乙烯作为气态的植物激素调控着植物的整个生长发育过程,如种子萌发、细胞伸长、果实成熟、器官的衰老与脱落、细胞程序死亡、激素调节以及对各种胁迫与病原体的响应[1]。近年来越来越多结果表明乙烯不仅影响跃变型果实和非跃变型果实的采后衰老,也参与调控果实品质相关基因的表达,影响了果实颜色、风味、质地等品质的形成与转变。随着模式植物（如拟南芥和水稻等）转录因子研究的重要突破,果实成熟和衰老过程中的转录调控机制已成为采后生物学研究的新热点与重点之一,近年来,随着基因组学、蛋白组学、转录组学及代谢组学,以及DNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质互作等技术的发展,已相继从各种果实中分离和鉴定出多种与成熟和衰老相关的转录因子,如EIN3/EIL、AP2/ERF、MADS-box、NAC 和SBP/SPL等[2],EIN3/EILs和AP2/ERF是两类植物特异的转录因子,乙烯反应是由涉及EIN3/EILs和ERF的转录因子家族的转录级联反应介导的[3],AP2/ERF家族转录因子作为乙烯信号通路中的最终目的基因,可通过调控各种下游靶基因的表达来参与植物整个生命周期的生长发育和各种逆境胁迫,可以调节植物激素的生物合成,包括乙烯、细胞分裂素、赤霉素和脱落酸,此外,AP2/ERF也参与了生长素、细胞分裂素、脱落酸和茉莉酸信号的响应,是连接植物激素信号的关键调节器。AP2/ERF的这种多重调节作用逐步被挖掘,既有有利的一面也有不利的一面,比如引起衰老、阻碍生长等,只有深入的探索和研究AP2/ERFs才能趋利避害,为果实品质生物学理论提供支撑。
本文着眼于乙烯信号转导途径AP2/ERF类转录因子,介绍乙烯调控果实产品品质的转录机制研究进展,明确基于AP2/ERF的果实品质转录调控研究重点与方向。
1 AP2/ERF转录因子简介
AP2/ERF是一个庞大的基因家族, 根据AP2结构域的数目和结构特点,AP2/ERF可以分为4个亚族ERF、DREB、AP2、RAV和单独成员soloist[4,5],AP2亚类的成员含两个相似度很高并且串联重复出现的AP2/ERF结构域,少数成员包含1个AP2结构域,在调节植物生长发育过程中起着非常重要的作用;RAV蛋白家族含有1个AP2/ERF和1个B3结构域,在乙烯响应、油菜素内酯响应、生物和非生物胁迫响应过程中发挥重要的作用;CBF/DREB家族和ERF家族只含有1个AP2/ERF结构域,CBF/DREB家族成员可以识别干旱和冷诱导响应元件（DRE/CRT, A/ GCCGAC）,在植物抵抗非生物胁迫过程中起着非常重要的作用;ERF 家族成员可以识别GCC盒（AGCCGCC）,在植物抵抗生物胁迫过程中发挥重要的作用;Soloist类的AP2/ERF转录因子与其他成员间的进化关系最远,成员数较少,如拟南芥中只报道1个成员[6]。目前主要报道了AP2和ERF两类亚家族与果实成熟和衰老有关。AP2/ERF成员在不同果实中已被广泛分离,且多个物种涉及基因组水平,在番茄[7]中分离得到112个ERFs、黄瓜[8]中分离得到131个ERFs、苹果[9]中分离得到259个ERFs、桃[10]中分离得到131个ERFs、柑橘[11]中分离得到126个ERFs、白梨（砀山酥梨）[12]分离得到155个ERFs,猕猴桃[18]中分离得到105个ERFs,大枣中分离得到119个ERFs[13]、辣椒中分离得到141个ERFs[14]。
AP2/ERF蛋白是植物体内特有的也是植物中最大的转录因子家族之一,AP2/ERF在乙烯信号转导下游发挥作用且高度保守,该族成员在植物生长发育、衰老过程中发挥重要作用,且涉及各种对周围环境的生物胁迫及非生物胁迫[15]。Mishra[16]近年来研究发现罂粟中PsAP2在烟草中可以结合DRE和GCC顺式作用元件进而响应各种生物胁迫和非生物胁迫,另外AP2/ERF还可以与其它植物激素代谢与互作,近年来研究表明AP2/ERF在果实成熟品质方面具有重要的调节作用,如颜色,质地,风味、芳香、抗逆性等,但是由于大部分模式植物不具有品质优良的肉质果实以及多年生果树的遗传转化周期漫长等困难,因此AP2/ERF在果实品质性状的转录调控研究方面鲜见报道。
2 AP2/ERF转录因子参与调控果实品质概述
2.1 果实成熟软化
乙烯在控制果实成熟（包括呼吸跃变型和非呼吸跃变型）发挥着重要的作用,调节果实中不同的成熟响应的乙烯信号通路下游ERF转录因子主要为ERF亚类和AP2亚类。AP2/ERF转录因子可以与乙烯合成相关基因相互作用来调节乙烯合成或者与单独或与其他转录因子结合后作用在与成熟软化相关的靶基因上来调控果实的成熟软化,在果实成熟软化方面的研究主要集中在呼吸跃变型果实中,最先在番茄中进行研究,后在香蕉、苹果、猕猴桃等中相继展开研究。比如在番茄中鉴定的AP2a,可以作用在RIN、NOR、CNR的下游,负调控果实的成熟[18]。Liu等[17]发现番茄基因组中有77个ERF转录因子,其中27个在果实成熟中上调表达,28个呈现负表达,这表明不同的ERF在果实发育成熟过程中扮演不同的角色。通过检测番茄成熟突变体RIN、Nor、Nr中ERF的表达情况,发现11个ERF在突变体中低度表达,3个ERF出现积累,3个副族E成员ERF则在突变体中出现剧烈下调,预示它们在果实成熟中发挥着重要作用。Feng等[19]从香蕉果实中通过酵母双杂交和双分子荧光互补分析表明MaDof23和MaERF9之间存在物理相互作用,前期研究表明MaDof23参与香蕉成熟调控,为转录抑制子,而MaERF9是转录激活子,二者相互拮抗共同调控10余个包括MaEXP1、MaEXP2、MaEXP3、MaEXP5、MaXET7、MaPG1、MaPME3、MaPL2、MaCAT、MaPDC在内的与香蕉成熟相关的基因。Fan等[20]从香蕉果实中鉴定了一个ERF亚家族的转录因子MaDEAR1,发现其表达和启动子活性可以受到乙烯和成熟的抑制,推测其表达可能部分受到组蛋白修饰调节,MaDEAR1可以直接结合到与果实软化相关的细胞壁修饰基因包括MaEXP1、MaEXP3、MaPG1、MaXTH10、MaPL3和MaPME3的启动子来抑制其活性,进而调控果实的成熟。目前从猕猴桃数据库中分离得到119个AcERF基因,其中8个ERF被确定参与果实的成熟软化,AdERF10、AdERF14、AdERF15和AdERF75为正调控因子而AdERF7、AdERF8、AdERF19、AdERF21为负调控因子[21]。Xiao等[22]在香蕉中发现MaERF9可与乙烯合成途径中的MaACS1、MaACO1的启动子结合来正向调控其活性,进而参与香蕉果实成熟的调控。在苹果中MdERF2可以结合到MdACS1 的启动子上抑制其表达进而负调控乙烯合成,MdERF2也可与MdERF3的启动子结合或者直接与MdERF3互作从而负调控乙烯合成[23],茉莉酸通过调节MdMYC2与MdERF3启动子结合来激活MdACS1的转录活性或者通过与MdERF2互作来增强MdACS1转录活性进而促进乙烯的合成[24]。类似结果也在白梨品种鸭梨中有所报道,鸭梨中ERF24可直接结合在ACO54的启动子上进而启动成熟相关基因的表达[25]。Leida等[26]在葡萄中鉴定一个浆果中特异表达的VviERF045,进一步分析表明该基因可调节蜡的生物合成和角质层的形态,并与另外6个VviERF相互协作共同调控果实的成熟。Palumbo等[27]也报道VviERF045在浆果成熟过程中起着总开关的作用。
果实质地包括果实的软化和果实木质化,在果实成熟过程中合成的一系列细胞壁降解酶可以引起细胞壁结构和成分的改变从而导致果实软化,推迟果实后熟过程中采取的延缓果实软化腐烂的措施（比如低温）往往会影响果实的其他方面的品质[28],韩延超等[29]研究发现MaERF11作为转录抑制子,可以通过对乙烯合成基因MaACO1和果实软化相关基因MaEXP2、MaEXP7、MaEXP8的抑制作用来调控乙烯的合成和果实的软化。软化是决定芒果果实货架期的重要因素之一,Chidley等[30]发现乙烯处理明显提高了阿方索芒果中β-D-半乳糖苷酶的转录活性,表明乙烯通过调控β-D-半乳糖苷酶和α-D-甘露糖苷酶在芒果软化中发挥着极为重要的作用。与果实软化相比,ERF参与果实木质化的研究严重滞后。有证据表明,APETALA2/ethylene response factor（AP2/ERF）乙烯响应因子可能与板蓝根中木脂素的生物合成密切相关,即通过调节木质素类化合物合成过程中的相关基因和调节SA合成两条途径来控制木质素类化合物的合成[31]。Zeng等[32]从低温贮藏过的枇杷果实采后木质化过程中分离出18个AP2/ERF基因,其中,EjAP2-1作为转录抑制子,其表达与木质化呈负相关,进一步研究表明EjAP2-1与木质素合成相关的EjMYB1 和 EjMYB2存在蛋白质-蛋白质间的互作,EjAP2-1与EjMYB1 或 EjMYB2的结合抑制Ej4CL1启动子的活性。Li等[33]发现1-MCP能够加剧猕猴桃在低温下出现冷害木质化的现象,而POD基因可能在猕猴桃果实冷害木质化过程中扮演了重要角色,张鲁斌等则发现ERF可能通过调控POD基因进而调控菜心低温冷藏过程中乙烯诱导的木质化（待发表）。Wang[34]研究发现桃果实低温驯化可通过一系列差异表达的ERFs来促进软化和脂质成分的变化进而保持细胞膜的稳定性,达到减轻褐变和冷害的目的。
2.2 果实色泽
色泽是果实重要的外观品质,有呈绿色的叶绿素、呈紫色的花色苷、呈橙色的类胡萝卜素、呈红色的番茄素等。茉莉酸在许多物种中可以促进叶片衰老[35],Tan等[36]在菜心中鉴定了一个可响应茉莉酸加速叶片衰老的BrERF72基因,进一步试验表明BrERF72可直接结合在BrLOX4, BrAOC3,和BrOPR3的GCC-box及DRE/CRT顺式元件上进而激活该基因的表达。 在水果诸如柑橘中,褪绿是促进果实品质形成重要的发展阶段,果实色泽的转录调控研究主要为基于MYB的花青苷代谢研究和基于AP2/ERF的类胡萝卜素代谢研究。Yin等[37]从甜橙变种—纽荷尔果果皮褪绿过程中分离了一个响应乙烯的乙烯响应因子CitERF13,CitERF13的功能在拟南芥和番茄中保守,与AtERF17、SlERF16同源作为PPH基因的激活子和叶绿素降解的促进剂。在苹果中已发现AP2/ERF类转录因子可调控类胡萝卜素生物合成途径中关键酶的表达,Han等[38]在史密斯青苹果果皮中未检测到ERF17的表达,而补充 MaERF17促进了青苹果果皮中叶绿素的降解及果皮的红色着色,说明可能存在ERF17调控苹果果皮脱绿的信号网络。Zhang等[39]在番茄果实成熟过程鉴定了一个能够抑制乙烯合成和类胡萝卜素积累的MADS-box基因SlCMB1,进一步研究发现它和SlAP2a存在互作关系。Yao等[40]发现梨果实中PyERF3通过与PyMYB114以及PybHLH3互作来共同调控花青素的合成。巴良杰等[41]在红肉火龙果果肉中得到HpERF1、HpERF2和HpERF3, 双荧光素酶瞬时表达分析显示,HpERFs可以激活红肉火龙果甜菜红素合成途径上关键基因HpCyt P450-like1的启动子活性,推测HpERFs可能通过调控甜菜红素合成相关基因表达来参与红肉火龙果果实品质形成过程。Wang等[42]研究认为ABA在花青素合成中起着更为重要的作用而乙烯则在叶绿素降解过程中起着更为重要的作用。在荔枝中ABA含量和乙烯释放量随着叶绿素的降解和花色素苷的合成而升高,而外施乙烯可显著促进叶绿素的降解,在荔枝果皮成熟转录本中鉴定了3个ERFs,表明其参与了荔枝果皮成熟过程[43]。
2.3 果实风味
果实风味是决定果实品质的重要因素,主要包括涉及糖酸代谢的糖酸比、涩味等,研究更多围绕生理生化水平和代谢途径展开,较少见转录调控相关研究。激素乙烯调节果实糖代谢的研究报道比较少见,前人报道抑制乙烯生物合成和乙烯作用对果实可溶性固形物含量没有影响[44],然而一些报道认为乙烯与糖代谢之间相互作用可能与糖的类型有关[45]。Macarena等[46]研究了乙烯对两种成熟类型呼吸跃变型日本李及其芽变品种非呼吸跃变型日本李果实糖代谢的影响,发现乙烯可以降低蔗糖的分解代谢,诱导蔗糖生物合成,同时可刺激山梨醇分解降低山梨醇生物合成。此外,乙烯可正调控半乳糖代谢,与在非跃变型日本李中含量较高的半乳糖醇、棉子糖、肌醇和海藻糖含量成负相关,进而调控果实耐贮藏能力。
Chidley等[47]研究发现乙烯处理成熟及未成熟芒果均提高β-D-半乳糖苷酶和α-D-甘露糖苷酶的转录活性及还原性糖和非还原糖的积累。有机酸对果实风味至关重要,液泡氢离子转运腺苷三磷酸酶（V-ATPase）在有机酸转运和积累中起着重要作用,有研究报道[48]在柑橘中,CitVHA-c4与CitERF13基因在蛋白水平上相互作用协同调控柠檬酸水平,在拟南芥中,过表达CitERF13或AtERF17导致柠檬酸显著积累。吕静祎等[49]用乙烯处理苹果发现常温贮藏早期乙烯可促进TA下降,但对TSS没有影响。袁莎等[50]在20 ℃用不同添加量的乙烯催熟（20 ℃）“红阳”猕猴桃3~5 d,发现其对猕猴桃TSS和TA影响不显著。
果实涩味主要由可溶性单宁引起,主要是柿（最显著）、葡萄等少数果实。成熟的涩柿果实需进行采后脱涩方可食用,常用的处理为CO2、乙烯、高温等[51]。研究发现AP2/ERF基因参与了柿果实涩味脱除的转录调控。Park等[52]发现DKEIL、DKERF2、DKERF5 和DKERF8可以响应柿果实（25 ℃）乙烯处理进而促使柿果实较15 ℃更快脱涩软化。Wang等[53]发现了柿果实脱涩过程中响应缺氧的3个ERF转录因子（DkERF8、DkERF16、DkERF19）,双荧光素酶实验证实DkERFs能够激活DkXTH9启动子进而参与细胞壁代谢。张慧敏等[54]研究发现黄瓜中CsERF在酵母和烟草体内均能够激活Bi基因启动子,说明CsERF能够特异结合Bi基因启动子的顺式作用元件,正调控Bi基因的表达,导致黄瓜中葫芦素C积累形成苦味。
2.4 果实芳香
贮藏温度和乙烯是影响果实采后贮藏果实香气的两个重要因素。在番茄果实中香气物质合成的LOX途径是依赖乙烯的过程[55],HJD等[56]发现施用外源乙烯利可显著提高芒果的呼吸速率,内源乙烯生产量和果实成熟过程中的脂肪酸含量,外源乙烯利的使用增加了总芳香挥发物、单萜、倍半萜、醛类、总酯、醇类和十四烷的产生。Jin等[57]在苹果中研究发现1-MCP处理可显著降低粉红女士酯类、醇类和烷类香气的种类和相对含量,在冷藏条件下1-MCP处理可以保持果实品质,但抑制了香气的产生。类似的结果在花牛苹果中也有报道,吴小华等[58]发现1-MCP可显著降低呼吸和乙烯产生,延缓呼吸高峰和乙烯释放高峰出现时间,但同时也抑制了与花牛苹果香气合成相关酶的活性。王贵章[59]发现乙烯通过ERF基因调控LOX、ALDH等家族基因的转录,进而影响己醛、苯甲醛、反-2-已烯醛、反-2-己烯醇等青草型香气物质的合成;同时调控TPS14和MCS基因的表达和芳樟醇的合成。前人研究表明MaDREB2与香蕉果实成熟关系密切,并且可结合并激活香气合成基因MaADH1和MaPDC的启动子[60]。
2.5 果实营养
果实的营养价值与果实中的抗氧化活性物质密切相关,这些物质包含酚类物质、萜类物质、维生素等,此前已有AP2/ERF调控药用植物及其他作物代谢产物生物合成方面的研究[61],如AP2/ERF转录因子TAR1正调控青蒿素合成;东北红豆杉中AP2类转录因子TcDREB可能参与异戊二烯代谢途径产物紫杉醇的合成;长春花中AP2/ERF类转录因子ORC1正调控几个编码参与烟碱生物合成的结构基因的酶;紫草中 LeERF-1可能对紫草素的生物合成起正向调节作用,Li等[62]已鉴定EREB58调控玉米倍半萜烯合成,AP2/ERF转录因子在采后贮藏过程中对果实营养物质影响的研究较少,目前在苹果中报道AP2/ERF类转录因子可调控类胡萝卜素生物合成途径中关键酶的表达[63],葡萄中也发现AP2/ERF类转录因子参与果实成熟过程ACC氧化酶、萜类合酶和脂氧合酶的基因表达调控[64],Costa等[65]对不同品种蓝莓进行乙烯处理发现乙烯对花青素组分的影响取决于品种,乙烯可促进部分品种花色苷总量的增加,提高蓝莓采后果实的抗氧化能力,在苹果愈伤组织中过表达MdERF1B可显著增加膳食花青素和原花青素的积累[66]。
2.6 果实抗逆性
采后贮藏过程中果实面临各种生物胁迫及非生物胁迫,AP2/ERF转录因子家族中包含有DRE结合蛋白（DREBs）,通过与DRE/CRT顺式作用元件的特异性结合来激活非生物胁迫相关基因的表达[67]。冷害是果实采后低温贮运的主要胁迫,在番茄中研究表明ERFs可以在低温下被诱导表达,最近研究表明番木瓜中ERF1可以与多个顺式作用元件结合并激活逆境胁迫相关基因和ABA合成相关基因,从而引起ABA含量升高进而提高耐盐性和耐低温性[68],在黄瓜中也有ERFs参与冷锻炼调控冷害发生的报道[69]。西葫芦果实容易发生冷害,但对低温贮藏的反应与品种有关,目前已筛选出包含AP2/ERF在内的一系列转录因子均参与了西葫芦耐冷性的调节[70]。Qi等[71]研究表明香蕉果实中存在的转录抑制子MaERF10可招募MaJAZ3来抑制茉莉酸合成相关基因表达进而调控香蕉果实的耐冷性。低温胁迫还会促使石榴果实PgERF1和PgERF2基因表达来诱导乙烯合成,进而增强低温抗性[72]。Irene等[73]从高CO2浓度处理葡萄果实中鉴定一个VviERF2-c,发现其可与PR病程相关基因的顺式作用元件GCC-box结合从而更好保持低温下的果实品质。PHBs一直被认为是细胞周期负调控因子,Kong等[74]在拟南芥根发育中发现PHB3可通过限制响应活性氧的转录因子ERF115、ERF114和ERF109部分表达来维持QC和DSC并控制根分裂活性。Wang等[75]发现LTC （0 ℃贮藏之前8 ℃预贮5天）可以提高乙烯生成量,通过ERFs维持膜结构稳定降低褐变并减轻梨果实的冷害。糖苷生物碱是植物本身固有的抗菌物质,且具有广泛的药理活性[76],Thagun等[77]在番茄果实发现了一组响应茉莉酸的ERF转录因子,在转基因番茄中过表达和反义表达该基因均引起了甾体糖生物碱的剧烈变化,JRE4可激活甾体糖生物碱合成基因启动子中的GCC-box从而调控该结构基因的表达。在果实衰老方面,Kuang等[78]用一氧化氮（NO）处理可以延缓龙眼果实的衰老,发现组蛋白去乙酰化酶基因DlHD2可以与DlERF1互作共同调控龙眼果实的衰老。
3 问题与展望
乙烯在果实的生长发育、成熟衰老及采收、贮藏到销售等各阶段都发挥着重要作用,是影响果实采后品质及贮藏期最重要的因素之一,在采后保鲜中抑制乙烯的作用可以延缓果实的成熟衰老,但同时也影响了果实品质,如何在采后保鲜过程中合理控制和使用乙烯是果实采后品质研究的重要方面。通过对AP2/ERF调控果实品质的研究,对提高果实采后货架期品质具有深刻的指导意义,然而由于AP2/ERF转录因子家族成员众多且成员之间存在功能交织和功能冗余的问题,给AP2/ERF功能的进一步研究带来诸多挑战[79]。目前对AP2/ERF转录调控机制和功能解析主要集中在模式果实番茄中,而多年生果树中主要开展相关基因分离和转录分析研究,较为深入的转录调控机制研究仅在苹果、猕猴桃、香蕉等少数果实中报道,且相关成员的功能验证鲜见报道。
顺境出产量,逆境出品质,AP2/ERF转录因子做为控制潜在的抗性相关基因表达的开关之一[80],其深入研究对于提高果实品质及抗逆性等具有重要的理论指导意义,比如通过对耐贮存,营养品质高的优良果实品种ERFs转录因子的挖掘,可对分子育种提供参考;再比如施用低浓度的乙烯是否可增强果实品质（特别是在非跃变呼吸型果实中）而又不引起果实的成熟衰老?乙烯催熟到底对果品品质有没有影响等。目前虽然国内外对AP2/ERF转录因子已经有较多报道,但对于果实特异的品质性状转录调控机制研究及功能解析还不够深入和准确,AP2/ERF对果蔬品质影响的共同规律有待于继续探讨,离实际生产应用更是相隔甚远,筛选到符合实际需求的ERFs,对产前提高果实商品品质（色泽、风味、芳香、营养）,产后降低冷害发生等具有实际意义,对进一步应用基因编辑技术对品种进行改良具有重要价值。