抗生素作为20世纪的伟大发现,一方面对人类的发展起到了深远的影响,另一方面抗生素的大量使用会给环境带来负面影响。抗生素被大量地运用到畜禽和水产养殖中。研究表明,进入动物体内的抗生素利用率极低,约有25%~90%的抗生素随着粪便和尿液以原药形式被排出体外,通过粪肥的施用和污水的灌溉进入土壤和水体等生态环境中并长期存留[1,2,3,4]。土壤中的抗生素可被植物吸收,特别是土霉素（oxytetra-cycline,OTC）极易在植物体富集,并通过食物链对人类的健康产生危害[5]。
溶解性有机物（dissolved organic matter,DOM）通常定义为可以溶解于水、酸或碱溶液的有机物。在生态系统中,它主要来源于土壤腐殖质、植物凋落物、根系分泌物以及土壤或水体中微生物的残体[6,7,8]。DOM对水生生态系统的形成起着不可或缺的作用,能被土壤吸附,可以有效降低土壤对抗生素的吸附能力,增强土壤系统的耐受性,并与各种污染物相互作用,减轻污染物的毒性,影响迁移率,降低生物有效性[9,10,11]。DOM可减轻土壤中Phe的生态毒性[12],一定范围内的DOM能抑制氟氯氰菊酯的毒性[13];同时也有相反研究表明DOM能促进污染物生物有效性[14]。
就国内来说,沼液还田是目前最简单也是使用最多的方式,它能够有效提高土壤肥力,改变土壤微生物环境,增加农产品的产量[15,16]。目前天然橡胶废水沼液处理成本较高,出水不达标的情况较普遍,而海南作为全国最大的天然橡胶生产基地,橡胶废水的资源化利用就显得尤为重要,有研究表明橡胶废水的施用对蔬菜产量和农作物生长起到促进作用[17,18]。海南岛本地畜禽资源丰富,文昌鸡、临高猪、东山羊等受到广大消费者喜爱,当地用于畜禽的抗生素使用量较大。目前溶解性有机物对抗生素影响的研究中选用养殖场沼液的较多,选用天然橡胶废水沼液作为溶解性有机物的研究尚罕见报道。
本文选用小白菜作为供试作物,通过土培和水培实验研究外源橡胶废水沼液DOM和土霉素输入土壤后对小白菜种子萌发的影响,并对比土霉素胁迫下输入不同量的DOM对小白菜的根与芽伸长的影响效应,研究土霉素对小白菜的植物毒性,以期对热带地区橡胶废水沼液生态资源化利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
供试土壤为砖红壤,采自海南大学热带农林学院基地农田表层土壤（0~20 cm）,土样自然风干后,过2 mm尼龙筛。供试土壤基本理化性质：pH为5.31,全氮、全磷、全钾和有机质的含量分别为4.21%、0.15%、0.76%和2.98%。
供试作物小白菜（Brassica rapa var. glabra）,品种为揭农三号甜白菜,产地为广东省揭阳市,培育单位为保丰种子商行。在实验前,用蒸馏水浸泡8 h,除去浮于水面的种子,沥干水分后备用。
供试抗生素选用土霉素,纯度98%,购自Adamas公司。
溶解性有机物（DOM）前驱物来源于海南省儋州市某橡胶加工厂废水,该加工厂天然橡胶废水的处理流程为：酸凝槽出水——调节池——一级厌氧池——二级厌氧池（厌氧UASB池）——一级好氧池——二级好氧池——脱氧除磷池——混凝沉淀池——清水池,采集废水的水样来自清水池的好氧终水,其溶解性有机碳的浓度为128.5 mg/L。发芽率实验在受控智能人工气候培养箱（杭州钱江ZRX-300）中进行,实验用水由Spring-S60i+PALL超纯水系统制备。
1.2 方法
1.2.1 水培 每个培养皿中添加量均为10 mL水溶液,培养皿底部铺上2层滤纸。DOM添加量为1、3、5 mL,土霉素浓度梯度设置为0、10、20、30、40、50 mg/L,处理分别为：对照（CK）,添加不同量DOM,添加不同浓度梯度土霉素,添加30 mg/L土霉素+不同量DOM。
1.2.2 土培 称取50 g的风干土壤于培养皿中,DOM添加量为1、3、5 mL,土霉素浓度梯度设置为0、5、10、25、50、100 mg/kg,用去离子水调节土壤最大持水量的60%左右。处理分别为：对照（CK）,添加不同量DOM,添加不同浓度梯度土霉素,添加50 mg/kg土霉素+不同量DOM。
2种培养方式均选取20粒籽粒饱满、大小一致的小白菜种子,均匀地摆放于培养皿中培养7 d,对芽长大于2 mm的小白菜幼苗进行测量。实验共设24个处理,每个处理设置3个平行,置于25 ℃人工气候培养箱暗处培养,定期观察小白菜的生长情况,培养期间定期补充损失的水分。
1.2.3 测定项目 选取发芽率、胚根生长和芽伸长及其抑制率作为测定指标。
$发芽率=\frac{发芽种子数}{种子总数}\times 100$%
$抑制率(IR)=\frac{对照根(芽)长-处理浓度下根(芽)长}{对照根(芽)长}\times 100$%
1.3 数据处理
实验数据采用Excel 2016软件和SPSS 17.0软件进行统计、绘图以及回归分析。统计方法采用Pearson相关分析。
2 结果与分析
2.1 DOM对土霉素胁迫下小白菜发芽率的影响
水培中,白菜种子在浓度10~50 mg/L的土霉素胁迫下,均呈现不同程度的促进作用,其发芽率在70%~85%之间波动,发芽率与对照组相比差异不显著（P>0.05）。土培与水培的结果相似（图1）,小白菜种子萌发受到不同程度的促进作用,在土霉素浓度为50 mg/kg时,发芽的数量最高,但差异未达显著水平（P>0.05）。
由图2可知,在水培中,与对照组相比,添加土霉素的DOM处理（P>0.05）和纯DOM的处理（P>0.05）均对种子的萌发起到促进的作用。随着施入DOM量的增多,促进效果反而降低。在土霉素胁迫的处理中,DOM添加量的多与少对小白菜的发芽率影响不明显。土霉素胁迫下的DOM处理对小白菜的促进作用略低于纯DOM处理的促进作用,说明土霉素对小白菜种子的发芽起到了一定的抑制作用。而土培条件下,DOM对种子萌发起到了抑制的作用,且抑制效应随DOM量增加而明显。土霉素胁迫下的DOM处理（P>0.05）和纯DOM（P<0.01）处理下小白菜的发芽率则呈现出相反趋势。土霉素胁迫下的DOM处理的发芽率,随着DOM添加量的增多,其抑制效果减弱。在土培条件下,纯DOM处理抑制萌发,在添加土霉素后缓解了抑制作用。
2.2 DOM对土霉素胁迫下小白菜芽伸长的影响
2.2.1 不同浓度的土霉素对小白菜芽伸长的影响 水培中不同浓度的土霉素对小白菜芽伸长的影响如图3所示。从图中可以看到,当土霉素浓度为10~50 mg/L时,芽长的抑制率均为正值,表明小白菜的芽伸长受到土霉素的抑制作用,抑制效应随着浓度的增大而增强。与对照组相比,土霉素浓度和小白菜的芽伸长呈显著的线性相关性（P<0.05）。在土培中,加入土霉素后,其芽长的增长趋势与水培完全相反。施入5 mg/kg的土霉素,小白菜的芽长与对照组相一致。随着土霉素浓度的增高,芽长抑制率变为负值,说明土霉素对芽增长起到了促进的作用。土霉素浓度为5~100 mg/kg时,其曲线先下降后回升,在土霉素为50 mg/kg时,其促进的效果达到最强。在土壤中,不同的土霉素浓度对小白菜的芽伸长的影响达到显著性差异（P<0.05）。
2.2.2 土霉素胁迫下DOM对小白菜芽伸长的影响 纯DOM处理下的小白菜芽长抑制率为负值（图4）。在水培中,纯DOM处理促进小白菜的芽伸长,DOM添加量为0~1 mL时,对小白菜种子的芽伸长有轻微的抑制作用;随着添加量的增多,则从抑制转为促进,且促进的作用随着添加量的增多而增强。从图中可以看到,土霉素胁迫下的DOM处理的芽伸长趋势与纯DOM处理的培养结果大致相同,在添加土霉素的处理中加入DOM后,芽长抑制率由正值转为负值。通过观察纯DOM处理与DOM+土霉素处理的结果可知,在水溶液中,DOM能够有效缓解土霉素的胁迫,促进芽的伸长。在土培中,添加1~3 mL的DOM会对芽伸长起到促进的作用,且添加量越多,促进效果越明显。加入土霉素之后,芽伸长出现了相反态势,DOM添加量为1~3 mL,其芽长抑制率为负值;添加量为3~5 mL,其芽长抑制率为正值,说明DOM抑制了芽长的增长。DOM添加量为0~1 mL时,对芽伸长起到了促进的作用;添入量为1~3 mL,促进效果减弱,DOM添加量为3 mL时,其芽长抑制率基本与对照组持平;施入量为3~5 mL时,出现明显的抑制作用。通过对比,发现土壤中土霉素胁迫下DOM对小白菜芽伸长的作用与水溶液中不一致。
以小白菜的芽长抑制率对土霉素浓度、DOM添加量以及DOM与土霉素共存时DOM添加量进行回归分析,由表1可见,在水培和土培中,土霉素浓度、DOM添加量与芽伸长呈对数相关,DOM与土霉素共存时DOM添加量与芽伸长呈线性相关。在3种处理条件下,水培中芽的抑制率的相关性均高于在土培中。
表1 土霉素浓度与芽伸长抑制率的回归分析Tab. 1 Regression analysis between oxytetracycline concentration and the inhibition rate of shoot elongation |
| 处理 Treatment | 介质 Medium | 拟合方程 Fitting equation | R2 |
|---|---|---|---|
| OTC | 水培 | y=0.0564ln(x)+0.0142 | 0.9639 |
| 土培 | y=-0.03ln(x)+0.0373 | 0.8664 | |
| DOM | 水培 | y=-0.307ln(x)-0.0802 | 0.9853 |
| 土培 | y=-0.003ln(x)-0.0431 | 0.8105 | |
| OTC+DOM | 水培 土培 | y=-0.1126x+0.1409 | 0.8682 |
| y=0.0133x+0.5219 | 0.7924 |
2.3 DOM对土霉素胁迫下小白菜胚根生长的影响
2.3.1 土霉素浓度对小白菜胚根生长的影响 水培中不同浓度的土霉素对小白菜胚根生长的影响如图5所示。在土霉素浓度10~50 mg/L,芽长的抑制率均为正值且在40%~60%之间波动,表明土霉素对小白菜的根生长起到抑制的作用,抑制效应随着浓度的增大而增强,土霉素浓度与胚根长呈显著性相关（P<0.05）。在土培中,胚根长抑制率呈负值,说明土霉素对胚根长起到了促进的作用,其促进作用是先增强后减弱,在土霉素为5~50 mg/kg时,其促进作用随着土霉素浓度增大而增强（P<0.05）,在50 mg/kg处理下达到最大值,土霉素浓度为50~100 mg/kg时,其促进作用减弱。在土培中,小白菜的胚根生长的效应与芽长相一致。
2.3.2 DOM对土霉素胁迫下的小白菜胚根长抑制率的影响 在水培条件下,纯DOM处理的胚根长抑制率为负且呈上升趋势,表明DOM对胚根生长起到促进的作用。从图6可以看出,随着DOM量的增加,对胚根生长促进的效果减弱。施入土霉素后,与DOM共同作用下胚根长抑制率为正值,说明小白菜的胚根长受到了明显的抑制。在土霉素胁迫下的处理中,施加DOM的处理与不加DOM的处理相比,随着DOM添加量的增加,加重对小白菜胚根生长的抑制作用。土培条件下,小白菜在纯DOM处理下与在土霉素胁迫处理下的胚根生长抑制率均为负值,说明小白菜胚根长均在两种处理中受到了促进作用。纯DOM处理的抑制率曲线呈上升趋势,随着量的增加,其促进作用减弱。在土霉素胁迫下的处理中添加DOM,DOM的促进效应呈现出先增强后减弱的现象,在DOM添加量为0~1 mL时,其促进效应优于对照组;DOM添加量为1~5 mL时,促进效应弱于对照组。由图6可知,在土霉素与DOM共同作用下,其DOM添加量越高,其促进效果越弱。
以小白菜的胚根长抑制率对土霉素浓度、DOM添加量以及DOM与土霉素共存时DOM添加量进行回归分析,由表2可见,在水培和土培中,土霉素、DOM与芽伸长呈对数相关,DOM与土霉素共存时呈线性相关。在水培中,土霉素对芽长的IC50为1168.691 mg/L,胚根长的IC50为26.9 mg/L,芽伸长的IC50明显大于胚根生长,说明芽对土霉素的耐受性更强,根对土霉素敏感性更大。
表2 土霉素浓度与胚根生长抑制率的回归分析Tab. 2 Regression analysis between oxytetracycline concentration and the inhibition rate of radicle elongation |
| 处理 Treatment | 介质 Medium | 拟合方程 Fitting equation | R2 |
|---|---|---|---|
| OTC | 水培 | y=0.0764ln(x)+0.2485 | 0.9328 |
| 土培 | y=-0.05ln(x)-0.0552 | 0.8576 | |
| DOM | 水培 | y=0.1253ln(x)-0.4819 | 0.7866 |
| 土培 | y=0.113ln(x)-0.2768 | 0.9955 | |
| DOM+OTC | 水培 | y=0.0542x-0.3249 | 0.8483 |
| 土培 | y=0.038x-0.0955 | 0.9714 |
3 讨论
前人研究普遍表明土霉素会抑制植物芽、根的伸长,DOM能够有效降低生物的有效性[1-3, 15, 19]。本研究中,土霉素对小白菜的生长产生一定的影响,其发芽率的结果与安靖等[19]研究结果相一致。在水培中,土霉素对小白菜的芽伸长和胚根生长均表现出抑制作用,浓度越高,抑制效果越强;在土壤中,胚根生长和芽伸长均呈现先促进后促进减弱的现象,造成这一趋势的原因可能是因为土壤具有一定的吸附能力以及缓冲的作用,削弱了土霉素对小白菜芽、胚根长的抑制作用。在0~100 mg/kg的土霉素浓度处理下未对小白菜的胚根生长、芽伸长产生抑制作用,可能由于当前土培所设最高土霉素浓度未达到胁迫小白菜胚根生长和芽伸长的浓度。
在水培和土培中,纯DOM的处理能够有效促进小白菜的胚根伸长和芽伸长。但是在土霉素胁迫下施加DOM的处理,与只有土霉素的处理相比,DOM对小白菜的芽、根抑制率,在土培和水培中胚根长和芽长呈现出完全相反的两种情况。在水培中,土霉素胁迫下加入不同量的DOM,DOM对芽起促进作用,对根起抑制作用;在土壤中,土霉素胁迫下加入不同量的DOM,DOM对芽起到抑制作用,对根产生先促进后抑制的作用。但DOM对植物生长、发育所起到的作用还有待进一步探讨。有文献表明DOM会影响抗生素在土壤上的吸附行为,一般认为DOM会通过增加土壤中有机C的浓度、暴露出极性官能团、与抗生素竞争吸附点位使得吸附容量增大,但是也有其他研究表明DOM会降低抗生素、农药在土壤中的吸附,如Yaron Drori的研究中提到DOM能改变原来土壤的有机质性质,降低土壤对抗生素的吸附作用[20,21,22]。Song等[23]发现DOM提高了除草剂对小麦的毒性,认为是DOM的配位体与除草剂结合,提高了除草剂的生物有效性。所以橡胶废水DOM对土霉素胁迫下的生物有效性促进或抑制的原因需要考虑土壤中土霉素的吸附解吸行为、土霉素的疏水性成分、DOM配位体与土霉素的结合以及DOM的浓度、分子大小等[14, 24-25],其促进或抑制的浓度阈值点尚待于进一步的研究。