生长环境造成的非生物胁迫是农作物减产、品质下降的重要因素[1]。植物在低温、干旱、高盐、重金属和农药等非生物胁迫下产生大量活性氧（reactive oxygen species, ROS）[2,3,4],导致脂质过氧化、DNA和蛋白质氧化以及光合器官的损伤[5]。而酶促和非酶促抗氧化防御机制是调节植物体内ROS稳态,提高抗氧化能力的重要途径[6,7]。
谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GPXs）作为重要的酶促抗氧化剂,依赖于硫氧还蛋白（thioredoxin, Trx）还原分解H2O2,避免植物细胞氧化损伤,提高植物的抗逆性[8,9,10]。已经在拟南芥[11]、水稻[12]、棉花[13]等植物中鉴定得到谷胱甘肽过氧化物酶基因家族,也验证其在非生物胁迫氧化应激响应中的重要性。Martinez等[14]检测番茄叶绿素荧光参数发现,LeGPX表达增加了对高盐和热胁迫抗性,保护光反应系统功能。大豆GPX减少脂质过氧化对细胞的损伤,缓解干旱胁迫带来的危害[15]。转录组分析表明拟南芥AtGPX参与了低温胁迫导致的氧化应激响应,通过维持ROS平衡而减少氧化损害[16]。Wang等[17]发现水稻OsGPX突变体萌发活力低,对胁迫敏感并且发育不良。Zhou等[18]利用蛋白质组学方法发现非生物胁迫导致ROS积累,而GPX等抗氧化酶活性的增加则有利于植物对抗ROS胁迫。
1 材料与方法
1.1 植物材料与非生物胁迫处理
2018年5月中旬,在福建农林大学园艺学院教学实验基地采取以下供试材料：
(1)采集铁观音（Camellia sinensis ‘Tieguanyin’）根、茎、第2叶、花和成熟果,用于检测CsGPX的组织特异性表达。
(2)按照Yue等[24]的方法,选取2年生、健壮的盆栽铁观音茶苗,分别进行如下处理：通过叶片喷洒浓度为100 μmol/L ABA溶液;将植株移入并保持在4 ℃人工气候室中;将茶苗从盆中小心取出,用清水洗净根部泥土后放置在10% (w/V) PEG-6000溶液中;用250 mmol/L NaCl溶液灌溉。所有处理分别在0、3、9、24 h取样,取顶端第2和第3片成熟叶片,用锡箔纸分装后迅速投入液氮速冻,然后移至-80 ℃保存备用。各样品均设置3次生物学重复。
1.2 方法
1.2.1 茶树基因组CsGPX基因鉴定方法 从Pfam数据库（http://pfam.xfam.org）下载GPX基因典型保守结构域隐马可夫模型HMM（Hidden Markov Modelle）文件Pf00255[8],利用HMMER3.0软件分别在中国科学院昆明植物研究所公布的阿萨姆种[Camellia sinensis var. assamica (CSA; Assam type)]茶树基因组数据库中（http://www.plantkingdomgdb.com/tea_tree/）进行比对搜索[22]。同时从TAIR数据库（https://www. arabidopsis.org/）下载拟南芥AtGPX蛋白序列,作为检索序列使用本地BLAST在茶树基因组数据库中检索候选蛋白（E-value≤10-10）。利用Pfam和SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）检测候选蛋白结构域,获得CsGPX蛋白序列。
1.2.2 茶树CsGPX基因生物信息学分析 利用ProtParam（http://expasy.org/tools）在线工具对CsGPX蛋白进行理化性质分析,使用DNAMAN 8.0软件进行多序列比对。利用在线软件MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）对CsGPX保守元件进行分析。从拟南芥数据库（http://www. arabidopsis.org）下载8条拟南芥AtGPX家族蛋白序列,在Phytozome 12数据库（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）下载12种植物GPX序列。与CsGPX蛋白序列经过ClustalW比对后利用MEGA 7.0软件采用邻近相连法构建系统发育进化树。
1.2.3 茶树CsGPX基因结构和顺式作用元件分析 从茶树基因组数据中获取CsGPX家族基因CDS和基因组序列,使用在线软件GSDS2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）进行内含子-外显子结构分析。从茶树基因组数据获取每条基因起始密码子ATG上游2 000 bp基因组序列,利用启动子在线预测软件PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）进行分析整理。
1.2.4 茶树CsGPX基因表达分析 使用RNAprep Pure Plant Kit（Polysaccharides & Polyphenolice-rich）（天根）提取茶树总RNA。使用EasyScript® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix Kit（全式金）逆转录合成cDNA。使用TransStart® Tip Green qPCR SuperMix Kit（全式金）在Bio-Rad CFX96 Touch荧光定量PCR仪进行qRT-PCR,检测茶树CsGPX组织特异性表达和非生物胁迫响应表达模式。引物序列见表1。qRT-PCR采用20 μL体系：cDNA 2 μL,正、反向引物各0.8 μL（10 μmol/L）,TransStart® Tip Green qPCR SuperMix 10 μL,ddH2O 7.2 μL。程序为：94 ℃,30 s;94 ℃,5 s;60 ℃,30 s,40个循环。实验结果利用Excel 2016软件按照2-△△Ct方法进行计算,采用Prism 6.0软件和Heatmap illustrator 1.0软件进行图表绘制。
表1 引物序列Tab. 1 Primer sequences used in this study |
| 引物名称 Primer code | 序列 Sequence(5°-3°) | 用途 Usage |
|---|---|---|
| CsGPX1-F | ACGTTGCATCACAATGTGGC | 实时荧光定量PCR Real-time quantitative PCR |
| CsGPX1-R | CGAGTGCAAGCAAACTCCAC | |
| CsGPX2-F | ACAAGGCCTGTGCTGTGTA | |
| CsGPX2-R | ATTGGTCAAGCCGCATTGTG | |
| CsGPX3-F | CGCCTTTCAAGATGCTAAGGGA | |
| CsGPX3-R | CTGGTTCTTCCTCGCCAAAC | |
| CsACTIN-F | TGGGCCAGAAAGATGCTTATGTAGG | 不同组织部位内参基因[25] Reference gene |
| CsACTIN-R | ATGCCAGATCTTTTCCATGTCATCC | |
| CsPTB-F | TGACCAAGCACACTCCACACTATCG | 非生物胁迫内参基因[26] Reference gene for abiotic stress |
| CsPTB-R | TGCCCCCTTATCATCATCCACAA |
2 结果与分析
2.1 茶树CsGPX基因鉴定
图1 茶树CsGPX多序列比对（A）、系统发育（B）和保守结构域（C）分析下划线分别表示3个保守结构区域,红色三角形表示哺乳动物中被Sec取代的半胱氨酸残基。绿色三角表示植物GPX蛋白的3个半胱氨酸残基,红色方框表示组成GPX催化部位的氨基酸残基（Cys、Gln、Trp和Asn）。AcGPX：菠萝Ananas comosus;SbGPX：高粱Sorghum bicolor;TcGPX：可可Theobroma cacao;CcGPX：克莱门柚Citrus clementina;StGPX：马铃薯Solanum tuberosum;GrGPX：棉花Gossypium raimondii;AtGPX：拟南芥Arabidopsis thaliana;VvGPX：葡萄Vitis vinifera;OsGPX：水稻Oryza sativa;PpGPX：桃Prunus persica;SlGPX：西红柿Solanum lycopersicum;ZmGPX：玉米Zea mays;BrGPX：芸薹Brassica rapa。 Fig. 1 Multiple alignment (A), phylogenetic (B) and conserved domain (C) analysis of CsGPX The underlined are the three conserved domains shared. The Cys residue replaced by Sec in mammalian GPX is marked in red triangle. The Cys residues conserved in plant GPX proteins are marked in green triangles. Four amino acid residues constituting the catalytic site of GPX (Cys, Gln, Trp and Asn) are boxed by red. |
表2 茶树CsGPX基因家族成员信息Tab. 2 The three members of the CsGPX gene family identified from tea genome |
| 基因 Gene | 基因ID Gene ID | 编码 CDS | 基因组位置 Genomic position | 理化性质 Protein physicochemical characteristics | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 长度 Length/aa | 分子量 MW/ku | 等电点 PI | 亚细胞定位 Subcellular localization | ||||
| CsGPX1 | CSA014346.1 | 510 | xfSc0000064:312751-315618(-) | 169 | 18.76 | 7.62 | chlo（叶绿体） |
| CsGPX2 | CSA013702.1 | 753 | Sc0000216:1005671-1008791(-) | 250 | 27.99 | 8.73 | Chlo（叶绿体） |
| CsGPX3 | CSA014345.1 | 486 | xfSc0000064:297269-298763(-) | 161 | 18.39 | 4.89 | Nuc（细胞核） |
2.2 茶树CsGPX蛋白保守结构域和进化分析
从Phytozome 12数据库其他12个物种的GPX蛋白序列,采用N-J法与拟南芥和茶树CsGPX构建系统进化树,bootstrap检验采用1000次重复。结果显示,CsGPX1、CsGPX2与可可TcGPX6、桃PpGPX6和拟南芥AtGPX6聚为一类,CsGPX3与西红柿SiGPX8、芸薹BrGPX8和拟南芥AtGPX8聚在一起（图1B）。
2.3 茶树CsGPX保守元件和基因结构分析
利用MEME在线软件对CsGPX和拟南芥AtGPX蛋白序列分析发现（图2A）,所有序列都包含第1、2、3、4总共4个Motif。其中Motif 1、Motif 2和Motif 3组成了CsGPX蛋白GSHPx结构域,Motif 1、Motif 2、Motif 3和Motif 4则构成PLN02399和GSH_Peroxidase结构域,是CsGPX蛋白主要功能区域。
2.4 茶树CsGPX基因顺式作用元件分析
将每条CsGPX起始密码子ATG上游2000 bp作为启动子区,在线软件PlantCARE预测了该区域顺式作用元件。结果显示（表3）,3条CsGPX具有的顺式作用元件主要分为植物激素响应元件,如脱落酸响应元件（ABRE）、乙烯响应元件（ERE）、生长素响应元件（AuxRR-core）、茉莉酸甲酯响应元件（CGTCA-motif）、赤霉素响应元件（GARE-motif）等。植物生长发育相关顺式作用元件,如O2-site、Skn-1 motif和circadian。生物和非生物胁迫响应顺式作用元件,如热胁迫响应元件（HSE）、干旱诱导元件（MBS）、逆境防御响应元件（TC-rich）、真菌诱导子响应元件（Box-W1）。预测结果表明茶树CsGPX在调节生长发育、激素信号和应对环境胁迫方面有重要作用。
表3 茶树CsGPX基因启动子取顺式作用元件种类Tab. 3 The predicted cis-elements on the promoter regions of the three CsGPX genes |
| 基因 Gene | 植物激素响应 Phytohormone responsive | 植物生长发育 Plant growth and development | 生物和非生物胁迫响应 Abiotic and biotic stresses |
|---|---|---|---|
| CsGPX1 | ABRE | ARE、HSE | |
| CsGPX2 | ABRE、AuxRR-core、ERE | O2-site、Skn-1 motif | ARE、HSE、Box-W1、MBS、TC-rich |
| CsGPX3 | CGTCA-motif、GARE-motif、P-box、TATC-box、TCA-element、TACACG-motif | Skn-1 motif、circadian | ARE、HSE、MBS、TC-rich、MRE |
2.5 茶树CsGPX基因表达分析
3 讨论
本研究对茶树全基因组范围内进行了CsGPX基因鉴定,共得到3个CsGPX家族基因。生物信息学分析显示均含有完整GPX保守结构域,以及3段保守蛋白序列GKVLLIVNVASXCG（GPX signature 1）,ILAFPCNQ（GPX signature 2）和WNFXKF[29]。植物GPX活性依赖3个保守的半胱氨酸（Cys）残基的前2个[30,31],这与动物的不同,动物GPX的催化活性位点依赖含硒代半胱氨酸（SeCys）残基。此外,茶树CsGPX至少包含4个Motif,构成了CsGPX蛋白主要保守功能区域[32],这也不同于动物GPX。启动子区预测结果显示,茶树CsGPX的启动子上主要有植物激素、生物和非生物胁迫等响应顺式作用元件,暗示它们和其他植物中GPX基因一样会受到多种植物激素的调控[33,34,35]。
作为抗氧化代谢网络中的关键酶,GPX维持细胞ROS水平从而保护细胞膜结构完整,提高植物对胁迫氧化应激的耐受程度[37,38]。过表达拟南芥AtPGX3不仅能够调控H2O2稳态,并且通过Ca2+通道调节气孔参与到ABA代谢途径,提高对干旱胁迫耐受性[35]。在冷害胁迫下,水稻OsGPX参与了根部ROS清除,OsGPX高表达及其酶活性的增加提高了水稻的冷害耐受性[39,40]。Gao等[33]采用蛋白免疫印迹和荧光定量PCR技术发现高盐胁迫在根和叶中调节盐芥TsGPX表达,TsGPX家族成员中TsGPX7对于抵御高盐胁迫最为重要。非生物胁迫下的CsGPX表达谱说明其参与茶树的氧化应激防御机制,本研究结果与已有报道结果相似[8, 12],干旱（PEG）、低温（4 ℃）和高盐（NaCl）胁迫均能诱导提高茶树叶片中不同CsGPX的表达水平,尽管不同的CsGPX对不同的处理的响应程度有明显的差异。
ABA信号传导途径将外界环境的胁迫压力通过一系列的ABA受体传递到下游代谢通道,进而调控抗性基因表达来增强植物耐受性[41]。Dong等[42]对ABA合成突变体拟南芥研究发现,ABA介导的信号网络增强了酶催活性氧清除剂的基因转录水平,提高了耐盐性。本研究中,CsGPX能迅速响应ABA处理,3 h内表达量就提高了3倍,并在处理的中后期保持较高水平。结合启动子序列分析,3条CsGPX均存在响应ABA的顺式作用元件ABRE,使得ABA可以调控CsGPX表达。通过水稻抗寒性转录分析揭示,在低温胁迫下OsGPX表达量被上调,谷胱甘肽过氧化物酶是主要的抗氧化剂,ABA信号转导途径相关基因参与了冷应激反应,并且ABA信号通路起着主导作用[40]。Gaber[43]发现ABA作为胁迫响应基因诱导物可调节拟南芥AtGPX家族基因表达,通过在拟南芥中异源表达小麦TaGPX发现,其在非生物胁迫和ABA信号传导中有重要作用[28]。
茶树基因组数据的公布有利于从全基因组水平上对重要功能基因进行筛选,其结果更为全面。本研究利用生物信息学手段,在茶树全基因组中鉴定的到3条CsGPX基因家族成员,分析其在不同非生物胁迫中的表达模式。明确了该家族基因在茶树逆境氧化应激响应中具有重要功能,丰富了茶树抗逆机理研究,为进一步在模式植物中对CsGPX进行功能验证和优良品种选育提供理论基础。