千层金（Melaleuca bracteata）,又名黄金宝树、黄金香柳,属桃金娘科白千层属,为常绿小乔木或灌木。千层金适生范围广、生长速度快、分枝性能好且耐修剪,是一种很受欢迎的色叶乔木,不仅可用于庭园景观、道路美化、小区绿化,还可用于林相改造,在园林上应用越来越广泛。除观赏价值外,千层金还有很多药用保健价值。人们在烹饪时常用千层金枝叶包裹食物以增香,也有人将其加工成床席作为保健用品,南非德班市当地居民还将其作为一种传统药用植物,通过咀嚼其嫩叶来缓解头痛及其他疾病[1,2,3]。此外,千层金叶片精油具有很强的杀螨活性和抑制萝卜种子生长的能力[4]。
目前,国内外对于千层金的研究报道较少,主要集中在栽培技术、组织培养以及精油相关方面的研究,关于其叶片醇提物抗氧化活性的研究尚未见报道。自由基对人体健康影响极大,它可损害机体的组织和细胞,引起衰老,诱发癌症、动脉粥样硬化等多种疾病[5,6,7]。凡能够干扰自由基连锁反应的引发或扩散过程,抑制自由基反应过程的任何一种物质,均称为自由基清除剂或抗氧化剂[8]。化学合成抗氧化剂如二丁基羟基甲苯（BHT）、抗坏血酸（VC）、丁基羟基茴香醚（BHA）等曾一度受到青睐,但这些人工合成化学试剂存在一定的致畸、致癌和毒性等安全性问题[9,10,11]。因此,研究开发安全、广谱、高效的天然抗氧化剂成为当前研究热点之一。本文研究了千层金叶片醇提物及其不同极性部位的总多酚含量和抗氧化活性,并分析了二者的相关性,旨在为千层金的进一步研究和开发利用提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 千层金枝叶采自广东省清远市龙塘镇鸡心岛。
1.1.2 主要试剂 DPPH（2,2-dipheny-1-picryl hydrazyl）、ABTS（2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)）、BHT（butylated hydroxytoluene）均购自美国Sigma-Aldrich公司;抗坏血酸、没食子酸标准品、高硫酸钾、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、亚硝酸钠、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、Tris、盐酸、邻苯三酚、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等试剂均为分析纯。
1.1.3 主要仪器 紫外/可见分光光度计（U- 2900,日本Hitachi公司）、离心机（5810R,德国Eppendorf公司）、电子分析天平（BAS224S,德国Sartorius公司）、振荡器（MS3basic,德国IKA公司）、摇床（HYG-B,苏州培英实验设备有限公司）、电热恒温水浴锅（DK-S24,上海精宏实验设备有限公司）、旋转蒸发仪（N-1001,日本EYELA公司）、超级智能恒温循环器（DTY-5A,北京德天佑科技发展有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 千层金叶片醇提物的制备 将新鲜的千层金枝叶洗净晾干,摘取叶片,冻干粉碎,过40目筛;称取一定量的千层金叶片粉末,在温度30 ℃、转速180 r/min、甲醇体积分数为75%、料液比为1∶10条件下,用摇床震摇提取48 h后过滤,滤渣按上述条件重复提取1次,合并滤液,于40 ℃下减压浓缩至膏状物质,取部分冷冻干燥,得到75%甲醇粗提物（ME）的干样,用75%甲醇配成溶液备用。
1.2.2 千层金叶片醇提物不同极性部位的萃取 取1.2.1中剩余的膏状物质,加水悬浮,摇匀后,依次分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行等体积萃取,各萃取3次,每次1 h,合并相同溶剂萃取液,分别在40 ℃下减压浓缩并冷冻干燥,得到石油醚相（PE）、乙酸乙酯相（EVE）、正丁醇相（BE）以及水相（WE）,其中,PE、EVE用无水甲醇溶解,其他极性部位用75%甲醇配成溶液备用。
样品总多酚含量的测定：将样液稀释适当的倍数,按标准曲线项下方法测定吸光值。将吸光值代入标准曲线方程计算样品中总多酚含量,结果以等量的没食子酸表示（mg/g）。
1.2.4 ABTS+自由基清除能力的测定 参考Re等[14]的方法,略加改进。精确称取ABTS和高硫酸钾（K2S2O8）分别用蒸馏水溶解并混合,使其终浓度分别7 mmol/L和2.45 mmol/L,在室温、暗处下静置12~16 h,即ABTS+储备液。试验时将ABTS+储备液用磷酸缓冲液（10 mmol/L,pH 7.4）稀释至OD734nm=0.700±0.020,形成ABTS+测定液。吸取不同浓度样液50 μL,加入750 μL ABTS+测定液,充分振荡后静置6 min,在734 nm处测定吸光度。为确保试验精确,需扣除样品溶液本身的吸光度,因本试验样品稀释液本身吸光度几乎为零,可忽略。以VC为阳性对照,根据公式计算清除率及IC50值（当清除率为50%时的样品浓度）。
清除率=[(A0-A1)/A0]×100%
其中,A0为ABTS+测定液加样品溶剂的吸光值,A1为样品吸光度。
1.2.5 还原力测定 参考Wannes等[15]的方法,往离心管中加入1 mL样液,然后依次加入2.5 mL 浓度为0.2 mol/L PBS溶液（pH 6.6）、2.5 mL 1%铁氰化钾溶液,于50 ℃水浴中反应20 min后,加入2.5 mL10%三氯乙酸溶液,摇匀后离心。吸取2.5 mL上清液于试管中,依次加入2.5 mL H2O、0.5 mL 0.1%FeCl2,混匀,静置10 min后于700 nm处测定吸光值,吸光值越高,说明还原能力越强。以VC和BHT为阳性对照,计算IC50值（当吸光度为0.5时的样品浓度）。
1.2.6 DPPH自由基清除能力的测定 参考Mishra等[16]的方法略改进,于试管中加入1 mL不同浓度样液和1 mL DPPH乙醇溶液（60 μmol/ L）,摇匀后避光静置30 min,以无水乙醇为空白对照,在517 nm处测定吸光度。为确保试验精确,需扣除样品溶液本身的吸光度,因本试验样品稀释液本身吸光度几乎为零,可忽略。以VC作为阳性对照。依据公式计算清除率及IC50值（当清除率为50%时的样品浓度）。
清除率=[(A0-A1)/A0]×100%
其中,A0表示空白对照组吸光度,A1为样品吸光度。
1.3 数据处理
数据采用SPSS 19.0软件进行处理,采用Duncan法进行多重比较分析,显著性差异P<0.05。试验中每组试验均重复3次,数据采用均值±标准差表示,IC50值采用回归分析得出,相关性分析采用Pearson法。
2 结果与分析
2.1 千层金叶片醇提物及其不同极性部位萃取得率和总多酚含量测定
表1 千层金叶片醇提物及其不同极性部位萃取得率和总多酚含量Tab. 1 Yield and total phenols content of methanol extract and its different polarity fractions from M. bracteata leaves |
| 样品 Sample | 得率 Yield/% | 总多酚含量 Total polyphenol content/(mg•g-1) |
|---|---|---|
| 甲醇粗提物（ME） | 22.8±0.076a | 394.48±0.49c |
| 石油醚相（PE） | 0.04±0.003e | 29.30±0.049e |
| 乙酸乙酯相（EVE） | 19.65±0.035d | 397.6±1.77b |
| 正丁醇相（BE） | 40.26±0.046b | 453.75±0.98a |
| 水相（WE） | 34.04±0.060c | 284.16±2.25d |
Note: Different lowercase letters within the same column represent significant difference (P<0.05). | |
注：同列不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。 |
2.2 千层金叶片醇提物及其不同极性部位对ABTS+自由基的清除能力
由图1可知,PE对ABTS+自由基的清除能力很弱,而其他极性部位以及VC均表现出不同程度的清除ABTS+自由基的能力,且都具有明显的量效关系。当质量浓度达300 μg/mL时,除了PE,其他组分的清除率均与VC相当。ME和BE对ABTS+自由基的清除能力显著高于VC。
2.3 千层金叶片醇提物及其不同极性部位的还原力
千层金叶片醇提物及其不同极性部位的还原力呈现浓度依赖关系,如图2所示。在质量浓度为150 μg/mL时,除石油醚相外,千层金叶片各组分、VC和BHT的吸光值均超过0.5;当浓度达到200 μg/mL时,正丁醇相吸光值为0.835,显著高于BHT,且与对照VC（0.870）相差不多。
2.4 千层金叶片醇提物及其不同极性部位对DPPH自由基的清除能力
千层金叶片醇提物及其不同极性部位对DPPH自由基均具有不同程度的清除能力,当质量浓度小于20 μg/mL时,各组分对DPPH自由基的清除率随质量浓度的升高而急剧增大,量效关系明显,如图3所示。PE清除能力最弱,当浓度达到20 μg/mL时,PE对DPPH自由基的清除率达80%以上,其他组分和VC均达到90%以上,且没有明显差异,浓度继续增加时清除率升高缓慢。
2.5 千层金叶片抗氧化活性与总多酚含量的相关性分析
千层金叶片醇提物及其不同极性部位抗氧化活性的IC50值见表2,结果表明,千层金叶片醇提物及其不同极性部位以及VC对ABTS+自由基的清除能力大小依次为ME>BE>VC>WE>EVE>PE;除石油醚相外,千层金叶片其他组分的IC50值均显著低于BHT,具有较强的还原力,其强弱次序为VC>BE>ME>WWE>EVE>BHT>PE;千层金叶片各组分和VC对DPPH自由基清除能力的强弱次序为VC>BE≥EVE>ME>WE>PE,其中,EVE的IC50值与BE无显著差异（P<0.05）,二者对DPPH自由基的清除能力相当。
表2 千层金叶片醇提物及其不同极性部位抗氧化活性的IC50值Tab. 2 IC50 values of methanol extract and its different polarity fractions from M. bracteata leaves |
| 样品 Sample | IC50值 IC50 values /(μg·mL-1) | ||
|---|---|---|---|
| ABTS+自由基 ABTS+ radical | 还原力 Reducing power | DPPH自由基 DPPH radical | |
| ME | 27.20±0.016f | 103.49±0.362e | 6.17±0.09c |
| PE | 3987.87±0.490a | 39334.29±0.346a | 8.28±0.006a |
| EVE | 91.21±0.058b | 131.70±0.099c | 4.76±0.010d |
| BE | 30.50±0.006e | 88.41±0.017f | 4.90±0.005d |
| WE | 47.67±0.020c | 124.41±0.060d | 6.74±0.004b |
| VC | 40.14±0.103d | 55.189±0.013g | 3.04±0.003e |
| BHT | nd | 145.92±0.058b | nd |
Note: Different lowercase letters within the same column represent significant difference at P< 0.05; nd: not determined. | |
注：同列中的不同小写字母表示在P<0.05条件下的差异显著;nd表示未检测到。 |
分析千层金叶片醇提物及其不同极性部位抗氧化活性的IC50值与其总多酚含量相关性的结果表明,千层金叶片醇提物及其不同极性部位的ABTS+自由基清除能力、还原力和DPPH自由基清除能力的IC50值与其总多酚含量之间均存在显著的线性相关性（相关系数R2分别为-0.930、-0.932和-0.930）,说明千层金叶片各组分的抗氧化活性与各自的总多酚含量呈显著的正相关。
3 讨论
千层金叶片醇提物及其不同极性部位的还原力和对ABTS+自由基、DPPH自由基的清除能力均呈明显量效关系,且在一定的浓度范围内清除率和还原力都急剧上升,当达到较大的浓度后,抗氧化效果升高缓慢。这可能是由于千层金叶片醇提物中含有某些兼有抗氧化和促氧化效果的物质,这类物质在低剂量时具有抗氧化效果,但在高剂量条件下反而具有促进氧化的效果,这样有时反而可以对细胞起到一定的保护作用,如黄酮类化合物[19]。
千层金叶片醇提物及其不同极性部位总多酚含量与清除ABTS+自由基能力、DPPH自由基能力及还原力呈显著正相关,总多酚含量越高,其抗氧化活性愈强。由此推测酚类物质是千层金叶片醇提物抗氧化活性的主要作用成分。
目前,千层金活性物质的研究多局限于精油领域[24],千层金叶片醇提物抗氧化活性的研究还未见报道。本文对千层金叶片醇提物及其不同极性部位的抗氧化活性研究结果表明,千层金叶片75%甲醇粗提物及其乙酸乙酯相、正丁醇相和水相在3个抗氧化体系中均表现出较好的抗氧化活性,并呈现明显的量效关系,有望成为优良的植物抗氧化剂而应用于食品、医疗保健、化妆品和日化工业等许多领域。尤其是正丁醇相,应对其进行进一步的分离纯化,明确其抗氧化作用的主成分,探索其作用机理,并进行活体试验,以获得安全高效的天然抗氧化剂。此外,千层金叶片中含有较丰富的多酚类物质,关于其含量、成分及活性尚未见报道,今后可对其进行进一步的研究开发。