可可（Theobroma cacao L.）属于梧桐科可可属常绿小乔木,种子（可可豆）富含脂肪、蛋白、多酚等成分,味醇香,是制作巧克力、饮料等的主要原料。可可原产南美热带雨林下,是典型的热带作物,现已广泛分布于世界热带地区的60多个国家,直接从业者超过4000多万人[1]。据国际可可组织（ICCO）统计,2016和2017年收获季世界可可收获面积约1000万hm2,总产量470万t,为世界第二大饮料作物[2,3]。我国可可主要种植在海南、云南,国内生产的可可豆远不能满足市场需求,目前我国所需可可豆基本依赖进口,2017年我国可可豆及制品进口量为12万t,且每年以较快的增长率持续递增。欧美等发达国家人均巧克力年消费在10 kg以上,即使在亚洲,东亚大多数国家的人均年消费也在2 kg以上,而目前我国还不足50 g[4,5]。随着我国人民生活水平的不断提高和饮食结构的变化,可可消费量还将大幅增加,市场缺口不断扩大。
我国可可主要分布在海南、云南、广东、台湾等省区,其中海南是可可主产区,种植面积和产量均占全国90%以上[6]。我国海南地处热带边缘,可可主产区冬季常有低温危害,主栽品种热引4号可可受寒后易出现落叶、落果、枯枝等现象,且伤口极易感染黑果病等病害,易给种植户造成严重经济损失[7]。低温成为影响我国可可丰产稳产和制约可可产业北扩的重要因素。因此开展可可种质资源抗寒性鉴定,筛选和培育抗性种质（品种）是我国可可育种的重要目标。
中国热带农业科学院香料饮料研究所从20世纪60年代开始,从东南亚、非洲、拉丁美洲等可可主产区收集3大类可可遗传资源300多份,含有许多具有经济开发潜力的优异资源,为可可品种选育和改良提供了重要材料来源[8]。然而,关于可可种质资源抗寒性鉴定,低温胁迫对可可幼苗生理生化的影响仍未见报道。本研究利用极端低温天气对收集保存的可可种质资源进行抗寒性鉴定,筛选抗寒性强的可可种质,并对筛选出的抗寒性差异种质开展叶片生理生化和显微结构变化研究,为进一步研究可可抗寒机理提供依据,并为可可抗寒育种研究提供优异材料资源。
1 材料与方法
1.1 材料
供试材料来自中国热带农业科学院香料饮料研究所农业农村部热带香料饮料作物种质资源圃的38份可可资源,厄瓜多尔8份（ECU-）、巴新1份（PNG-）、印尼6份（INA-）、科摩罗2份（COM-）、越南4份（VN-）、泰国5份（THA-）、名称中有“SBRI-”的12份种质为在引进种质基础上杂交创制的资源,详见表1。
表1 供试38份可可种质抗寒性评价Tab. 1 Cold resistance evaluation of 38 cacao germplasm |
| 种质 Germplasm | 叶片冻害率 Leaf frozen rate/% | 果实寒害等级率Pod frozen level and rate/% | 综合评定等级 Comprehensive grade | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1级Level 1 | 2级Level 2 | 3级Level 3 | 4级Level 4 | |||
| VN-o62 | 32.9 | 48.6 | 35.9 | 9.9 | 0.0 | Ⅲ |
| THA-o10 | 14.3 | 22.0 | 8.0 | 8.0 | 8.0 | Ⅱ |
| THA-o6 | 70.5 | 73.2 | 62.2 | 62.2 | 62.2 | Ⅴ |
| INA-t5 | 15.6 | 9.8 | 2.0 | 0.0 | 0.0 | Ⅰ |
| INA-t1 | 26.3 | 37.1 | 33.6 | 0.0 | 0.0 | Ⅲ |
| VN-tr2 | 34.1 | 54.8 | 47.8 | 0.0 | 0.0 | Ⅲ |
| THA-t4 | 27.5 | 39.7 | 6.9 | 6.9 | 0.0 | Ⅱ |
| THA-t9 | 22.9 | 47.3 | 34.4 | 3.8 | 3.8 | Ⅱ |
| INA-f2 | 36.4 | 63.5 | 46.0 | 46.0 | 0.0 | Ⅲ |
| SBRI-f5 | 15.1 | 50.0 | 33.3 | 4.2 | 0.0 | Ⅱ |
| SBRI-f21 | 33.8 | 61.5 | 42.3 | 18.3 | 18.3 | Ⅲ |
| INA-f6 | 54.2 | 72.7 | 62.6 | 49.5 | 0.0 | Ⅳ |
| INA-f8 | 28.0 | 28.8 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | Ⅱ |
| INA-s5 | 19.8 | 36.7 | 25.5 | 4.1 | 4.1 | Ⅱ |
| THA-s4 | 75.8 | 65.3 | 34.7 | 0.0 | 0.0 | Ⅲ |
| SBRI-s9 | 8.8 | 35.0 | 20.0 | 0.0 | 0.0 | Ⅰ |
| SBRI-s10 | 15.6 | 58.5 | 24.4 | 0.0 | 0.0 | Ⅱ |
| SBRI-s13 | 25.8 | 54.7 | 34.9 | 0.0 | 0.0 | Ⅱ |
| VN-sv5 | 29.4 | 31.1 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | Ⅱ |
| VN-sv6 | 15.9 | 9.1 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | Ⅰ |
| SBRI-e7 | 16.9 | 32.1 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | Ⅱ |
| SBRI-e18 | 25.6 | 31.7 | 31.7 | 14.4 | 8.7 | Ⅱ |
| SBRI-n2 | 33.8 | 35.8 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | Ⅱ |
| 种质 Germplasms | 叶片冻害率 Leaf frozen rate/% | 果实寒害等级率Pod frozen level and rate/% | 综合评定等级 Comprehensive grade | |||
| 1级Level 1 | 2级Level 2 | 3级Level 3 | 4级Level 4 | |||
| SBRI-n9 | 27.8 | 40.5 | 13.7 | 0.0 | 0.0 | Ⅱ |
| COM-e8 | 33.8 | 33.6 | 12.7 | 0.0 | 0.0 | Ⅱ |
| COM-e12 | 41.4 | 33.3 | 8.8 | 2.6 | 0.0 | Ⅱ |
| SBRI-e19 | 58.8 | 60.5 | 7.0 | 0.0 | 0.0 | Ⅱ |
| SBRI-n1 | 46.1 | 68.4 | 46.5 | 24.6 | 0.0ą | Ⅲ |
| SBRI-n4 | 41.1 | 68.0 | 53.3 | 0.0 | 0.0 | Ⅲ |
| ECU-n9 | 34.7 | 66.2 | 48.6 | 4.1 | 0.0 | Ⅲ |
| ECU-n12 | 43.3 | 60.7 | 54.5 | 2.7 | 0.0 | Ⅲ |
| ECU-n15 | 44.8 | 67.2 | 28.4 | 28.4 | 0.0 | Ⅱ |
| PNG-tn5 | 27.5 | 72.1 | 23.3 | 0.0 | 0.0 | Ⅱ |
| ECU-ev1 | 47.4 | 43.6 | 21.8 | 0.0 | 0.0 | Ⅱ |
| ECU-ev3 | 31.2 | 39.2 | 0.0 | 0.0 | 0.0 | Ⅱ |
| ECU-ev6 | 59.7 | 66.7 | 63.1 | 36.9 | 0.0 | Ⅳ |
| ECU-ev9 | 26.7 | 48.9 | 3.4 | 0.0 | 0.0 | Ⅱ |
| ECU-ev10 | 28.4 | 18.3 | 8.6 | 0.0 | 0.0 | Ⅱ |
1.2 方法
1.2.1 成龄可可树抗寒性田间调查 2016年1月23日极端低温后,田间调查38份可可资源材料的抗寒性,为便于比较分析,将可可抗寒性程度分成5级,标准如下：
Ⅰ级：果实生长正常,≤10%成熟叶片叶色黄色;Ⅱ级：1/8果实表面颜色出现黑色果实比例> 30%（果实寒害1级）,成熟叶片叶色黄色比例> 10%、≤30%;Ⅲ级：1/4果实表面颜色出现黑色果实比例>30%（果实寒害2级）,成熟叶片叶色黄色比例>30%、≤50%;Ⅳ级：1/2果实表面颜色出现黑色果实比例>30%（果实寒害3级）,成熟叶片叶色黄色比例>50%、≤70%;Ⅴ级：3/4果实表面颜色出现黑色果实比例>30%（果实寒害4级）,成熟叶片叶色黄色比例>70%。
1.2.2 可可幼苗低温胁迫处理 筛选抗寒性差异的8份可可种质,分别繁育袋装苗,选取无病虫害、长势良好、生长一致的可可袋装苗在光照培养箱中进行低温胁迫处理,试验温度处理设置为4 ℃,试验对照温度设置为30 ℃/28 ℃,光周期设置为12 h/12 h,相对湿度保持在70%左右。低温胁迫0、24、48、72、96 h时,分别剪取叶片并迅速置于液氮中冷冻,-80 ℃保存,用于后续测定叶片生理生化指标变化;剪取第一稳定叶,并用FAA固定液处理后,制作石蜡切片观察叶片解剖结构,每个处理重复3次。
1.2.3 生理指标测定 可可生理生化指标采用江苏科铭生物技术有限公司测定试剂盒,参照试剂盒操作说明进行测定INA-t5、COM-e8、ECU-ev6、THA-o6 4份可可种质幼苗叶片的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量（Pro）、丙二醛含量（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）酶活性等生理生化指标。从无病害、成熟叶中部剪取样品,大小为5 mm×5 mm,将样品置于FAA固定液处理72 h,经石蜡切片机切片、染色后,置于Olympus BX51正置荧光显微镜下观察拍照,比较各样品栅栏组织和海绵组织结构变化。
1.3 数据处理
观测数据取3次重复的均值,用Excel软件处理分析数据,采用Duncan新复极差法进行多重比较,分别在0.05和0.01水平比较差异显著性。
2 结果与分析
2.1 不同可可种质抗寒性表现
2016年1月,海南万宁兴隆地区极端低温达7 ℃条件下,农业农村部热带香料饮料作物种质资源圃的38份可可种质叶片、果实冻害率及综合抗寒等级见表1,果实受寒害后表现如图1。由表1看出,供试材料的抗寒性分为5级,从强到弱分别包含3、22、10、2、1份种质,耐寒与极不耐寒种质份数均呈现低比例趋势。其中VN-sv6、INA-t5种质田间抗寒性最强,叶片受害率分别为15.9%、15.6%,1级抗寒等级果实比例分别为9.1%、9.8%。THA-o6种质田间抗寒性最弱,叶片受害率为70.5%,4级抗寒等级果实比例为62.2%。此外,COM-e8种质叶片受害率为33.8%,1级抗寒等级果实比例为33.6%;ECU-ev6种质叶片受害率为59.7%,3级抗寒等级果实比例为36.9%。
2.2 低温胁迫对可可叶片结构影响
4 ℃低温胁迫处理后,可可种质INA-t5、THA-o6叶片表型及显微结构变化见图2和图3。结果表明,随着低温胁迫时间延长,THA-o6叶片的叶脉及附近组织逐渐褐化,胁迫24 h主叶脉开始出现褐化,胁迫48 h主叶脉和支叶脉褐化,胁迫72 h主叶脉和支叶脉全部褐化并向附近组织扩散,胁迫96 h主叶脉和支叶脉全部褐化,叶脉间大部分叶肉组织褐化并出现失水现象。INA-t5叶片在低温胁迫前期变化不明显,胁迫96 h主叶脉表现出轻度褐化。THA-o6叶片4 ℃胁迫96 h后,海绵组织细胞排列紊乱,并且微叶脉细胞着色较深;INA-t5叶片4 ℃胁迫96 h后变化不明显,部分微叶脉细胞着色较深。
图2 4 ℃胁迫后INA-t5和THA-o6叶片表型A~E、F~J为INA-t5、THA-o6叶片分别胁迫0、24、48、72、96 h后。 Fig. 2 The leaves phenotype of INA-t5 and THA-o6 under 4 ℃ A-E, F-J showed leaves phenotype of INA-t5 and THA-o6 after stress of 0, 24, 48, 72 and 96 h, respectively. |
2.3 低温胁迫对可可叶片可溶性糖含量、可溶性蛋白影响
4 ℃低温胁迫后,不同可可种质可溶性糖含量、可溶性蛋白随胁迫时间延长出现显著变化（图4）。INA-t5种质的可溶性糖含量呈升高趋势,胁迫96 h时达到最大值,与相比胁迫0 h相比提高了1.31倍;可溶性蛋白先下降再上升后保持稳定,胁迫24 h时达到最小值,降低到胁迫0 h的0.63倍,胁迫48 h时回升1.37倍,胁迫96 h含量达到最高,显著高于其他种质。COM-e8种质的可溶性糖含量呈先稳定再下降后回升变化趋势,可溶性蛋白呈下降、上升式变化,胁迫72 h时达到最小值,降低到胁迫0 h的0.43倍,胁迫96 h时回升1.65倍。THA-o6、ECU-ev6可溶性糖含量呈现下降趋势,胁迫72 h时略有上升;可溶性蛋白呈下降、上升、下降波浪式变化,胁迫24 h时达到最小值,分别降低到胁迫0 h的0.57、0.47倍,随后升高后再降低,胁迫96 h时与胁迫0 h相比降低了0.42、0.33倍。胁迫96 h后,抗寒种质INA-t5可溶性糖和可溶性蛋白含量显著高于其他3份种质。说明低温胁迫后,可可响应低温,提高可溶性糖和可溶性蛋白含量以提高对膜的保护作用,然而对低温响应能力不强。
图4 4 ℃低温胁迫对4份可可种质可溶性蛋白、可溶性糖含量影响柱子上不同大小写字母分别表示同一胁迫时间不同处理间差异极显著（P<0.01）或差异显著（P<0.05）。 Fig. 4 Soluble sugar and protein contents of 4 cacao germplasms under 4 ℃ treatment Different capital and lowercase letters in the column indicate extremely significant difference（P<0.01） or significant difference （P<0.05）between treatments in the same duress time. |
2.4 低温胁迫对可可叶片Pro、MDA含量影响
4 ℃低温胁迫后,不同可可种质脯氨酸、丙二醛变化差异较大（图5）。低温胁迫后,INA-t5、COM-e8的Pro含量变化不大;ECU-ev6的Pro含量先上升后下降,胁迫24 h时达到最大值,与胁迫0 h相比提高了4.57倍,随后急剧下降胁迫48 h时仅为胁迫24 h时的0.28倍;THA-o6的Pro含量呈上升、下降、上升波浪式变化,胁迫24、48、72 h时,含量分别为胁迫0 h的1.85倍、1.10倍、2.37倍。INA-t5的MDA含量持续上升,胁迫72 h时达到最大值,与胁迫0 h相比提高了1.65倍;COM-e8的MDA含量先上升后下降,胁迫24 h时达到最大值,与胁迫0 h相比提高了1.31倍;THA-o6、ECU-ev6的MDA含量下降后略有回升。4 ℃低温胁迫后,THA-o6、ECU-ev6的MDA、Pro变化幅度较大,膜脂过氧化程度较高导致抗寒性弱;INA-t5、COM-e8的MDA、Pro含量变幅小,膜脂过氧化程度较低从而抗寒性强。
图5 4 ℃低温胁迫对4份可可种质丙二醛、脯氨酸含量影响柱子上不同大小写字母分别表示同一胁迫时间不同处理间差异极显著（P<0.01）或差异显著（P<0.05）。 Fig. 5 MDA and Pro contents of 4 cacao germplasms under 4 ℃ treatment Different capital and lowercase letters in the column indicate extremely significant difference（P<0.01） or significant difference （P<0.05）between treatments in the same duress time. |
2.5 低温胁迫对可可叶片POD、CAT、SOD 活性影响
4 ℃低温胁迫处理对可可POD、CAT、SOD活性的影响见图6。由图3可以看出,4 ℃低温胁迫后,INA-t5 POD酶活性先上升后下降,胁迫24 h时达到最大值,显著高于其他3份种质;THA-o6 POD酶活性变化不明显,胁迫24 h时达到最小值,降低到胁迫0 h的0.94倍,随后少量回升并保持稳定,并且显著低于INA-t5和ECU-ev6种质。INA-t5 CAT酶活性呈上升趋势,胁迫96 h时达到最大值,与胁迫0 h相比提高了2.88倍,显著高于其他3份种质;THA-o6、COM-e8 CAT酶活性呈持续下降趋势,胁迫96 h时达到最小值,分别降低到胁迫0 h的0.27、0.28倍。INA-t5、COM-e8比THA-o6、ECU-ev6 SOD酶活性高,分别呈现波浪变化,INA-t5胁迫48 h时达到最小值降低到胁迫0 h的0.86倍,胁迫72 h时回升到最大值降低为胁迫0 h的1.06倍;THA-o6 SOD酶活性先降低再回升然后持续降低,胁迫48 h时回升到胁迫0 h的1.01倍,胁迫96 h时降低到胁迫0 h的0.38倍。以上结果说明,4 ℃低温胁迫后THA-o6、ECU-ev6 CAT、SOD、POD酶活性偏向下降趋势或维持较低水平,而INA-t5、COM-e8 CAT、POD、SOD酶活性偏向上升趋势或维持较高水平。
图6 4 ℃低温胁迫对4份可可种质CAT、POD、SOD酶活性影响柱子上不同大小写字母分别表示同一胁迫时间不同处理间差异极显著（P<0.01）或差异显著（P<0.05）。 Fig. 6 CAT, POD, SOD activities of 4 cacao germplasms under 4 ℃ treatment Different capital and lowercase letters in the column indicate extremely significant difference（P<0.01） or significant difference （P<0.05）between treatments in the same duress time. |
3 讨论
植物体内可溶性糖含量、可溶性蛋白、游离脯氨酸、丙二醛含量与植物低温等逆境生理密切相关[9,10]。在逆境胁迫下,植物细胞通过调节可溶性糖和可溶性蛋白的含量,改变细胞质浓度和细胞保水力能力,缓解细胞质过度脱水,起到保护细胞质使其不致遇冷结冰[11]。在许多植物中,可溶性糖与蛋白含量与抗寒性呈现正相关,可能是由于植物体内糖与蛋白质合成增加或降解减少[12]。油棕、油橄榄等植物的可溶性糖与蛋白含量随低温胁迫程度的增强呈上升趋势,抗寒性强的品种上升的幅度越大[13,14]。本研究表明,低温胁迫后可可的可溶性糖和可溶性蛋白都表现含量变化多样,抗寒鉴定较强的种质INA-t5可溶性糖含量呈现上升趋势,ECU-ev6、THA-o6、COM-e8可溶性糖含量呈现下降趋势;测试的4份种质可溶性蛋白蛋白含量经低温胁迫后,均出现下降随后表现出少量回升。可能因为可可是热带作物,在初次经历极端低温时体内可溶性糖与蛋白质进行代谢供能导致含量下降,随着低温胁迫时间延长植株对外界不良环境做出应激反应,可溶性糖和蛋白含量上升,随着低温胁迫持续,细胞受损结构被破坏,植株的可溶性糖和可溶性蛋白含量又呈现降低趋势。
在逆境胁迫下,游离脯氨酸、丙二醛可作为渗透调节物质和防脱水剂,通过提高细胞内渗透物浓度而降低水势,使细胞保持膨压,当植物受到环境胁迫时会使植物体内游离脯氨酸和丙二醛的含量迅速积累[15,16,17]。本研究中,从植株表型判定,INA-t5抗寒性较强,ECU-ev6、THA-o6抗寒性弱;4 ℃低温胁迫后,ECU-ev6、THA-o6和COM-e8脯氨酸含量先上升后下降,而INA-t5的脯氨酸含量略有上升;ECU-ev6、THA-o6和COM-e8丙二醛含量先下降后上升,INA-t5的丙二醛含量缓步上升。结果表明可可的脯氨酸和丙二醛含量与其抗寒性呈现负相关,低温胁迫后抗寒性强的可可种质脯氨酸和丙二醛含量变化不明显,抗寒性弱的可可种质脯氨酸和丙二醛含量波动幅度较为显著。
在植物体内,SOD酶催化底物发生歧化反应生成H2O2,以清除超氧自由基的解毒作用,POD与SOD功能相似,清除细胞内活性氧自由基,防止膜脂质过氧化损伤[18,19,20]; 低温胁迫下,植物SOD活性一般先升后降[21,22,23]。4 ℃处理后,INA-t5和COM-e8种质中SOD酶活性呈现先升后降趋势,表明低温处理条件下,低温诱使可可SOD酶活性上升,随低温胁迫时间持续,可可植株体内积累了大量的活性氧,导致活性氧和防御系统的动态平衡被打破,进而加剧膜脂的过氧化反应。4 ℃低温胁迫下,THA-o6种质CAT和POD活性都呈现先升后降的趋势,INA-t5种质CAT活性表现持续上升的趋势,说明随胁迫时间延长,THA-o6种质保护酶系统已经被破坏,INA-t5防御系统仍然发挥作用。
低温胁迫后,可可的可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量和丙二醛,SOD、POD和CAT活性,都会出现显著性变化。可溶性糖和可溶性蛋白呈现波动变化趋势,丙二醛和脯氨酸含量增幅不明显,抗寒性强的种质抗氧化酶活性能够持续活跃。在低温诱导条件下,抗寒性弱的可可种质可溶性蛋白、脯氨酸含量、丙二醛和抗氧化酶活性均出现显著波动,随着低温胁迫持续进行,导致细胞结构破坏,植株的抗氧化酶系统和代谢活动失效,植株抗寒性表现出明显降低趋势。本研究得出的渗透物质含量和抗氧化酶活性变化应答规律,以及鉴定出的抗寒性差异可可种质,为开展可可抗寒分子机理研究提供理论基础、可可抗寒品种培育提供材料来源。