近年来,随着社会的发展和生活水平的提高,食品安全开始受到人们广泛的关注。食源性疾病是中国食品安全的头号问题,也是世界重要的公共卫生问题,致病微生物的污染是造成食源性疾病的主要原因[1,2]。铜绿假单胞菌,又名绿脓杆菌,食源性致病菌之一,革兰氏阴性属,主要存在于肉制品和饮用水中,能产生外毒素、肠毒素等,容易造成食品腐败污染,危害人们身体健康,很多城市已经对其开展监测[3]。
目前,为了减少食源性疾病的发生,延长食品货架期,防腐剂被广泛使用。精油作为一种植物源天然防腐剂,可以从多种芳香植物中提取,主要由萜类、倍半萜类化合物等组成[4]。已有大量报道证明,精油具有良好的抑菌活性,但是具体是哪种成分主要发挥作用,还鲜有研究[5,6]。
3-蒈烯是许多植物精油的主要挥发性成分,包括松节油、胡椒油、当归油等。分子式为C10H16,是一种单萜烯,呈无色液体状态[7]。由于3-蒈烯本身的松木样香气,在食用香精中有广泛应用,《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760-2014）中规定3-蒈烯为允许使用的食品用合成香料[8]。此外,3-蒈烯可用于农药、药物和化妆品,还是增塑剂等化学品中重要的原料之一[7]。吴桂苹等[9]通过气相色谱-质谱法（GC-MS）测得白胡椒精油中3-蒈烯的含量在21.94%~24.64%之间。Lomarat等[10]研究表明δ-3-蒈烯是黑胡椒油的主要成分（30.75%）。Zhang等[11]研究发现黑胡椒精油对肉中的致病菌——大肠杆菌具有明显的抑制效果。
目前,有关3-蒈烯对铜绿假单胞菌的抑菌机理的探讨鲜有报道。本研究主要通过测定3-蒈烯的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）确定抑菌活性,通过铜绿假单胞菌扫描电镜观察和生长曲线、电导率、蛋白泄漏等指标的测定, 初步分析3-蒈烯的抑菌机理,为3-蒈烯应用于食品的防腐保鲜提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
铜绿假单胞菌（ATCC 9027）,广东省微生物菌种保藏中心。
(+)-3-蒈烯（>90.0%）,日本东京化成工业株式会社（TCI）;无菌磷酸盐缓冲液（PBS,浓度为0.1、0.01 mol/L,pH 7.4）、2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）、牛肉膏、蛋白胨,北京索莱宝科技有限公司;罗丹明123,上海源叶生物科技有限公司;碱性磷酸酶（AKP）测试盒,南京建成生物工程研究所。
无菌超净工作台,苏州佳宝净化工程设备有限公司;高压灭菌锅,致微（厦门）仪器有限公司;SPX型生化培养箱,宁波江南仪器厂;SHA-2型恒温振荡器,常州澳华仪器有限公司;TGL-16M型高速冷冻离心机,上海卢湘仪离心机仪器有限公司; 5804R型台式高速冷冻离心机,德国Eppendorf公司;S-3000型扫描式电子显微镜,日本日立(Hitachi)工机有限公司;DDS-307型电导率仪,上海仪电科学仪器股份有限公司;TU1810型分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;F-280型荧光分光光度计,天津港东科技发展股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 菌种活化 将铜绿假单胞菌在营养琼脂培养基中置于37 ℃培养箱培养18~24 h进行传代恢复活性,培养后的细菌用无菌生理盐水（0.9% NaCl）将其从斜面上洗脱下来,采用麦氏比浊法把菌悬液的浓度进行稀释。
1.2.2 最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌剂浓度（MBC）的测定 参照Huang等 [12]的方法做适当调整,将3-蒈烯溶于70 %乙醇中,稀释成800、400、200、100、50、25 mL/L的抑制液,在平板中先加入1 mL抑制液,再倒入降温至50 ℃左右的营养肉汁培养基19 mL,混合均匀,使其终浓度为40、20、10、5、2.5、1.25 mL/L。待培养基凝固之后,在每个平板中加入200 μL浓度为107~108 CFU/mL的供试菌悬液,用涂布棒涂布均匀。空白对照和阴性对照分别为无菌水和70%乙醇,平板倒置培养,于24 h后进行观察,3-蒈烯的最小抑菌浓度（MIC）为完全不长菌的最小稀释浓度。然后,将浓度大于或等于MIC的平板在37 ℃下再培养24 h。仍然没有可见细菌生长的浓度定义为最小杀菌剂浓度（MBC）[13]。
1.2.3 细菌生长的测定 采用干重法[14],按照1 %（V/V）的接种量将稀释至106~107 CFU/mL的铜绿假单胞菌菌悬液接种到液体培养基中,在37 ℃、150 r/min振荡培养12 h后,加入3-蒈烯使其终浓度为MIC、MBC,取样间隔为1 h,取出的菌液在 8000 r/min离心10 min,弃上层液体,下层菌体用无菌水重悬洗涤,将菌体置于80 ℃下烘干至恒重,测得菌体干重。对照组为无菌水。
1.2.4 扫描电镜（SEM）观察 为了观察铜绿假单胞菌的形态变化,参照Tang等[15]的方法对供试菌进行SEM观察。铜绿假单胞菌培养至对数期,分别加入3-蒈烯使其终浓度为MIC、MBC,空白对照和阴性对照分别为无菌水和70 %乙醇,在培养4 h和8 h后将菌悬液取出,6000 r/min离心10 min收集菌体。菌体先用0.1 mol/L的PBS缓冲液洗涤3次,再依次用20%、40%、60%、80%的乙醇溶液进行梯度脱水,最后用无水乙醇进行洗脱。样品置于-20 ℃预冻,再于真空冷冻干燥器中干燥12 h。取出干燥完全的菌体、上样、通过阴极喷涂将菌体金覆盖,在扫描电子显微镜上观察铜绿假单胞菌的细胞形态。
1.2.5 菌液电导率的测定 参照张新虎等[16]的方法并做一些改动,铜绿假单胞菌培养至对数期,用无菌PBS缓冲液 （0.1 mol/L）洗涤3次并重悬,分别加入3-蒈烯使其终浓度为MIC、MBC,70 %乙醇作为对照组,电导率测量时间间隔为15 min,连续3 h。
1.2.6 蛋白质泄漏的测定 采用考马斯亮蓝法测定。铜绿假单胞菌培养至对数期,在菌悬液加入MIC、MBC浓度的3-蒈烯溶液,无菌水作为空白对照组。分别在加入3-蒈烯的第0、2、4、6、8、10、12 h取出菌悬液,将菌悬液置于离心机中4000 r/min离心10 min。在上清液中加入5 mL配置好的考马斯亮蓝试剂,混匀静置5 min后在595 nm下测量其吸光度。
1.2.7 碱性磷酸酶的测定 参照肖香[17]等的方法并做一些改动,铜绿假单胞菌培养至对数期,在菌悬液中加入MIC、MBC浓度的3-蒈烯溶液,无菌水作为空白对照组。分别在加入抑菌物质的0、2、4、6、8 h取出菌悬液,4000 r/min 离心 10 min,按照试剂盒说明书测定上清液中碱性磷酸酶（AKP）的含量。
1.2.8 膜电位的测定 采用罗丹明123荧光染色法[18]。铜绿假单胞菌在液体培养基培养 24 h,将菌液浓度调整为106~107 CFU/mL。加入3-蒈烯使其终浓度为MIC、MBC,无菌水作为空白对照组,于37 ℃、150 r/min 振荡培养 3 h后,离心弃上清,再用PBS（0.01 mol/L ）洗涤。罗丹明123溶解在PBS缓冲液（0.01 mol/L）中得到浓度为1 mg/mL的母液,加入菌液中使其终浓度为2 µg/mL,在黑暗中孵育30 min。将菌液用PBS缓冲液（0.01 mol/L）充分洗净,重悬。使用荧光分光光度计在480和530 nm的激发和发射波长处使用荧光分光光度计测定平均荧光强度,狭缝宽度设置为10 nm, 数据用平均荧光强度（MFI）表示。
1.2.9 呼吸链脱氢酶的测定 参照陶文卿[19]的方法并做一些改动,铜绿假单胞菌培养至对数末期,取1 mL菌悬液加入试管中,然后依次加入 Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L,pH 8.6）2 mL、0.1 mol/L葡萄糖溶液2 mL和1 mg/mL的TTC溶液2 mL并摇匀。加入3-蒈烯使其终浓度为MIC、MBC,无菌水作为空白对照组,将试管置于37 ℃培养箱中孵育5 h后,在各试管中滴加2滴浓H2SO4终止反应,然后分别加入5 mL正丁醇萃取,使产物完全进入上层,静置分层后取上层液体4000 r/min离心10 min,以正丁醇作为参照在490 nm处测量其吸光度。
1.3 数据处理
所有实验重复3次,数据采用DPS软件的单因素方差分析进行差异显著性分析（p<0.05）,并使用 Origin 9.0软件绘图。
2 结果与分析
2.1 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度
3-蒈烯对铜绿假单胞菌具有抑菌作用,且抑菌作用较强。实验结果表明,最小抑菌浓度（MIC）为20 mL/L,最小杀菌浓度（MBC）为40 mL/L,为MIC的2倍。空白对照和阴性对照组24 h后均观察到有菌生长,说明无法抑制铜绿假单胞菌。
2.2 3-蒈烯对铜绿假单胞菌生长的影响
在研究3-蒈烯抑菌活性的基础上,测定了铜绿假单胞菌的生长曲线。由图1可知,3-蒈烯对铜绿假单胞菌生长的影响。随着培养时间的延长,对照组细菌持续生长、增殖,细菌的干重总体呈上升趋势,从(0.47±0.02)mg/mL增长至(1.12±0.01)mg/mL。当加入终浓度为MIC和MBC的3-蒈烯后,铜绿假单胞菌的生长曲线发生显著变化,菌体干重在前2 h内发生明显下降,之后下降速度趋缓。生长曲线可以部分反映细菌在一定的生长环境中生长繁殖的规律。结果表明,3-蒈烯对铜绿假单胞菌的生长存在较好的抑制效果,能够减缓甚至完全阻止细胞增殖。
2.3 3-蒈烯对铜绿假单胞菌形态的影响
3-蒈烯对铜绿假单胞菌的形态影响如图2所示。由图2A1、图2A2可知,空白对照组的铜绿假单胞菌菌体细胞结构完整,表面光滑,大小分布均匀。根据图2B1和图2B2,经乙醇处理4 h和8 h后,铜绿假单胞菌的形态没有明显变化,表明乙醇对细菌形态没有影响。相比之下,使用3-蒈烯处理的铜绿假单胞菌发生明显的形态学损伤。如图2C1、图2D1,在加入浓度为MIC和MBC的3-蒈烯培养4 h后,部分细胞变短、断裂,细胞发生堆叠、粘附现象。3-蒈烯处理8 h后,细胞发生明显变化,其形态受到严重破坏。大部分细胞发生弯曲、凹陷、畸形,细胞破裂（图2C2、图2D2）。此外,添加MBC的3-蒈烯的细菌损伤更严重,更多的细胞发生堆积和粘附,失去其原有形态。该结果与蛋白质泄漏的测试结果一致。
图2 铜绿假单胞菌的扫描电镜图A1、B1、C1、D1：4 h处理后的空白对照组、乙醇对照组、MIC组、MBC组;A2、B2、C2、D2：8 h处理后的空白对照组、乙醇对照组、MIC组、MBC组。 Fig. 2 Scanning electron microphotographs of Pseudomonas aeruginosa A1, B1, C1, D1: blank control group, ethanol control group, MIC group, MBC group after 4 h treatment;A2, B2, C2, D2: blank control group, ethanol control group, MIC group, MBC group after 8 h treatment. |
2.4 3-蒈烯对铜绿假单胞菌电导率的影响
3-蒈烯对铜绿假单胞菌电导率的影响如图3所示,未添加抑菌物质的对照组先上升,后期保持平稳并略有增加,这是因为细菌的正常裂解和死亡。用3-蒈烯（MIC和MBC）处理后,电导率均高于对照组,在前100 min电导率快速增加,总体呈上升趋势,MIC组的电导率从(1514.00±8.19)µs/cm 上升到(1629.50±6.36)µs/cm,MBC组的电导率从(1520.67±16.80)µs/cm 上升到(1706.00±7.21)µs/cm。而且,MBC组的电导率显著高于MIC组。
2.5 3-蒈烯对铜绿假单胞菌蛋白释放的影响
3-蒈烯对铜绿假单胞菌蛋白质释放的影响如图4所示。用MBC和MIC浓度处理的铜绿假单胞菌上清液中的蛋白质浓度均显著高于对照组（p<0.05）。从0 h到12 h,对照组的蛋白浓度从(0.048±0.001)mg/mL变为(0.073±0.002)mg/mL,略有提高,MIC组的蛋白质浓度从(0.052± 0.003)mg/mL 大幅增加至(0.232± 0.022)mg/mL,MBC组的蛋白浓度从(0.044± 0.003)mg/mL大幅增加至(0.197±0.019)mg/mL。在6 h,MBC组的蛋白浓度达到最大,为MIC组的1.18倍。
蛋白质作为一种大分子物质,存在于细胞内部,是细胞关键的结构组件。蛋白质的泄漏可以反映细胞膜完整性的损伤情况[25]。本研究结果显示3-蒈烯破坏了铜绿假单胞菌的细胞膜结构,引起蛋白泄漏,对细胞膜完整性造成了不可逆的损伤,和扫描电镜结果相呼应。
2.6 3-蒈烯对铜绿假单胞菌胞外碱性磷酸酶含量的影响
2.7 3-蒈烯对铜绿假单胞菌膜电位的影响
图6表明,3-蒈烯对铜绿假单胞菌膜电位（MP）有显著影响。未添加3-蒈烯的对照组的平均荧光强度是(522.15±13.03)AU,添加3-蒈烯至终浓度为MIC和MBC后,荧光强度分别急剧下降至(319.41±10.10)AU和(211.77±17.72)AU,跟对照组比较,分别减少了38.19%和59.44%, 差异极显著（p<0.01）。而且,MBC组和MIC组相比平均荧光强度也发生了显著降低,降幅为34.38%。说明随着3-蒈烯浓度增加,平均荧光强度呈下降趋势。
膜电位是指细胞膜内部和外部之间的电位差。维持正常的膜电位对于ATP的产生和保持细胞功能有重要意义[27]。罗丹明123作为染料,可以通过跨膜电位进入细胞基质,膜电位的大小可以通过其荧光强度表示。正常情况下,膜内的电压通常低于膜外,膜电位的降低意味着细胞膜的去极化,去极化会导致细胞代谢异常,影响ATP的产生。3-蒈烯的加入导致膜电位降低,引起细胞膜去极化,导致细胞代谢活性异常和细菌死亡。
2.8 3-蒈烯对铜绿假单胞菌呼吸链脱氢酶活性的影响
3-蒈烯对铜绿假单胞菌呼吸链脱氢酶活性的影响如图7所示,对照组在490 nm处的吸光值为0.397±0.029。随着3-蒈烯浓度的提高,铜绿假单胞菌在490 nm处的吸光值显著下降。当添加MIC和MBC的3-蒈烯时,吸光值分别下降至0.092±0.006和0.058±0.003,分别比对照组下降76.46%和85.32%。而且,MIC组的吸光值与MBC组相比下降了37.63%。表明490 nm处的吸光值随着3-蒈烯浓度的增加而降低。
呼吸链身为细胞的能量来源,对于真核生物,存在于线粒体中,对于原核生物如细菌,存在于细胞膜中。2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）作为一种小分子无色物质,能够透过细胞膜,被呼吸链脱氢酶作用还原成红色的三苯甲酰（TF）,该物质在490 nm处有最大吸收峰[28]。因此,可通过观察490 nm处吸光度的变化来研究铜绿假单胞菌呼吸链脱氢酶的活性。结果表明,3-蒈烯能够抑制铜绿假单胞菌呼吸链脱氢酶的活性,该抑制作用随着3-蒈烯浓度的提高更加明显。这说明,3-蒈烯可以通过破坏呼吸链的方式抑制铜绿假单胞菌的生长,进而杀死细菌。
3 讨论
本文初步探究了3-蒈烯对铜绿假单胞菌的抑菌活性及机理,表明3-蒈烯对铜绿假单胞菌有较好的抗菌活性,MIC和MBC分别为20和40 mL/L。张闻扬等[29]研究发现大叶桉叶挥发油的主要成分为3-蒈烯,该挥发油对常见致病菌包括沙门氏菌、绿脓杆菌和痢疾杆菌有良好的抑制作用。生长曲线实验表明,加入3-蒈烯后,铜绿假单胞菌的生长受到了抑制。由扫描电镜图片可知,铜绿假单胞菌原有的正常细胞形态发生改变。蛋白质和电解质的外泄表明3-蒈烯可能会损坏原有的细胞膜结构,破坏细胞膜的完整性,增加细胞膜的通透性,导致细胞内大分子物质向外泄漏。王芳等[30]报道,肉桂精油可以造成成团泛菌和腐生葡萄球菌细胞内容物的泄漏,破坏细胞膜完整性。加入3-蒈烯后,细菌的膜电位（MP）降低,可能使细胞发生去极化现象,引发不规则的代谢活动。与本研究结果类似,有研究发现黑胡椒精油可以导致大肠杆菌的细胞膜发生去极化现象[11]。此外,呼吸链脱氢酶活性下降,说明3-蒈烯可能对呼吸链造成损伤。这些变化最终导致细胞走向死亡。
本研究为进一步探索3-蒈烯对铜绿假单胞菌的抗菌机理奠定了基础,也为开发3-蒈烯为食品防腐保鲜剂提供了可能。