WD重复蛋白是一种调控蛋白超家族,具有丰富的多样性。迄今为止,在进行WD40蛋白的研究历程中,发现其广泛存在于真核生物,而在原核生物中很少出现[1]。据研究表明,WD40结构域通常以Trp-Asp结尾,并由40~60个保守的氨基酸残基组成[2]。WD40重复序列主要通过介导蛋白之间的相互作用来参与信号转导、mRNA剪接、组蛋白修饰和细胞周期调控等重要过程[3]。该超家族的成员在植物特异性发育过程中扮演着重要的角色,它们通过上游信号通路或下游效应因子来实现其功能特异性[4]。例如,在拟南芥中,AGB1（含有7个WD40重复蛋白）功能的丧失会导致果实缩短[5],下胚轴和根的细胞分裂模式发生改变[6]。综上所述,可见WD40超家族参与多种生物学功能的发生过程。
MSIL蛋白是WD重复蛋白大家族中的亚家族,也是形成参与染色质组装、基因转录调节和细胞分裂等各种生物途径的蛋白复合物的一部分[7]。大多数MSIL基因家族成员包含了7个WD40重复蛋白[8]。1989年,Ruggieri等[9]首次在酿酒酵母IRA1多拷贝抑制因子（multicopy suppressor of the iral mutation 1）中将MSI1筛选出来,并确定MSI1蛋白是酿酒酵母RAS介导的cAMP通路的负调控因子。据研究表明,MSIL基因在染色质重塑、细胞分裂和分化、植物开花调控、DNA损伤修复和信号转导等过程中发挥重要的生物学功能[8]。拟南芥中,该基因家族共有5个成员（AtMSI1-5）[8],其中,AtMSIL1是染色质组装因子-1（CAF-1）、组蛋白去乙酰化酶、多冠抑制复合体-2（PRC2）等多种复合物的亚基,分别参与染色质的组装、脱落酸（ABA）机制的微调、春化反应等过程,与拟南芥的营养状况和生殖发育密切相关[10,11,12];此外,Köhler等[13]还证明了AtMSIL1在拟南芥种子发育的过程中不可缺少。在拟南芥中,不仅AtMSI1扮演着重要的角色,AtMSI4在拟南芥生长发育的过程中也发挥着不可忽视的作用。例如,Pazhouhandeh等[14]通过研究表明,AtMSI4可以结合纤环泛素连接酶和CLF-PRC2复合物调控拟南芥的开花过程。此外,AtMSI4对植物的生长发育起促进作用,并参与某些生物和非生物的胁迫反应[15]。而关于AtMSI2、AtMSI3在拟南芥中发挥什么样的功能,目前研究较少,因此其生物学功能尚不能确定。此外,周群丰[16]对水稻MSIL的研究表明水稻MSIL基因可以控制细胞的分裂分化,而OsMSI1对DNA甲基化及组蛋白H3K27甲基化修饰有重要的影响。MSIL不仅在植物中发挥作用,在哺乳动物中也是必不可少的,如MSIL可形成MSIL-pRB复合物参与抑制E2F转录因子的靶基因的转录过程[17]。综上所述,MSIL基因家族有着丰富多样的生物学功能,在植物和动物的生长发育过程中发挥着不可忽视的作用。因此,有必要对龙眼MSIL基因家族进行进一步的分析,了解其在龙眼生长发育过程中发挥的作用。
龙眼（Dimocarpus longan Lour.）是一种常绿果树,属于无患子科。原产于亚洲温带和热带,在我国广泛种植于南部和东南亚地区[18]。龙眼胚胎发育状况影响其种子大小、果实品质及果实产量[19],因此,对龙眼胚胎发育调控进行研究是十分有必要的。在进行龙眼胚胎发育的研究过程中,本实验室提供的龙眼基因组[20]带来了巨大的便利。目前,对于龙眼胚胎发育的研究已经有了一些进展。例如,DlRan参与了生长素类似物（2,4-D）诱导的龙眼体细胞胚胎生长发育的过程[21],龙眼体细胞胚胎形态和结构的建立则需要很多的lncRNA共同参与[22]。对于MSIL基因家族在植物胚胎发育过程中所发挥作用的研究较少,Rossi等[7]通过实验探讨了ZmRbAp基因在胚乳早期分化的作用,发现ZmRbAp1参与了胚乳早期的形成,而且ZmRbAp基因可能有助于生殖器官细胞分裂和形态建成。由此推测,龙眼MSIL基因家族也有类似的生物学功能。因此,本文通过对龙眼基因组进行筛选,共获得6条龙眼MSIL基因即DlMSI1a、DlMSI1b、DlMSI1c、DlMSI2、DlMSI4a、DlMSI4b,并根据转录组对龙眼MSIL基因在不同胚性发生阶段和不同组织器官中的特异性表达进行分析,初步了解在体胚阶段与非体胚阶段龙眼MSIL基因表达的差异性。然后通过对龙眼MSIL基因家族成员的蛋白质理化性质、系统发育进化树、基因结构和蛋白质结构域以及启动子顺式作用元件进行分析,从而对龙眼MSIL基因的生物学功能有了初步的了解。最后,采用荧光定量PCR分析（qPCR）研究龙眼MSIL基因部分成员在不同激素浓度下的表达情况。以期为研究龙眼MSIL基因家族在龙眼体胚及生长和发育过程中的作用机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
实验室构建的龙眼基因组数据库（NCBI登录号：BioProject PRJNA305337）、龙眼转录组数据库（SRA050205）,在Uniprot（https://www.uniprot. org/）数据库中下载拟南芥（Arabidopsis thaliana）MSIL家族的基因序列和氨基酸序列,phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）数据库下载水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、苹果（Malus domestica）、大豆（Glycine max）、甜橙（Citrus sinensis）、马铃薯（Solanum tuberosum）、番茄（Solanum lycopersicum）MSIL家族的基因序列和氨基酸序列。
将实验室培养了20 d的生长发育较好的龙眼胚性愈伤组织作为材料,并选出0.5 g的松散、浅黄且颗粒较细的龙眼愈伤组织作为不同激素处理的备用材料。首先选取5个干燥洁净的锥形瓶,然后加入50 mL的MS液体培养基,再分别加入浓度为0、2.5、12.5、62.5 mg/L的赤霉素激素,把选好的愈伤组织接种于配好的液体培养基中,在25 ℃、110 r/min的摇床中,黑暗培养24 h。最后收集上述处理的材料,用液氮速冻后保存在-80 ℃的冰箱中,用于荧光定量分析[23]。
1.2 方法
1.2.1 DlMSIL家族成员的鉴定和进化树的构建 为鉴定龙眼MSIL基因家族成员,首先采用Conserved Domains Database（CDD;https:// www. ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）对拟南芥MSIL氨基酸序列的蛋白结构域进行初步分析,再通过TBtools[24]进行绘制,最后根据获得的拟南芥MSIL保守结构域并结合NCBI Blast同源比对结果,进行龙眼MSIL基因家族成员的筛选,筛选过后共获得6条龙眼MSIL候选序列。
通过CDD进行龙眼MSIL候选序列和AtMSI1序列的蛋白结构域分析,再采用TBtools软件对龙眼MSIL候选序列的蛋白结构域进行绘制;利用DNAMAN对龙眼MSIL候选序列和AtMSL1蛋白序列进行同源性对比;采用MEGA 5.05软件对龙眼、拟南芥、水稻、玉米、苹果、大豆、甜橙、马铃薯、番茄的MSIL蛋白家族序列进行序列对比并手动删除同源性相差较大的序列,然后通过邻近法（Neighbor-joining method）构建系统进化树,将自展法系数（Bootstrap）设置为1000次进行重复检验。采用同样的方法,单独对龙眼MSIL基因家族成员进行系统进化树的构建。
1.2.2 DlMSIL基因结构以及蛋白结构域分析 通过GSDS在线分析龙眼MSIL家族成员基因结构中内含子与外显子的数量和位置;通过ExPASy、SignalP4.0在线分析龙眼MSIL家族成员氨基酸序列的等电点（pI）、蛋白质分子量（Mw）、氨基酸数目以及N端信号肽;通过NetNGlyc在线分析DlMSIL家族成员氨基酸序列的糖基化位点（Threshold=0.5）;通过MEME对DlMSIL家族成员进行motif分析,然后再通过TBtools将得到的motif结果进行进一步绘制。
1.2.3 DlMSIL基因的启动子分析 采用Plant care在线网站分析龙眼MSIL家族成员的启动子特征以及顺式作用元件的特点,然后再采用GraphPad Prism软件对顺式作用元件进行统计分析,从而对DlMSIL家族成员的顺式元件有更加深入的了解。
1.2.4 DlMSIL基因家族成员在不同体胚阶段、不同器官及不同激素处理下的特异性表达 利用在龙眼转录组数据库中提取的DlMSIL家族成员在不同体胚发生阶段即非胚性愈伤组织（non-embryonic callus,NEC）、不完全胚性紧实结构（incomplete compact pro-embrogenic cultures,ICpEC）、球形胚（globular embryos,GE）和不同组织器官即种子、根、茎、叶、花蕾、果肉、幼果、果皮以及不同激素（2,4-D、2,4-D-KT、KT、MS）中特异表达的FPKM值,通过TBtools制作热图,以便了解该基因家族成员在不同体胚阶段、不同器官及不同激素处理下的差异性表达。
表1 用于RT-PCR的基因特异性引物序列Tab. 1 Sequences of gene-specific primers used for RT-PCR |
| 基因ID | 基因名称 | 正向引物（5°-3°） | 反向引物（5°-3°） |
|---|---|---|---|
| Gene ID | Gene name | Forward primer (5°-3°) | Reverse primer (5°-3°) |
| Dlo_007184.1 | DlMSI1a | TGATGACGACCGCTCTGACTAC | GGAGGCTTAGAAGGGTGTTTGC |
| Dlo_032972.1 | DlMSI1c | CGCAAAGTGGCTCATCAGGGAT | AGCACCTCCTTGGTTGACTTCC |
| Dlo_011645.2 | DlMSI4a | TTGCCATCCCTGTGAGTCTTGC | CCGCCTCTGTGCTTGCTTGATT |
| — | EF-1a | GATGATTCCCACCAAGCCCAT | GGGTCCTTCTTCTCAACACTCT |
2 结果与分析
2.1 DlMSIL家族基因鉴定与蛋白质理化性质分析
共鉴定出6条龙眼MSIL基因家族成员,根据NCBI Blast同源比对结果,分别命名为DlMSI1a、DlMSI1b、DlMSI1c、DlMSI2、DlMSI4a、DlMSI4b。
蛋白质理化性质分析结果表明,该基因家族成员编码393~551 aa氨基酸且平均氨基酸数为478 aa,6条DlMSIL蛋白的分子量在44 725.51~ 62 352.21 u之间,等电点在4.68~7.62之间;SignalP在线网站结果显示,龙眼MSIL均不含信号肽,这表明龙眼MSIL均不属于分泌蛋白（表2）。
表2 DlMSIL家族成员蛋白质理化性质Tab. 2 Physicochemical properties of proteins in DlMSIL family members |
| 基因ID Gene ID | 基因名称 Gene name | 氨基酸数目 Amino acid number/aa | 蛋白质分子量 Protein molecular weight/u | 等电点 Isoelectric point | 信号肽 Signal peptide |
|---|---|---|---|---|---|
| Dlo_007184.1 | DlMSI1a | 546 | 62 352.21 | 5.14 | NO |
| Dlo_007186.2 | DlMSI1b | 393 | 44 725.51 | 4.68 | NO |
| Dlo_032972.1 | DlMSI1c | 474 | 51 750.54 | 4.99 | NO |
| Dlo_024259.1 | DlMSI2 | 402 | 45 403.65 | 4.69 | NO |
| Dlo_011645.2 | DlMSI4a | 551 | 60 430.90 | 7.62 | NO |
| Dlo_030294.2 | DlMSI4b | 502 | 55 305.00 | 6.10 | NO |
2.2 DlMSIL家族成员的系统进化树分析
为了进一步了解龙眼MSIL家族与其他物种的亲缘关系和进化距离,通过MEGA5.05对1种种子植物（大豆）,3种裸子植物（拟南芥、水稻、玉米）,还有4种被子植物（苹果、甜橙、马铃薯、番茄）以及龙眼的MSIL氨基酸序列进行系统进化树的构建（图1）。参考拟南芥的分类方式[8]并结合同源比对结果,将6条龙眼MSIL家族成员初步分成3类。第1类的成员为DlMSI1a、DlMSI1b、DlMSI1c,第2类为DlMSI2,第3类为DlMSI4a、DlMSI4b。除此之外,还发现在龙眼MSIL家族中DlMSI1a、DlMSI1b与AtMSI1的同源性最高,这可能说明DlMSI1a、DlMSI1b与AtMSI1出现功能冗余的情况。DlMSI1c单独分为一支,这可能是因为龙眼MSIL家族在进化过程中出现了功能分化,因此导致DlMSI1c与拟南芥的MSI1同源性低,却与其他物种的MSI2同源性更高。
2.3 DlMSIL基因结构以及蛋白结构分析
为了进一步了解龙眼MSIL基因家族成员的基因结构和功能特征,通过比较该基因家族成员的cDNA与相应基因组的DNA序列,确定了6条候选基因的内含子、外显子数量以及位置（图2）。结果显示,龙眼MSIL基因家族成员的第1条内含子均分布在成熟编码序列内部,且外显子将内含子分隔开,使得信号序列与编码序列能够有序地排列。结果显示,龙眼MSIL基因家族成员内含子数目在4~14个,其中DlMSI4a、DlMSI4b 所包含的内含子数目最多且均为14个,DlMSI1b所包含的内含子数目最少为4个,DlMSI1a有7个,DlMSI12有5个,而DlMSI1c有11个。除此之外,结果还显示该基因家族成员的基因长度存在较大差异,DlMSI4b的基因长度最长,而DlMSI1c最短,这些都可能导致该基因家族中各成员之间的功能有所不同。
为了进一步了解龙眼MSIL家族成员氨基酸序列保守结构域的基本情况。从而利用MEME在线搜索20个motif（图3）,其结果显示6条龙眼MSIL序列都含有motif1、motif2、motif5、motif6,表明了这4个基序是龙眼MSIL家族的保守基序。除此之外,还发现DlMSI1a、DlMSI1b均含有motif11、motif12、motif13、motif14这4个基序;DlMSI4a、DlMSI4b均含有motif8、motif9、motif15这3个基序;而DlMSI1c含有的基序最少,除了具有4个保守基序外,只含有motif10、motif17、motif18、motif20这4个基序。DlMSI2、DlMSI1c不含特殊基序,这可能与他们的功能同其他龙眼MSIL基因家族成员的功能冗余有关。DlMSI1c与DlMSI1a、DlMSI1b所含有的基序十分不同,这说明同一类别的龙眼MSIL家族成员的功能也会有所不同并具有特殊性。
图3 DlMSIL家族成员蛋白motif分析Motif1: EEAASPKVKIIQKINHDGEVNRIRYMPQNPKIVATKTDSPEVYIFDYSKH; Motif2: RQIYKGHEGVVEDVAWHPSHEYLFGSVGDDSYLJIWDlRTG; Motif3: EYKIWKKNTPFLYDlVITHALEWPSLTVRWLPDREZPPYKB; Motif4: PELLFTHGGHRDKISDFSW-NP SEPWVIASVADDNILQIWGM; Motif5: VQSVKAHQADVNCIAWNPYBEWILATGSTDNTVKLFDlRKL; Motif6: GACSPDlRLRGHTAEGYGLSWSPFKEGHLLSGSDDALICLWDINATGKNK; Motif7: VQKLILGTHTDENEPNYLMIANCZLPKPDTLQIWR-MIDlIYRPEEEVLAELDKFKSH; Motif8: FALAMCPTEPFVLSGGKDKSVILWSIQDH; Motiff9: SHKEEVFQVEWBPN; Motif10: NETVLASSADDRRLKVWDlSRI; Motif11: EEEMRGEIEERLINE; Motif12: NDARHYDDDRSDY; Motif13: AENIYHDEDDlPGDDESTKG; Motif14: EQTPEDAEDGP; Motif 15: VAAAEHISQFN; Motif16: MKERGKECER; Motif17: TALHTF; Motif18: E-FKHNLY; Motif19: PCLKTLP; Motif20: QKDlKELHWH. Fig. 3 DlMSIL family member protein motif analysis |
通过CDD蛋白结构域预测,结果显示龙眼MSIL都含有CAF1C_H4-bd和WD40蛋白结构,这体现了CAF1C_H4-bd和WD40蛋白结构的保守性,且该基因家族成员均属于CAF1C_H4-bd和WD40超家族（图4）。仅DlMSI4b蛋白具有Ost5结构域,这可能导致DlMSI4b具有不一样的功能。除此之外,还可以看出同一类的龙眼MSIL家族成员的CAF1C_H4-bd和WD40保守结构域所分布的位置差异不大。通过CDD进一步分析,结果显示龙眼MSIL蛋白的CAF1C_H4-bd保守结构域的长度均为69 bp,而且该基因家族成员蛋白含有5~6个WD重复单元的蛋白,其中DlMSI1a、DlMSI2、DlMSI4a含有6个,而DlMSI1b、DlMSI1c、DlMSI4b含有5个,而拟南芥AtMSI1蛋白序列所含有的WD重复蛋白数量与DlMSI1a、DlMSI2、DlMSI4a相同。通过DNAMAN进行龙眼MSIL蛋白与拟南芥AtMSI1蛋白进行多序列对比（表3）,结果显示,AtMSI1与龙眼MSIL的同源性依次为68.37%、81.65%、25.89%、52.69%、23.15%和21.36%,由此可见,DlMSI1b与AtMSI1同源性最高,因此进一步推测DlMSI1b与AtMSI1可能具有类似的功能。
图4 DlMSIL家族成员氨基酸序列的保守结构域Fig. 4 Conserved domains of amino acid sequences of DlMSIL family members |
表3 拟南芥AtMSI1蛋白与DlMSIL蛋白多序列对比Tab. 3 Comparison of Arabidopsis AtMSI1gene and DlMSIL sequence |
| 拟南芥基因 Arabidopsis thaliana gene | 龙眼基因 Longan gene | 相似性 Similarity/% |
|---|---|---|
| AtMSI1 | DlMSI1a | 68.37 |
| AtMSI1 | DlMSI1b | 81.65 |
| AtMSI1 | DlMSI1c | 21.36 |
| AtMSI1 | DlMSI2 | 52.69 |
| AtMSI1 | DlMSI4a | 25.89 |
| AtMSI1 | DlMSI4b | 23.15 |
2.4 DlMSIL基因家族成员启动子分析
为了进一步了解龙眼MSIL基因家族成员的基因表达调控基本情况,通过Plant Care在线网站对龙眼MSIL基因上游2000 bp的启动子区域进行了顺式元件分析。结果表明,龙眼MSIL基因家族成员均含有CAAT-box和TATA-box,并且CAAT-box均多于TATA-box,这表明该基因家族成员均能正常转录（图5）。
为了更好的了解龙眼MSIL基因家族成员的生物学功能,对该基因家族成员的主要启动子的顺式作用元件进行了分析（图6）。结果表明,龙眼MSIL基因家族成员均含有光响应元件、增强子顺式作用元件及在转录起始位点-30附近的核心启动子响应元件,并且在转录起始位点-30附近的核心启动子响应元件含量最多。大部分龙眼MSIL基因家族成员具有厌氧诱导响应元件,参与赤霉素、水杨酸的激素应答以及低温胁迫;50%的基因响应茉莉酸甲酯、脱落酸的激素应答以及玉米醇溶蛋白的代谢调控,还含有光胁迫和干旱胁迫下MYB转录因子的结合位点;33.3%的基因具有生长素响应元件和防御与应激响应元件。此外,与黄酮类化合物生物合成相关基因调控的MYB转录因子结合位点只存在DlMSI1a基因中,参与昼夜控制的顺式作用调控元件和在α-淀粉酶启动子中保守的序列只存在于DlMSI4a基因中,只有DlMSI2基因具有MYBHV1结合位点,只有DlMSI4b具有缺氧特异性诱导响应。由此可见,龙眼MSIL基因家族成员具有大量的光响应元件、激素响应元件、胁迫响应元件以及其他参与植物生长调节的顺式响应元件。不同的成员所包含的顺式作用元件及其数量有所不同,这可能导致不同成员产生的光周期效应不同,对不同的胁迫响应具有一定的区别,参与龙眼生长过程中相关的激素应答存在显著差异,并且不同成员对龙眼生长过程中有不同的特异性功能。而特有的顺式调控元件,则可能导致龙眼MSIL基因家族成员之间出现功能特异性的情况。
2.5 DlMSIL基因家族成员在不同体胚阶段和不同器官中特异性表达分析
为了解龙眼MSIL基因在不同体胚阶段和不同器官的特异性表达,利用TBtools制作了热图（图7）。结果显示,不同体胚发生过程中,龙眼MSIL基因在ICpEC阶段中均表现为上调表达;在NEC阶段中只有DlMSI1c上调表达;在EC阶段DlMSI1b、DlMSI1c下调表达,其余龙眼MSIL基因家族成员均上调表达;在GE阶段中只有DlMSI1c下调表达。由此可见,龙眼MSIL基因家族成员在体胚发生阶段总体呈现上调表达的趋势,这可能与龙眼MSIL基因家族成员在体胚发生阶段具有重要功能有关。除此之外,发现DlMSI1c在不同体胚发生过程中与大部分龙眼MSIL基因发生表达的不同,这可能与DlMSI1c基因在体胚发生过程中不同的生物学功能有关。
在不同组织器官中,龙眼MSIL基因家族成员在种子、花、花蕾、果皮均表现为下调表达;在幼果中DlMSI1a、DlMSI1b、DlMSI1c上调表达,DlMSI2、DlMSI4a、DlMSI4b下调表达;在叶子中,只有DlMSI1c上调表达,其余龙眼MSIL基因均下调表达;在果肉中,DlMSI1a、DlMSI4a下调表达,DlMSI1b、DlMSI1c、DlMSI2、DlMSI4b上调表达;在根中,DlMSI1a、DlMSI1b、DlMSI4a下调表达,DlMSI1c、DlMSI2、DlMSI4b上调表达;在茎中,DlMSI1b、DlMSI1c上调表达,其余均下调表达。由此可见,龙眼MSIL基因在组织器官中总体呈现下调表达。
综上所述,从体胚阶段到非体胚阶段龙眼MSIL基因总表达水平呈现一种逐渐降低的趋势,暗示龙眼MSIL基因可能更多参与龙眼植株的体胚阶段。龙眼MSIL基因在体胚发生阶段发挥着重要的作用,其中在不完全胚性阶段均表达,大部分成员在胚性阶段表达,而在非胚性阶段有5个成员不表达,这体现出龙眼MSIL基因在胚性阶段和非胚性阶段的显著差异;在组织器官中,大部分龙眼MSIL基因不表达,尤其在种子、花、花蕾、果皮中均不表达,也可能是由于龙眼MSIL基因较少参与组织器官的形态建成。
2.6 DlMSIL基因家族成员在不同激素下的表达模式分析
为了解DlMSIL基因家族成员在不同激素下的特异性表达,通过TBtools制作了热图（图8）。结果显示,龙眼MSIL基因家族成员在2,4-D与2,4-D-KT激素处理下,均呈现下调表达;而在KT与MS激素处理下,均呈现上调表达。推测2,4D可能抑制龙眼MSIL基因家族成员的表达,KT与MS则促进龙眼MSIL基因家族成员的表达。
研究龙眼EC阶段中DlMSIL1a、DlMSI1c、DlMSI4a在不同浓度的赤霉素（GA3）中的特异性表达,结果如图9所示。在GA3不同浓度的处理下,DlMSI1a和DlMSI1c在不同GA3浓度处理下的表达均呈现先上升后下降的趋势,由此可见在低浓度处理下对DlMSI1a和DlMSI1c具有上调表达作用,而高浓度处理具有下调表达作用,且在GA3浓度为2.5 mg/L时相对表达量达到最大值,总体表现为下调表达,区别是DlMSI1c的表达随着GA3浓度变化的幅度较小; DlMSI4a的相对表达量呈现为先下降再上升最后下降的趋势,DlMSI4a表达的变化幅度较大,较低的GA3浓度时其表现为下调表达,较高浓度则表现为上调表达。此外,DlMSI4a在GA3浓度为12.5 mg/L时相对表达量达到最大值,因此可以认为在GA3浓度为12.5 mg/L的处理下最利于DlMSI4a进行转录。随着GA3浓度的改变DlMSI4a变化幅度剧烈的表达模式,暗示其受到GA3浓度的调控作用。
3 讨论
3.1 DlMSIL基因家族成员的功能可能具有多样性
CAF1C_H4-bd是CAF1复合物的亚基,而CAF-1是一种保守的杂三聚体蛋白复合物,促进主要的组蛋白H3复制依赖的核小体组装。在DNA复制与损伤修复过程中,CAF-1主要参与染色质的形成[26]。研究发现,在果蝇中,最大的亚基CAF-1 p180是控制异染色质形成和维持表观遗传的重要因素[27]。在拟南芥中,AtMSI1与RDR1结合抑制雌配子中MET1的表达,从而导致印记基因FIS2/FWA不能被甲基化修饰,而影响胚乳的形成[28]。前面我们已经知道,WD40超家族具有多种生物学功能。结合蛋白结构分析,结果显示龙眼MSIL家族成员均属于WD40超家族和CAF1C_H4-bd超家族,且AtMSI1与DlMSI1a、DlMSI1b、DlMSI2的蛋白序列的同源性较高,推测DlMSIL在龙眼的生长与发育过程中可能参与染色质组装、胚乳发育等生物学途径。再结合启动子顺式元件分析,结果显示龙眼MSIL基因家族具有干旱胁迫和光胁迫下MYB转录因子的结合位点,暗示龙眼MSIL基因可能受MYB转录因子调控途径作用,从而增强抵抗逆境胁迫的能力。
3.2 DlMSIL基因家族成员可能在龙眼胚胎发育过程中起着关键作用
迄今为止,已有研究表明MSIL基因家族成员在胚胎生长发育的过程中发挥着不可忽视的作用。如拟南芥AtMSI1同FIE、MEA共同构成FIS复合物,而FIS复合体中的任何一个亚基的缺乏都会导致与受精无关的种子发育和种子败育,Köhler等[13]的研究结果表明AtMSI1对拟南芥种子发育的正确起始和发展过程有着举足轻重的作用。后来,Dumbliauskas等[29]还发现AtMSI1与CUL4-DDB1结合形成控制胚乳形成和维持MEDEA亲本印记过程的蛋白复合物。根据我们对龙眼MSIL基因家族成员在不同胚性发生阶段和不同器官中的特异性表达结果可知,DlMSIL在胚性发生阶段具有明显的上调表达,尤其是在胚胎发育的成熟阶段表现出较高的表达,而在不同器官中DlMSIL的表达显著下调。因此,我们推测DlMSIL基因家族是胚胎生长和发育过程中的关键调节因子。此外,值得注意的是,在体胚发生阶段中,DlMSI1c的表达与大部分DlMSIL基因成员相反,在NEC阶段中其他DlMSIL基因成员表现为下调表达,DlMSI1c则表现为上调表达;在GE阶段中其他DlMSIL基因成员表现为上调表达,DlMSI1c则表现为下调表达。由此推测,在龙眼DlMSIL基因中,只有DlMSI1c参与龙眼胚胎体细胞的发生过程,而其他DlMSIL基因成员则主要参与胚胎的发育过程。
3.3 DlMSIL基因家族成员可能参与多种植物激素信号通路和某些非生物胁迫
DlMSIL基因家族中有50%以上的成员具有赤霉素响应元件。赤霉素是调节植物细胞伸长的主要激素之一,如果缺乏赤霉素会导致植物生长矮小[30]。而周群丰[16]经研究表明油菜素内酯和赤霉素的信号转导过程中受阻可能造成植株矮化。本研究就不同GA3浓度对DlMSI1a、DlMSI1c及DlMSI4a进行了定量表达研究,结果表明,DlMSI1a与DlMSI1c在高浓度时其表达模式表现为抑制作用,而DlMSI4a在不同浓度处理下其表达模式呈现先下降后上升再下降的趋势,表明DlMSI4a的表达容易受到GA3浓度的调控,因此推测DlMSIL可以通过赤霉素信号通路在种子生长和发育过程中发挥作用。除此之外,DlMSIL基因家族还具有脱落酸、茉莉酸甲酯、赤霉素、水杨酸等激素应答响应元件。由此推测,DlMSIL基因成员参与多种激素信号传递。
根据Mehdi等[11]研究表明,MSI1与组蛋白去乙酰化19（HDA19）属于一个复合体,MSI1或HDA19可以都反向调控ABA的敏感性和盐胁迫的耐受性。此外,ABA还是对非生物胁迫的主要介质。因此根据我们对龙眼MSIL基因家族成员启动子顺式作用元件的分析,我们可知该基因家族有50%的成员具有ABA响应元件,从而初步推测龙眼MSIL基因家族部分成员可以调控ABA的敏感性和盐胁迫的耐受性。除此之外,在龙眼MSIL基因家族中,50%及以上成员具有低温应激、厌氧胁迫、光胁迫和干旱胁迫等非生物胁迫响应元件,由此我们猜测龙眼MSIL基因参与植株生长发育过程中的非生物胁迫过程。Kim等[31]通过研究得知,AtMSI4/FVE在调控植物开花和抗寒胁迫方面具有双重作用,这种作用可能为植物提供进化适应性。此外,面对非最佳环境状态时,植物利用大量的转录反应来面对某些非生物胁迫,这些转录调控在很大程度上受染色质控制[32],而MSIL基因家族又是参与染色质组装的蛋白复合物的一部分,并且该基因家族部分成员具有非生物胁迫响应元件,因此,我们猜测龙眼MSIL基因家族部分成员在多种非生物胁迫上发挥着不可忽视作用。
除此之外,龙眼MSIL基因家族成员均含有大量的光响应元件,这说明该基因家族在光响应过程中发挥着举足轻重的作用。不难发现,在龙眼MSIL基因家族中,只有DlMSI4a具有参与昼夜控制的顺式作用调控元件,因此我们推测该成员在调节植物昼夜节律上发挥重要的作用。同时只有DlMSI1c具有与黄酮类化合物生物合成相关基因调控的MYB转录因子结合位点,因此在龙眼生长发育过程中,该成员可能参与种子成熟或者果皮成色阶段。
总之,龙眼MSIL基因家族成员在体胚阶段如何应对多种生物胁迫,如何参与激素响应以及在龙眼生长发育及代谢中如何起作用还需要进一步深入研究。