白掌（Spathiphyllum spp.）,又称白鹤芋、苞叶芋,属于天南星科（Acreare）,白鹤芋属（Spathiphyllum）,为多年生草本植物。白掌原产于美洲,20世纪80年代末引入中国。因其花型独特,有“一帆风顺”寓意,广受消费者喜爱。广东是白掌的主产地,近年来,作为主要的小盆栽观叶植物,白掌的种植面积逐年增加。
病害是限制白掌生产的重要因素之一。目前,国内外已报道的白掌主要病害有褐腐病（Cylindrocladium spathiphylli）[1]、疫病（Phytophthora nicotianae）[2]、根腐病（Pythium splendens）[3]和白绢病（Sclerotium rolfsii）[4]等。其中以褐腐病对生产的影响最大。
作者在白掌病害调查中发现,广州某生产基地大面积发生疫病,受害植株茎基部腐烂,死亡率高达50%以上。为明确该病害的病原菌种类,为病害的防控提供理论依据,本研究对其病原菌进行了鉴定。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试植株 病株样品采自广州某生产基地的大花白掌。接种植株为健康的大花白掌。
1.1.2 供试培养基 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基用于菌株的分离培养和菌种的保存,马铃薯葡萄糖（PD）培养液用于接种菌丝的培养,水琼脂（WA）培养基用于单菌丝分离,V8汁培养基用于疫霉孢子囊和卵孢子的诱导。
1.2 方法
1.2.1 病原菌的分离纯化 采用组织分离法进行病原菌的分离[5]。具体方法如下：选取典型的病组织,自来水冲洗,晾干,于病健交界处切取3~5 mm2的若干小块,依次于75%酒精消毒10~20 s、2.5%次氯酸钠溶液消毒10~15 s、无菌水清洗3次;用无菌滤纸吸干组织块表面的水分,将组织块移至PDA平板上,每皿5块,共6皿,于25 ℃恒温箱培养。
菌株的纯化保存：待菌落长出后,挑取菌落边缘的菌丝移至新的PDA平板上纯化;将纯化后的菌株移接至PDA斜面上培养,于13 ℃冰箱保存备用。
单菌丝分离：挑取少量菌丝,接种于WA培养基平板上培养2~3 d后,在光学显微镜下切取单根菌丝,移植于PDA平板上,25 ℃培养。
1.2.2 致病性测定 采用灌根法接种：选取长势一致的健壮幼苗,扒开表层土壤,用PD培养液震荡培养3 d的菌丝悬浮液灌根,再用基质覆盖表层,并套袋保湿,以无菌水灌根为对照,每个处理3次重复。接种植株置于25~28 ℃培养室中培养,观察记录发病情况。
病原菌的再分离：采用常规组织分离法对接种发病植株的病组织进行再分离,并通过菌落形态和显微形态观察确定分离菌株是否与接种菌株一致。
1.2.3 病原菌形态鉴定 菌落特征观察：PDA平板上27 ℃培养5 d后,在菌落边缘用无菌打孔器切取菌饼,移接至新的PDA平板上,菌丝面向下,27 ℃培养,于2、4、6、8 d观察并记录菌落特征,测量菌落直径,计算生长速率[6]。
显微形态特征观察：V8汁平板上培养5 d后,在菌落边缘用无菌打孔器切取菌饼,将菌饼移入无菌培养皿中,每皿5块,菌丝面向上,倒入无菌水至刚好没过菌丝块,25 ℃培养2 d,观察孢子囊及卵孢子形态并测量大小,孢子囊及卵孢子各测30个[6]。
1.2.4 病原菌分子鉴定 真菌基因组DNA的提取：单菌丝菌株于PDA平板上培养3~5 d后,收集菌丝,参照Chi[7]的方法提取DNA。
DNA序列比对分析：PCR产物经电泳检测后,送至英潍捷基生物有限公司测序,测序结果输入NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中进行同源性比对。
系统发育树的构建：从NCBI网上下载可信度高的相关序列,用 MEGA 7软件对实验菌株及下载的序列进行比对分析,以Fusarium solani作为外群,通过ML法（Maximum Likehood）构建系统发育树,设1000次重复。
2 结果与分析
2.1 白掌疫病的症状
病原菌沿根基部侵入,受害部位初期呈水渍状,褐色,逐渐扩展至内部;剖开病株假鳞茎,心芽变褐色,病变沿心芽向上扩展;受害植株最初表现叶片下垂、萎蔫,茎基部变褐湿腐,后期植株倒伏死亡。湿度大时,病害扩展迅速,病株几天内倒伏死亡（图1）。
2.2 致病性测定结果
健康植株接种7 d左右,叶片开始变黄、下垂,茎基部逐渐变褐色,湿腐状,并向上蔓延,14 d左右植株倒伏死亡（图2）;剖开假鳞茎,内部呈黑褐色腐烂,与田间症状一致。取接种发病植株进行组织分离,得到的菌株的菌落形态和显微形态与接种菌株基本一致,说明分离菌株为白掌疫病的病原菌。
2.3 病原菌的培养性状及显微形态
2.4 病原菌的分子鉴定
用真菌通用引物ITS1和ITS4对白掌疫霉病菌ITS序列进行扩增,得到约750 bp的产物。将测序公司测序获得的序列（NCBI登录号为MK450544）在NCBI网站中进行BLAST比对分析,发现其与GenBank中的烟草疫霉P. nicotianae（KF010300.1,KJ494913.1）的相似性为98 %。进一步用烟草疫霉的特异引物Pn1和Pn2进行PCR扩增,得到约650 bp的产物（图4）,并将获得的序列（NCBI登录号为MK443502）在NCBI网站中进行BLAST比对分析,发现白掌疫霉病菌与GenBank中的Pytophthora nicotianae （KX650279.1,MF590092.1）的相似性为99%。
用ITS序列构建系统发育树,结果显示：实验菌株（PYA1和PYA2）与Phytophthora nicotianae聚为一支,形成一个明显的分支,表明亲缘关系较近（图5）。
图5 基于ITS序列以Maximum Likehood法构建的Phytophthora nicotianae系统发育树编号PYA1和PYA2分别为实验菌株ITS1/ITS4和特异引物Pn1/Pn2扩增出来的2个序列,其他为NCBI上下载的可信度高的菌株序列。 Fig. 5 Maximum Likehood phylogenetic tree based on rDNA-ITS sequences of Phytophthora nicotianae PYA1 and PYA2 were two sequences of isolate from Phytophthora blight of Spathiphyllum sp. which were amplified by primers ITS1/ITS4 and Pn1/Pn2 , other sequences were from NCBI with high credibility. |
因此,结合形态学特征,将该病原菌鉴定为Phytophthora nicotianae。
3 讨论
本文在致病性测定的基础上,通过形态特征观察及基于特异性引物Pn1和Pn2扩增的ITS序列分析,对在广州发现的白掌疫病的病原菌种类进行了鉴定,明确引起广州某生产基地白掌疫病的病原菌为Pythophthora nicotianae。
关于烟草疫霉为害白鹤芋属（Spathiphyllum）植物,二十世纪八十年代以来已有文献报道,但是为害植株茎基部引起死亡的报道较少。1984年,美国弗罗里达首次发现烟草疫霉可侵染一种白鹤芋属（Spathiphyllum sp.）植物叶片,引致叶疫病[10]。1989年,夏威夷白鹤芋属植物上叶疫病发生严重[2]。二十世纪九十年代,我国陈永强[11]和郑晓慧[12]先后在广州地区的白鹤芋属植物绿巨人上（Spathiphyllum sensation）发现叶疫病。但是,以上均为烟草疫霉为害白鹤芋属植物,引起叶疫病的报道。1999年,日本岐阜市首次发现烟草疫霉为害白鹤芋属植物茎基部,造成植株死亡[13]。2009年,毕可可[14]在研究白鹤芋属植物匙叶天南星（Spathiphyllum pallas）根茎腐烂病时发现,Pythophthora nicotianae是引起根茎腐烂病的优势种之一,该菌和苞叶芋柱帚霉（Cylindrocladium spathplylli）共同为害白掌根茎部,引起腐烂。2015年,马凯生[15]在对广州白掌（Spathiphyllum cannifolium）主要土传真菌病害调查及病原鉴定时发现,疫霉可单独为害白掌,引致茎基部腐烂,并通过形态学方法,将其病原菌鉴定为Pythophthora nicotianae。作者调查发现,白掌疫病在广州地区多个花场发生严重,受害植株茎基部腐烂,最终死亡。本文在形态学鉴定的基础上,进一步通过基于特异性引物Pn1/Pn2扩增的ITS序列分析,明确其病原菌为Pythophthora nicotianae,为白掌疫病病原菌的鉴定提供了有力的分子证据。
鉴于白掌疫病为害的严重性,生产中应重视对该病害的诊断及预防。在病害诊断中,尤其要注意白掌疫病与褐腐病（Cylindrocladium spathplylli）的区别,白掌褐腐病一般由茎基部外部叶柄开始发病,在受害部位造成黑褐色凹陷的小病斑,病斑呈梭形、条形或不规则形;而疫病的病原菌通常由根基部侵入芽点,发病部位呈褐色湿腐状,并逐渐向上蔓延引起茎腐败,植株倒伏死亡。由于引起这两种病害的病原菌分类地位不同（Pytophthora nicotianae为低等真菌,Cylindrocladium spathplylli属高等真菌）,防治药剂也不同,而许多花农易将2种病害混淆。因此,生产中应注意正确识别这2种病害,并准确用药。