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2019 , Vol. 40 >Issue 10: 2068 - 2075

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2019.10.022

Crop Culture and Nutrition, Genetic Breeding

Sugarcane Pollen Germination in vitro

  • CHANG Hailong ,
  • ZHANG Wei ,
  • CHEN Junlyu ,
  • GUO Yuqiang ,
  • FANG Na ,
  • QIU Yongsheng ,
  • ZHOU Feng ,
  • WU Jiantao ,
  • LIU Zhuang ,
  • LIU Shaomou ,
  • WANG Qinnan , *
Expand
  • Hainan Sugarcane Breeding Station, Guangzhou Sugarcane and Sugar Industry Institute / Guangdong Sugarcane Germplasm Resources and Utilization of Scientific Observation Test Station, Ministry of Agriculture & Rural Affairs, Sanya, Hainan 572025, China

Received date: 2018-12-27

  Request revised date: 2019-04-08

  Online published: 2019-11-04

Copyright

Copyright reserved © 2019. Office of Acta Agronomica Sinica All articles published represent the opinions of the authors, and do not reflect the official policy of the Chinese Medical Association or the Editorial Board, unless this is clearly specified.
Fold

Abstract

The pollens of sugarcane cultivar ROC22 were used as the main experimental material to seek for the basic conditions of the pollen germination in vitro by a single factor experiment, and the most appropriate culture medium formula was explored by an orthogonal experiment L16(4 5) in order to investigate the effects on sugarcane pollen germination under different temperatures. In the single factor experiment, the culture medium solidified slightly had the best effect. In certain range of concentration, sucrose, boric acid and calcium nitrate might promote pollen germination and inhibit pollen germination over the critical concentration. In addition, magnesium sulfate worked unsteadily, and the effect of potassium nitrate was little. In the orthogonal experiment, sucrose influenced significantly on the pollen germination rate in vitro and the pollen tube growth rate, boric acid took the second place, magnesium sulfate had little effect. The optimum temperature for pollen germination was 30 ℃, the pollen germination rate was 89.93% and the pollen tube length was 143.03 μm. It is concluded that, under 30 ℃, the pollen had the highest germination rate and the pollen tube grew well using the best culture medium formulas (200 g/L sucrose, 400 mg/L boric acid, 100 mg/L calcium nitrate, 400 mg/L magnesium sulfate and 1 g/L agar), which might help to identify the difference of various sugarcane pollen efficiently.

Key words： cultivar; sugarcane pollen; germination in vitro; orthogonal design

Cite this article

CHANG Hailong , ZHANG Wei , CHEN Junlyu , GUO Yuqiang , FANG Na , QIU Yongsheng , ZHOU Feng , WU Jiantao , LIU Zhuang , LIU Shaomou , WANG Qinnan . Sugarcane Pollen Germination in vitro[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2019 , 40(10) : 2068 -2075 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.10.022

自18世纪末Sotwedel和Harrison发现甘蔗在自然环境下开花结实以来,有性杂交一直是培育甘蔗新品种的主要途径[1]。但甘蔗花粉发育受外界环境影响,每年不同亲本间花粉活性差异较大,所配杂交组合中约25%的花穗结实率接近于零,这不但浪费劳动力,且不利于甘蔗杂交育种技术的持续发展。可见,甘蔗花粉的活性鉴定是杂交种质量与纯度的重要指标[2]。因此,为了提高甘蔗杂交结实率,配制亲本花粉活性强的优势组合,也为衡量甘蔗各品种（系）遗传雄性不育系不育程度及为甘蔗人工杂交授粉提供理论指导,有必要对其花粉生活力进行检测。花粉离体萌发因其数据可靠并完全定量而成为目前杂交育种中花粉生活力测定的首选方法[3]。
琼脂、蔗糖、硼酸、Ca2+、Mg2+和K+作为花粉离体培养的基本组成成分在蔗茅[4]、果梅[5]、小麦[6]、月季[7]等很多植物中均有应用,但不同植物花粉培养条件有一定的差异。甘蔗花粉属于典型的三核型花粉,外壁薄,对干燥敏感,其花粉生活力丢失速率是二核型花粉的2倍,离体后往往很快失去活力[8],长期以来甘蔗花粉的离体萌发没有得到很好地解决。本文以甘蔗花粉为材料,在前期单因素试验基础上,采用正交设计研究花粉离体萌发的最适宜培养基成分,并研究了温度对甘蔗花粉萌发的影响,以期筛选出甘蔗花粉离体萌发的最适宜培养体系,为甘蔗花粉活力测定提供一个高效、快速、简便的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究以海南甘蔗育种场ROC22为试验材料。2017年11月上旬花穗盛开期开始,提前1 d于傍晚时分把接近盛开的试材从茎中下部剪断,温室条件下于清水缸中培养。翌日清晨7点开始观察螽花开放时间,收集花粉,去除杂质装入密封塑料管中待用。

1.2 方法

1.2.1 单因素试验 参照李富生等[4]关于蔗茅花粉的培养方法。分别对培养基组分中琼脂、蔗糖、硼酸、硝酸钙、硫酸镁及硝酸钾进行单因素试验（表1）;除蔗糖因子外,其他因子的试验均在150 g/L的蔗糖浓度下进行。
表1 单因素试验的梯度设计

Tab. 1 Single factorial experiments

因素Factors 水平Levels
琼脂Agar/(g∙L-1) 0 1 2 3 4
蔗糖Sucrose/(g∙L-1) 0 50 100 150 200
硼酸Boric acid/(mg∙L-1) 0 100 200 300 400
硝酸钙
Calcium nitrate/(mg∙L-1)		 0 100 200 300 400
硫酸镁
Magnesium sulfate/(mg∙L-1)		 0 100 200 300 400
硝酸钾
Nitrate of potash/(mg∙L-1)		 0 100 200 300 400
1.2.2 正交试验 在单因素试验的基础上,为探讨甘蔗花粉萌发和花粉管生长的最佳培养基配方,采用L16 (45)正交设计,研究培养基组分中蔗糖（A）、硼酸（B）、硝酸钙（C）硫酸镁（D）4个因素的各个水平对甘蔗花粉离体萌发的影响,因素水平安排见表2。
表2 培养基组分对花粉离体萌发影响的正交设计

Tab. 2 Orthogonal experiment of the effects of culture medium on pollen germination in vitro

水平
Level		 因素Factors
A蔗糖
Sucrose
/(g∙L-1)		 B硼酸
Boric acid
/(mg∙L-1)		 C硝酸钙Calcium
nitrate
/(mg∙L-1)		 D硫酸镁Magnesium sulfate/(mg∙L-1)
1 100 200 100 100
2 150 400 200 200
3 200 600 300 300
4 250 800 400 400
1.2.3 不同温度对甘蔗花粉萌发和花粉管伸长的影响 在筛选出最适蔗糖、硼酸、硝酸钙和硫酸镁浓度的基础上,利用最优培养基在培养温度为26、28、30、32 ℃下筛选出甘蔗花粉萌发和花粉管生长的适宜温度。
1.2.4 萌发率和花粉管长度的测定 花粉萌发以花粉管长度超过花粉直径为标准,在光学显微镜下观察花粉萌发及未萌发情况,并统计萌发率（同一视野中萌发的花粉占花粉总数的百分比）。每个玻片取3个视野统计萌发率,每个视野的花粉数不少于100个,每个处理统计3个玻片。
测定花粉萌发率的同时,选取已萌发的花粉,利用摄像系统截取图片,用Image-Prous 6.0图像分析软件测定花粉管长度,每个处理选取6个视野统计截图内所有萌发花粉管长度。

1.3 数据处理

数据采用Excel软件绘制图表及SPSS13.0软件进行方差分析及多重比较。

2 结果与分析

2.1 6个单因素对甘蔗花粉萌发的影响

通过对琼脂、蔗糖、硼酸、硝酸钙、硫酸镁和硝酸钾的单因素试验结果表明,6个单因素对甘蔗花粉萌发都有一定影响,不同因素水平间变化不相同（图1）。琼脂对花粉萌发作用显著,呈现“倒V”型变化趋势,含量为0时花粉无萌发,1 g/L即培养基刚好凝固时花粉萌发率达最高值,之后随着琼脂质量浓度增加,萌发率急速降低,4 g/L时回落到无萌发状态。蔗糖质量浓度为0时,花粉无萌发,随着蔗糖质量浓度的增加花粉萌发率呈“抛物线”趋势增长,150 g/L时花粉萌发率增长趋势放缓,与200 g/L时花粉萌发率相比仅相差0.43%。推测,花粉萌发适宜蔗糖质量浓度在200 g/L左右。硼酸质量浓度为100~200 mg/L时花粉萌发率增长幅度较高,300 mg/L时花粉萌发率达最高值。硝酸钙质量浓度在0~300 mg/L时花粉萌发率呈指数增长趋势,之后缓慢降低。随着硫酸镁质量浓度增加花粉萌发率呈现“扁平M”态势,在100、300 mg/L时花粉萌发率较高,0、400 mg/L时花粉萌发率处于较低水平。硝酸钾对花粉萌发率影响较小,随着硝酸钾质量浓度增加花粉萌发率变化幅度较低,100 mg/L时花粉萌发率最高为10.85%,最低值为300 mg/L时的9.15%,两者相差仅1.70%。综上所述,甘蔗花粉萌发的适宜条件为：200 g/L蔗糖,300 mg/L硼酸,300~400 mg/L硝酸钙,100~300 mg/L硫酸镁,1 g/L琼脂,硝酸钾对花粉萌发影响极小,可忽略不计。
图1 甘蔗花粉在单因子试验中的萌发率

Fig. 1 Germination rate of sugarcane pollen in single-factor experiments

2.2 4因素正交试验对甘蔗花粉离体萌发的影响

在单因素试验基础上,为寻求蔗糖、硼酸、硝酸钙、硫酸镁的最佳组合,将新鲜甘蔗花粉接种在利用L16 (45)正交设计的培养基中（表3）。从表3可知,不同培养基上甘蔗花粉的萌发率不同。其中,组合10（A3B2C4D3）上的萌发率最高为85.52%,与最低组合1（A1B1C1D1）相差高达55.24%;组合12（A3B4C2D1）上的花粉管长度最高为112.27 μm,显著高于其他组合,且花粉管长度适宜,分布均匀。对表3的数据进行直观分析和方差分析,结果见表4和表5。
表3 甘蔗花粉离体萌发的正交试验结果

Tab. 3 Results by orthogonal experiment for sugarcane pollen germination in vitro

试验编号
Serial number		 因素Factors 萌发率
Germination rate
/%		 花粉管长度
Pollen tube length
/μm
A蔗糖
Sucrose
/(g∙L-1)		 B硼酸
Boric acid
/(mg∙L-1)		 C硝酸钙
Calcium nitrate
/(mg∙L-1)		 D硫酸镁Magnesium sulfate
/(mg∙L-1)
1 100 200 100 100 30.28 68.25
2 100 400 200 200 40.72 57.16
3 100 600 300 300 32.04 45.83
4 100 800 400 400 30.56 63.18
5 150 200 200 300 43.72 66.79
6 150 400 100 400 70.36 89.21
7 150 600 400 100 45.84 64.53
8 150 800 300 200 39.40 80.27
9 200 200 300 400 62.96 97.54
10 200 400 400 300 85.52 99.86
11 200 600 100 200 75.08 105.36
12 200 800 200 100 66.76 112.27
13 250 200 400 200 48.72 108.35
14 250 400 300 100 62.48 100.23
15 250 600 200 400 50.64 88.46
16 250 800 100 300 42.12 81.59
表4 不同培养基上花粉萌发率和花粉管长度的直观分析

Tab. 4 Intuitive analysis of pollen germination rate and pollen tube length on different mediums

指标
Index		 萌发率Germination rate/% 花粉管长度Pollen tube length/μm
A蔗糖Sucrose B硼酸
Boric acid		 C硝酸钙Calcium nitrate D硫酸镁Magnesium sulfate A蔗糖Sucrose B硼酸
Boric acid		 C硝酸钙Calcium nitrate D硫酸镁Magnesium sulfate
K1 33.4 46.42 54.46 51.34 58.61 85.23 86.10 86.32
K2 49.83 64.77 50.46 50.98 75.20 86.62 81.17 87.79
K3 72.58 50.9 49.22 50.85 103.76 76.05 80.97 73.52
K4 50.99 44.71 52.66 53.63 94.66 84.33 83.98 84.60
R 39.18 20.06 5.24 2.78 45.15 10.57 5.13 14.27

Note: K1, K2, K3 and K4 represent the mean of four levels of each factor, respectively. R represents the range.

注：K1、K2、K3、K4分别表示各因素4个水平的均数,R代表极差。

表5 不同培养基上花粉萌发率和花粉管长度的方差分析

Tab. 5 Variance analysis on pollen germination rate and pollen tube length in different mediums

项目
Project		 因素
Factor		 偏差平方和DEVSQ 自由度DOF F比
F-ratio		 F0.05 F0.01 显著性
Significance
萌发率
Germination rate		 蔗糖（A） 3099.46 3 32.72 9.28 29.50 **
硼酸（B） 992.81 3 10.48 *
硝酸钙（C） 64.91 3 0.69
硫酸镁（D） 20.38 3 0.22
误差 94.73 3
花粉管长度
Pollen tube length		 蔗糖（A） 4890.86 3 12.48 *
硼酸（B） 272.70 3 0.70
硝酸钙（C） 72.22 3 0.18
硫酸镁（D） 505.51 3 1.29
误差 391.97 3

Note: ** and * indicate significant differences at 0.01 and 0.05 level, respectively.

注：**和*分别表示在0.01和0.05水平差异显著。

各因素内水平极差（R）的大小反映该因素对试验结果的影响程度,极差越大表明影响越大。由表4直观极差分析可知,参试的4个因素对花粉萌发率影响的主次关系依次：为A（蔗糖）>B（硼酸）>C（硝酸钙）>D（硫酸镁）,蔗糖对花粉的萌发影响最大,硼酸次之,而硫酸镁影响最小。以甘蔗花粉的花粉管长度为衡量指标,各因素的极差大小顺序为A（蔗糖）>（B）硼酸>D（硫酸镁）>C（硝酸钙）。蔗糖对花粉管长度影响最大,硼酸次之,硝酸钙影响最小。由极差分析可知,蔗糖与硼酸浓度对甘蔗花粉萌发及花粉管生长最为关键。由直观分析图2可知,花粉萌发率与花粉管长度都随着蔗糖浓度的升高出现先增加后降低的趋势;硼酸浓度升高花粉萌发率也出现先增加后降低的趋势。相反,花粉管长度是先降低后增加;硝酸钙浓度对花粉萌发率及花粉管长度影响不大,硫酸镁浓度仅对花粉管长度有影响,出现先降低后升高的趋势。由直观分析图可知适宜花粉萌发的最优组合为A3B2C1D4,即蔗糖200 g/L、硼酸400 mg/L、硝酸钙100 mg/L、硫酸镁400 mg/L。适宜花粉管生长的最优组合为A3B2C1D2,即蔗糖200 g/L、硼酸400 mg/L、硝酸钙100 mg/L、硫酸镁200 mg/L。对最优组合A3B2C1D4和A3B2C1D2进行花粉离体萌发验证（图3）,经统计分析确认2组合萌发率差异显著,花粉管长度差异不显著,且经A3B2C1D4培养的花粉管长度长短适宜,分布均匀。因此,从花粉萌发率和花粉管长度2方面综合考虑最优组合为A3B2C1D4。综上所述,甘蔗花粉离体萌发的适宜条件为蔗糖200 g/L、硼酸400 mg/L、硝酸钙100 mg/L、硫酸镁400 mg/L。
图2 正交试验直观分析

Fig. 2 Intuitive analysis by orthogonal experiment

图3 不同培养基下甘蔗花粉萌发情况

A、C：利用组合A3B2C1D4培养基花粉萌发情况;B、D：利用A3B2C1D2培养基花粉萌发情况;E：新鲜花粉成熟度检测。

Fig. 3 Situations of the sugarcane pollen germination under different culture mediums

A, C: Pollen germination under A3B2C1D4 culture medium; B, D: Pollen germination under A3B2C1D2 culture medium; E: Detection of the fresh mature pollen.

由表5方差分析可见,蔗糖和硼酸对甘蔗花粉萌发率均达到显著或极显著影响,是甘蔗花粉萌发最关键因素,其他因素影响不显著;误差偏差平方和94.73远小于分析的蔗糖和硼酸偏差平方和,但大于硝酸钙和磷酸镁,推测甘蔗花粉离体萌发除了以上分析的4因素外,还存在其他一些影响因素,比如取材时间、操作技术及培养环境等。4因素中蔗糖对甘蔗花粉管伸长影响达到显著水平,其他因素不显著;但误差偏差平方和391.97远大于硼酸的272.70和硝酸钙的72.22,说明在影响花粉管伸长方面除了以上分析的4因素外还有其他因素对花粉管伸长起到重要影响,有待进一步分析。

2.3 同温度对甘蔗花粉萌发和花粉管伸长的影响

花粉萌发是花粉细胞内一系列生化反应的结果,而适宜的温度是生化反应正常进行的基本条件之一。将甘蔗新鲜花粉接种在最优组合A3B2C1D4的培养基上,分别放置在26、28、30、32 ℃的培养箱中,2 h后统计萌发率和花粉管长度。由表6分析结果可知,不同培养温度对甘蔗花粉萌发率和花粉管长度都具有显著的影响。花粉萌发率和花粉管长度随着培养温度的升高而增加,当温度为30 ℃花粉萌发率和花粉管长度都达到最高,为89.83%和143.03 μm极显著高于其他培养温度。温度为28、32 ℃时花粉萌发率和花粉管长度差异不显著,但显著高于培养温度为26 ℃的萌发率。综上分析可知,甘蔗花粉萌发和花粉管正常生长的适宜温度为30 ℃,温度过高或过低均不利于甘蔗花粉的萌发。
表6 不同温度下甘蔗花粉的萌发和花粉管生长情况

Tab. 6 Pollen germination and pollen tube growth of sugarcane under different temperatures

温度
Temperature/℃		 萌发率
Germination rate
/%		 花粉管长度
Pollen tube length
/μm
26 63.24±2.14C 95.17±11.04C
28 78.39±3.81B 105.52±13.74BC
30 89.83±5.63A 143.03±9.67A
32 78.16±2.41B 118.41±10.16B

Note: Different capital letters in the same column indicate significant difference at 0.01 level.

注：同列数据后不同大写字母表示在0.01水平差异显著。

3 讨论

3.1 养基组分对甘蔗花粉萌发的影响

琼脂主要起到固化培养基的作用,不同植物花粉萌发所需琼脂浓度各有差异。王开良等[9]研究认为,余甘子花粉萌发适宜的琼脂浓度为20g/L;杜纪红等[10]认为桃花花粉萌发适宜浓度为10 g/L。本研究结果表明1 g/L的琼脂浓度对花粉萌发效果最好,低于1 g/L时培养基无法固化成型,花粉凹进培养基内部,萌发率降低且花粉管弯曲变形不易于统计比较。高于1 g/L时培养基硬度逐渐增大,花粉散落在培养基表面,透气性较好,但不利于花粉吸收营养成分,萌发率逐渐降低且花粉管较细,不健壮。
蔗糖对花粉的萌发和花粉管的生长具有明显的促进作用,一是花粉粒萌发及花粉管壁合成的主要营养物质,又是参与花粉代谢与跨膜运输的碳源[11];二是维持外界环境一定的渗透压[12]。浓度过低,花粉吸水,花粉壁破裂;浓度过高,花粉失水,导致花粉质壁分离抑制花粉萌发[13]。因此,蔗糖浓度必须控制在合理的范围之内。不同植物花粉所需浓度各有差异,应与品种遗传特性不同或花粉渗透压不同有关。罗凤霞等[14]研究表明,不同品种水仙花粉萌发所需的蔗糖浓度不一样,当蔗糖浓度为100~150 g/L时具有较高的萌发率;赵丽娟等[15]研究表明,小黑杨花粉萌发适宜的蔗糖浓度为150 g/L。本研究结果表明,蔗糖对甘蔗花粉萌发有极显著影响,在100~200 g/L时,随着蔗糖浓度增加,花粉萌发率及花粉管长度逐渐提高,当蔗糖浓度为200 g/L时,花粉管长度均匀、生长健壮、直立不弯曲,其萌发率也达到最高值,硼在植物体内含量很低,且分布不均匀,以花中含量最高,花中又以柱头和子房最多,硼离子与糖结合能够形成络合物,使糖易于通过质膜在组织中运输,增加氧的吸收,从而促进糖的吸收与代谢[16];硼还能参与果胶物质的合成,有利于花粉管壁的形成,因而有利于花粉管生长。不同植物种类的花粉萌发和生长所需的最适硼酸浓度不同,如紫丁香的最适浓度为600 mg/L[17]、麻疯树适宜的硼酸浓度为100 mg/L[18]。本研究结果表明,硼酸是甘蔗花粉萌发和花粉管伸长所必须的一种营养物质,对花粉的萌发有显著促进作用,甘蔗花粉萌发及花粉管伸长适宜的浓度为400 mg/L。
研究表明,Ca2+的动态变化对启动花粉萌发、调节花粉管伸长等环节具有重要作用[19,20,21],花粉离体萌发时需要适当的外源Ca2+,缺钙或浓度过高都会导致花粉萌发和花粉管生长受阻[22,23]。在本研究中,硝酸钙的单因子和正交试验结果均表明,低浓度的硝酸钙对甘蔗花粉萌发有一定的促进作用,对花粉管长度的生长影响较小。甘蔗花粉离体萌发适宜的硝酸钙质量浓度为100 mg/L,硝酸钙质量浓度增加时抑制甘蔗花粉萌发和花粉管的生长,可见甘蔗花粉本身含有一定量的Ca2+,当花粉吸水时,表面钙离子释放到培养基中启动花粉萌发[24,25]。

3.2 温度对甘蔗花粉萌发的影响

作为热带作物,甘蔗抽穗开花受温度影响较大,温度过高或过低都不利于花粉萌发。周峰等[26]研究认为夜间温度控制在25 ℃,10 h可明显促进甘蔗花芽分化;王丽萍等[27]通过对甘蔗光周期诱导处理后发现,孕穗期适宜提高温度可显著增加花粉量及花粉育性。本试验结果表明,甘蔗花粉萌发率和花粉管发育对温度十分敏感,26~28 ℃条件下花粉萌发率较低,花粉管生长缓慢;28~30 ℃条件下花粉萌发率逐渐增加,花粉管生长速度也较快;30~32 ℃条件下花粉萌发率逐渐降低,花粉管易弯曲打折影响统计分析,最适宜培养温度为30 ℃,花粉萌发率和花粉管长度最高,极显著高于其他培养温度,且花粉管直立,生长健壮,易于花粉生活力的比较分析。
综上所述,栽培种甘蔗花粉离体萌发培养方式为：培养基（蔗糖200 g/L+硼酸400 mg/L+硝酸钙100 mg/L+硫酸镁400 mg/L+琼脂1 g/L）,置于30 ℃恒温培养箱内湿润环境下培养效果最佳,可快速、准确鉴定甘蔗花粉活力。

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