氨基酸含量不同小写字母表示不同年限土壤相应指标差异显著（P<0.05）。 Fig. 7 The contents of sweet amino acid in tea leaves after treated by different polarity resin eluent Different lowercase letters indicate significant differences among the different cropping years (P<0.05). |
图8 不同极性树脂洗脱液处理后茶树叶片鲜味氨基酸含量不同小写字母表示不同年限土壤相应指标差异显著（P<0.05）。 Fig. 8 The contents of umami amino acid in tea leaves after treated by different polarity resin eluent Different lowercase letters indicate significant differences among the different cropping years (P<0.05). |
3 讨论
植物在生长过程中不断向环境释放大量的次生代谢物,这些次生代谢物随着植物种植年限的增加,在土壤中不断地积累,进而对植物的生长产生影响[3]。本研究发现,同一树脂吸附茶树根际土壤后的洗脱液对受体的抑制作用,随着茶树树龄的增加而不断增强（25 a>9 a>3 a>0 a）,而不同树脂中,以ADS-7树脂吸附洗脱液对受体的抑制作用最强。ADS-7树脂具有强极性外表,兼具外表吸附与基团吸附功用,可用于吸附到物质29种,其中酚、酸类物质占了16种。可见,随着茶树植茶年限的增加,茶树根际土壤的自毒潜力呈现上升趋势,这种现象的产生可能与土壤中酸类物质的积累有关。
氨基酸含量的高低对于茶叶品质具有重要的影响,据报道,高品质茶叶的氨基酸含量明显较高[21]。Nakagawa[22,23]研究发现,绿茶中约70%的鲜味和甜味由氨基酸决定,氨基酸含量越高,口感越好。可见,氨基酸含量高低已被广泛应用于各类茶叶的质量评定中。本研究发现,不同树脂处理下,随着茶树树龄的增加,茶树叶片氨基酸总量呈现下降趋势,并呈现为不同树脂处理对茶树叶片氨基酸含量影响趋势为ADS-7>ADS-21> ADS-F8>ADS-17>ADS-8,而不同树龄茶树土壤对茶树叶片氨基酸含量影响趋势为25 a>9 a>3 a> 0 a。其次,本研究发现,不同树脂洗脱液处理后,以ADS-7处理后,疏水氨基酸含量占比最高,亲水氨基酸含量占比最小。此外,不同树脂处理后,茶树叶片甜味氨基酸和鲜味氨基酸含量占比,随着茶树树龄的增加,呈现下降趋势,而苦味氨基酸则呈现上升趋势,其中以ADS-7树脂处理后下降或上升比例最大。可见,不同树脂处理后,随着茶树树龄的增加,茶叶中氨基酸总量下降,可溶解的氨基酸含量降低,甜味、鲜味氨基酸含量下降,苦味氨基酸含量上升,茶叶的品质呈现下降趋势。
综上,本研究结果表明,不同树龄茶树根际土壤物质经不同树脂吸附洗脱后,洗脱液对茶树存在着一定的自毒作用,其中以ADS-7树脂吸附洗脱液的自毒能力最强。其次,不同树脂洗脱液处理茶树幼苗后,以ADS-7树脂吸附洗脱液对茶树幼苗叶片的激素及氨基酸含量影响最大,ADS-7树脂吸附洗脱液显著影响茶树的生长与品质。然而,本研究只是探讨不同极性树脂吸附洗脱液对茶树生长的影响,后期应当继续分析不同树脂吸附洗脱液的物质成分及其对土壤微生物生态系统的影响,以期能为退化茶园土壤的修复奠定理论基础。