有机磷农药（OPs）因其具备良好的预防、控制及根除害虫的能力而广泛应用于农业生产中以提高农作物的产量,但同时其广泛使用会造成严重的农药残留问题[1,2]。OPs具有高毒性,其不可逆地抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）活性从而导致一系列临床并发症,严重时可致死,故残留在人类赖以生存的土壤、大气、水以及农产品中的OPs会导致严重的食品安全以及人类健康问题[3,4,5]。为了解决这一问题,除了研制低毒无公害的新型农药,开发灵敏高效的农残检测新方法对于改善食品安全及保护人类健康具有重要意义[6]。已报道的农残检测技术如色谱法、酶联免疫吸附法和电化学分析法等虽具高灵敏度、高准确度,但通常也存在一些弊端[7,8,9]。如色谱法需复杂的前处理过程、昂贵的仪器设备和专业人员的操作技能[10]。而比色法因具备低成本、易操作、不需大型仪器设备、可将检测结果转换为颜色变化及适合肉眼观察等特点,得到科研工作者的青睐及研究[11]。
碳点（CDs）作为一种低毒性的碳纳米材料,具有独特的光学性能、良好的生物相容性及优异的化学稳定性等特点,已广泛应用于荧光探针、生物成像和光催化等领域[12,13,14]。另外,CDs具有纳米模拟酶催化活性这一特点使其在检测方面的应用开辟了新领域[15]。如Zhong等[16]以木炭为碳源制备催化活性碳点用于谷胱甘肽的比色检测;Wang等[17]用鸭血做碳前体合成具有催化活性的多元素掺杂碳点比色检测葡萄糖。而基于锰掺杂碳点的高效催化活性对OPs的比色检测尚未被报道。本研究以碳酸锰、脲、柠檬酸、双氧水为原料,采用微波加热法合成具有过纳米模拟酶催化活性的锰掺杂碳点,Mn-CDs可催化3,3°,5,5°-四甲基联苯胺（TMB）产生蓝色的ox-TMB。乙酰胆碱酯酶（AChE）催化底物乙酰硫代胆碱（ATCh）生成的硫代胆碱（TCh）,可还原ox-TMB使溶液的蓝色褪去。毒死蜱能有效抑制AChE的活性,使TCh的生成量减少,溶液的蓝色变深。根据溶液颜色的深浅可以构建毒死蜱的可视化检测方法。初步探讨了基于溶液颜色变化的检测机理。该检测方法OPs灵敏度高、检出限低、线性范围宽、操作简便、检测成本低,为农药残留检测提供新的技术参考,同时也拓宽了CDs在食品安全分析检测领域的应用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂 毒死蜱标准品（100 μg/mL）,天津农业部环境质量监督检验中心;柠檬酸（AR）,广东光华化学厂有限公司;碳酸锰,上海麦克林生化技术有限公司;TMB,北京索莱宝科技有限公司;AChE、ATCh,上海生工生物工程股份有限公司;NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、葡萄糖、乳糖、抗坏血酸、半胱氨酸,均为分析纯,上海阿拉丁有限公司;实验用水为超纯水。
1.1.2 仪器与设备 U-3900紫外可见分光光度计（Hitachi,Japan）;Tecnai G2 F20 S-TWIN场发射透射电子显微镜(Philips,Netherlands);ESCALAB 250Xi型X射线光电子能谱仪（Thermo Electron, USA）;FTIR-Spectrum Two傅立叶转换红外光谱仪（Perkin Elmer, USA）;ALPHA 1-2LD PLUS台式冻干机（CHRIST,Germany）,DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）;Mastersizer 3000E马尔文激光粒度仪（England）;UPLC-TQS液相色谱串联质谱联用仪（Waters,USA）;AUY-220电子分析天平（日本岛津公司）;PHSJ-4F型pH酸度计（上海仪电科学仪器股份有限公司）;IKA-MS3涡旋混合器（上海旦鼎国际贸易有限公司）;Milli-Q Academic超纯水净化系统（Millipore,USA）。
1.2 方法
1.2.1 Mn-CDs的合成 称取0.75 g柠檬酸、0.2 g脲、0.2 g MnCO3溶于20 mL水,加入2 mL的H2O2溶液（5 mol/mL）,混合均匀后将混合液置于微波炉（750 W）中反应8 min。反应后自然冷却至室温,8000 r/min离心20 min,得到的深棕色上清液透析12 h。最后,Mn-CDs原液用超纯水稀释100倍后4 ℃保存备用。
1.2.2 Mn-CDs的纳米模拟酶活性考察 取10 μL不同浓度的Mn-CDs溶液、20 μL的TMB溶液（10-2 mol/mL）和40 μL醋酸缓冲溶液（pH 4.0）,制成样品溶液,样品溶液终体积为100 μL,将样品溶液混匀于37 ℃下孵育20 min后测量样品溶液的吸光度,记录650 nm处的吸光度值。
1.2.3 AChE催化活性考察 取10 μL不同浓度的AChE溶液、10 μL ATCh溶液（10-2 mol/mL）和50 μL的磷酸缓冲溶液（PBS,10 mmol/L pH 7.5）中,37 ℃下孵育25 min后,再加入30 μL步骤1.2.2的反应液,充分混匀后反应15 min,测量样品溶液的吸光度,记录650 nm处的吸光度值。
1.2.4 毒死蜱的检测 依次加入10 μL不同浓度的毒死蜱溶液、10 μL的AChE溶液（1.0 U/mL）在37 ℃下孵育30 min后,再加10 μL ATCh溶液（10-2 mol/mL）和50 μL PBS（10 mmol/L,pH 7.5）,37 ℃下孵育20 min。最后加入30 μL步骤1.2.2的反应液,充分混匀后反应15 min,测量样品溶液的吸光度,记录650 nm处的吸光度值。
1.2.5 苹果实际样品的制备及检测 苹果样品购于当地的沃尔玛超市,洗涤后切碎并搅浆,称取20 g于80 mL离心管中,加入40 mL乙腈用高速组织捣碎机在15 000 r/min 匀浆提取2 min后,加入10 g NaCl,再匀浆提取2 min,在5000 r/min离心5 min。上层清液转移至另一个80 mL离心管中4 ℃保存备用。
为了验证所建立方法的准确性,取一部分上述苹果样品,分为4份（分别标记为A、B、C、D）,每份200 g,在B、C、D苹果样品表面涂一定剂量的毒死蜱（80 μg/kg）,静置12 h后,切碎并搅浆。按上述样品处理步骤得到上清液,分取20 mL用氮吹仪吹干后用1 mL乙腈水（1:1）定容,涡旋后用0.2 μm滤膜过滤,稀释10倍,用液相标定样品中的毒死蜱含量。色谱条件：色谱柱：UPLC ACQUITY BEH,50×2.1 mm,1.7 μm;流动相乙腈（A）/0.1甲酸水溶液（V:V）;梯度洗脱：0~1 min,90%A;1~2.2 min,90%A~50%A;2.2~3 min,50%~90%A;3~4 min,90%A保持1 min。质谱条件：离子源ESI,正离子;离子源温度110 ℃;监测离子对：349/97,349/198。
2 结果与分析
2.1 Mn-CDs的合成与表征
为了探讨Mn-CDs的表面微观组成和成键情况,通过XPS全谱的表征证明了所合成的Mn-CDs主要由C、O、S、N、Mn元素组成（图2A）。元素组成分别为：C 49.52 %、O 35.86 %、S 1.39 %、N 11.71 %、Mn 1.51%。高分辨的C 1s谱（图2B）含三个不同结合能的峰,284.6、285.4、288.4 eV。高分辨S 2p谱中出现163.1、164.3 eV的两个峰。高分辨的N 1s谱（图2C）中含400.1 eV和401.5 eV两个峰;Mn-CDs的O 1s谱,特征峰在530.8 eV、532.3 eV和532.9 eV,分别为吸附氧、-C=O/-C- OH/N-O/P-O和-COOH峰。另外,高分辨的Mn 2p谱（图2D）中出现642.0和653.6 eV两个峰。
2.2 Mn-CDs的光谱性能表征
2.3 毒死蜱的检测
为了考察Mn-CDs作为纳米模拟酶的催化活性,分别对TMB、Mn-CDs及TMB+Mn-CDs反应后的样品溶液进行了紫外可见吸收光谱扫描。如图4A所示,只有TMB或Mn-CDs存在的溶液体系在650 nm处未出现吸收峰（曲线1、2）;只有TMB和Mn-CDs同时存在时,650 nm波长处才出现明显的吸收峰（曲线3）。另外,其对应的反应溶液通过肉眼可观察到明显的颜色区别（左内插图）,结果表明Mn-CDs能将无色的TMB氧化成蓝色的ox-TMB。
为了探讨利用Mn-CDs的纳米模拟酶催化活性构建有机磷农药可视化分析策略的可行性,进一步考察毒死蜱抑制AChE反应后的样品溶液吸光度的变化情况。如图4B所示,只有AChE或ATCh存在时,溶液吸光度均与TMB+Mn-CDs体系的吸光度值较接近,但当AChE、ATCh同时存在时,反应后的样品溶液在650 nm波长处的吸光度大大降低;加入毒死蜱农药抑制AChE活性后,吸光度值变大;其对应的反应溶液通过肉眼可观察到明显的颜色区别（右内插图）。实验结果表明,AChE可催化ATCh水解生成还原性的TCh,TCh将蓝色的ox-TMB还原,使反应体系的在650 nm处的吸光度值降低。当有毒死蜱存在时可抑制AChE活性,降低ATCh的水解,减少TCh的生成,650 nm处的吸光度值变大（图4B中曲线3）。吸收峰强度取决于OPs的浓度,因此,通过650 nm处吸光度值的变化可构建灵敏定量检测毒死蜱的方法,根据溶液的颜色变化可半定量测定样品中毒死蜱的含量,说明本研究所设计的比色检测方法是可行的,可以用于毒死蜱的定量检测及可视化分析。
2.4 毒死蜱检测条件的优化
2.4.1 优化Mn-CDs的用量及反应温度 本研究是利用Mn-CDs的纳米模拟酶催化活性构建有机磷农药可视化分析策略,因此Mn-CDs的浓度将极大地影响检测体系的颜色变化。因此为了考察Mn-CDs的最优浓度,通过改变Mn-CDs的用量进行实验,结果如图5A所示,650 nm处的吸光度随着体系中Mn-CDs体积增加而增大,溶液的颜色也由无色变蓝色（插图）。Mn-CDs体积过小或过大都影响后续毒死蜱检测的线性范围和溶液的颜色变化,综合多方考虑后选择Mn-CDs体积为20 μL（母液浓度为0.01 mg/mL）进行后续实验。反应温度是影响酶催化效率的关键因素之一。在Mn-CDs催化实验中,Mn-CDs+TMB体系的吸光度随着温度的升高而增强,当温度升至37 ℃时吸光度值较大,温度大于37 ℃时吸光度开始减小,而AChE的工作温度范围为25~65 ℃,Mn-CDs+TMB+ATCh+AChE+OPs反应体系在37 ℃也较理想。因此,选择37 ℃作为整个实验的反应温度,如图5B所示。Mn-CDs+TMB体系的吸光度随着反应时间发生变化,反应时间为15 min时吸光度值最强,因此选择15 min作为最佳反应时间,如图5C所示。
2.4.2 优化AChE的浓度 在pH为7.5,Mn-CDs体积为20 μL条件下,改变Mn-CDs+TMB+ ATCh+AChE反应体系中AChE的浓度,其吸收光谱图如图6所示,650 nm处的吸光度随着AChE浓度（0、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 U/mL）的升高而减小,在浓度为1.0 U/mL时达到最小值,且随着酶浓度继续增加,吸光值基本不变。因此本实验中AChE的最优浓度为1.0 U/mL。
2.5 检测毒死蜱的线性关系
图7 Mn-CDs+TMB+ATCh+AChE体系中加入不同浓度毒死蜱时的吸收光谱图（A）,毒死蜱浓度和吸光度改变值之间的线性关系（B）Fig. 7 UV-Vis spectrum of Mn-CDs+TMB+ATCh+AChE system with different concentrations of chlorpyrifos (The inset photograph is solution colors of different reaction system)(A) and the fitting curve for absorbance change value and different chlorpyrifos concentrations(B) |
2.6 选择性考察
为了研究所建立传感方法的特异性,考察了共存物质、其他类型农药对本检测方法的干扰,如复杂体系中的共存物质：NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2、葡萄糖、氯氰菊酯、氟虫腈、噻嗪酮、乳糖,向检测体系中加入浓度为毒死蜱3倍的干扰物质。如图8所示,只有毒死蜱存在时体系的吸光度值有很明显的改变,这些共存物对检测结果的影响较小。
2.7 苹果实际样品分析
为了考察本研究所建立的方法在复杂食品样品中进行检测的可行性,实验对苹果实际样品进行了分析测定。在所制得的苹果样品中,加入不同浓度的毒死蜱标准溶液进行加标回收实验,并对该样品进行了分析。在最优实验条件下进行测定,每个浓度平行测3次。实验结果如表1所示,毒死蜱在苹果样品中加标回收率为95.20%~ 102.8%,RSD值低于8.0 %。
表1 苹果样品中毒死蜱的加标回收率试验（n=3）Tab. 1 Results of chlorpyrifos in apple juice samples (n=3) |
| 样品 Samples | 加标量 Added /(μg·mL-1) | 测得浓度 Found /(μg·mL-1) | 回收率 Recovery /% | 相对标准偏差 RSD/% |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 1.00 | 1.04 | 100.4 | 7.40 |
| 2 | 1.50 | 1.50 | 102.8 | 4.10 |
| 3 | 2.00 | 1.95 | 97.90 | 1.20 |
| 4 | 3.00 | 2.86 | 95.20 | 1.50 |
$W=\frac{M\times D\times V\times {{V}_{1}}}{m\times {{V}_{2}}}$
式中M为上机液浓度,单位ng/mL;V为定容体积,mL;V1为浸取体积,mL;D稀释倍数;m称取质量,g;V2为分取体积,mL。
图9 液相色谱-质谱法确证苹果样品毒死蜱含量的图谱Fig. 9 Determination of chlorpyrifos content in apple samples by liquid chromatography-mass spectrometry |
表2 液相色谱-质谱法确证苹果样品毒死蜱含量（n=3）Tab. 2 Concentration of chlorpyrifos in apple samples determined by liquid chromatography-mass spectrometry (n=3) |
| 样品名 Name | 峰面积 Area | 峰高 Height | 浓度 Concentration/(ng·mL-1) | 相对标准偏差 RSD/% |
|---|---|---|---|---|
| 空白Blank | — | — | — | — |
| 基质标准STD | 943.355 | 18201 | 150.00 | 1.7 |
| 控制样品Control sample | — | — | — | — |
| 加标样品Spiked samples | 532.638 | 10712 | 84.51 | 2.9 |
通过上述实验步骤,计算涂抹于苹果表面的毒死蜱含量测定结果为84.51 μg/kg,回收率为105.6%,说明所建立的方法的准确性良好。
3 讨论
本研究中Mn-CDs为均匀分散性的圆形颗粒,说明所合成的材料水溶性好,Mn-CDs的晶格间距为0.338 nm,这与石墨烯（100）的面内晶格间距一致,说明在高温碳化过程中形成了类石墨烯结构。Mn-CDs的XPS表征说明其表面微观组成含N、O、S、Mn,表明在合成过程中,成功掺杂了金属元素和非金属元素,有利于进一步改善其性能。高分辨C 1s谱三个不同结合能的峰中,284.6 eV的峰为sp2碳（C-C/C=C）源于Mn-CDs的石墨结构,285.4 eV的峰为sp3碳（C-O/C-N/ C-S）,288.4 eV的峰为C=O[19]。高分辨S 2p 谱中163.1、164.3 eV的两个峰,是由于手性的耦合,和已报道的S 2P3/2和S 2P1/2位置中噻吩-S-C-S-共价键一致[20]。高分辨的N 1s谱中的两个峰400.1 eV和401.5 eV来源于吡咯型氮（C-N-C）和石墨化的氮或 N-H[21],Mn-CDs的O 1s谱,特征峰在530.8、532.3和532.9 eV,分别为吸附氧-C=O/-C-OH/N-O/P-O和-COOH峰,说明该Mn- CDs具有很多的含氧基团。另外,高分辨的Mn 2p谱中的642.0和653.6 eV两个峰,Mn 2p 3/2峰值与Mn 2p 1/2峰值之间的结合能差值约为11.6 eV说明锰元素以Mn3O4的形式存在[22]。FTIR在1628 cm-1处出现的吸收峰对应C=O键的伸缩振动,2362 cm-1处的吸收峰来源于酯基,Mn-CDs在该处的吸收峰较原料在该处的吸收强,说明在碳化过程中发生了-COOH和-OH的缩合反应[23]。1110 cm-1处的吸收峰对应C-O和C-O-C键。证实存在N-H、S-H、C-S、C-N,说明N和S掺杂成功;含氧官能团（O-H、COO-、C=O、C-O）的存在,说明合成的Mn-CDs表面存在大量羧基和羟基,这些亲水性官能团的存在使得Mn-CDs在水中也能拥有较好的稳定性及催化性[24]。另外,Mn-CDs在474 cm-1处的弱吸收峰来源于Mn-O键,说明锰元素通过与氧连接掺杂到碳点表面[18, 25]。与上述XPS表征的结果基本一致,说明S、N和Mn元素被成功掺杂到所制备的Mn-CDs中。
Mn-CDs催化TMB反应后其对应的溶液通过肉眼可观察到明显的颜色区别,结果表明Mn-CDs较强的纳米模拟酶催化活性,能将无色的TMB氧化成蓝色的ox-TMB,这可能是由于Mn-CDs表面存在具有纳米模拟酶催化活性的C=O/C-O/ O-C-O基团石墨碳及锰元素的协同催化的结果。TMB反应物以分子的形式吸附于Mn-CDs表面上,并与催化中心的氧化性集团及可变价态的锰作用发生氧化反应,生成蓝色的ox-TMB从而显色[26,27]。AChE可催化ATCh水解生成还原性的硫醇化合物TCh,TCh将蓝色的ox-TMB还原,使反应体系的在650 nm处的吸光度值降低[28]。毒死蜱通过抑制AChE活性,降低ATCh的水解,从而减少TCh的生成,650 nm处的吸光度值变大。吸收峰强度随着OPs浓度的改变而发生改变,因此,通过测定650 nm处吸光度值的变化可构建灵敏定量检测毒死蜱的方法,根据溶液的颜色变化可半定量测定样品中毒死蜱的含量,说明本研究所设计的比色检测方法是可行的,可以用于毒死蜱的定量检测及可视化分析。
本研究以柠檬酸、碳酸锰、脲为原料,采用微波加热法合成具有纳米模拟酶催化活性的锰掺杂碳点（Mn-CDs）。基于Mn-CDs可催化TMB显色,AChE的水解底物能使溶液颜色褪去,毒死蜱能抑制AChE水解底物的产生,根据毒死蜱浓度与溶液颜色之间的关系可以构建毒死蜱的定量检测方法及可视化半定量检测方法。在最优实验条件下,毒死蜱的浓度在0~3.5 μg/mL范围内时线性关系良好,说明毒死蜱检测的线性范围较宽。通过选择性的考察,表明本检测方法对在常见干扰物质中具有良好选择性。苹果实际样品的分析,回收实验结果较好,初步表明,本研究所建立的方法在实际样品中具有较高准确性和可靠性,且具有潜在的应用价值。与其他方法相比,该方法具有一些明显的优势：首先,该方法速度快、容易实现、无需经过分离、冲洗等复杂的操作,可视化分析低成本、易操作,不需要大型仪器设备,适用于现场快速检测。其次,该方法用于毒死蜱的检测限为0.013 μg/mL,灵敏度较高且线性范围宽。最后,该方法选择性好且在复杂样品回收率实验中得到满意的结果。有机磷农残检测对食品质量安全具有重大的意义,本研究所设计的方法不仅能为有机磷农残检测提供新的策略,而且能够扩展碳点在食品质量安全领域的应用。