温度影响着生物的生长和发育,并且决定着生物的地理分布,是一个重要的生态因子[1]。在全球气候变化加剧的背景下,极端天气（寒潮）频繁出现对农作物造成低温胁迫及导致的经济损失已引起世界广泛关注[2,3,4],也是我国农业生产中最主要的自然灾害之一[5]。而在我国的热带、亚热带地区的作物通常遇到0 ℃以上的低温伤害[6]。特别是常年种植甘蔗面积约80万hm2的广西蔗区,因地形地势特殊经常出现春季“寒潮”带来的低温阴雨天气对甘蔗的正常生长发育、产量以及品质造成严重的影响[7,8]。
关于低温对甘蔗胁迫的研究已有许多报道。陈少裕[9]、陆国盈等[10]和唐仕云等[11]研究表明,甘蔗随低温胁迫时间延长其叶细胞活性氧代谢失衡导致膜脂过氧化作用加剧,膜透性增大,膜内大量电解质外渗,相对电导率增大,MDA含量显呈递增趋势;与此同时,其抗氧化酶（SOD、CAT和POD等）对剧增的自由基进行清除,但不同品种或者同一品种不同的抗氧化酶活性对低温响应存在差异。而这些研究主要侧重于阐明甘蔗抗氧化酶系统对低温胁迫下剧增的活性氧的清除机制。然而对甘蔗光合生理特性响应低温胁迫的研究报道较少。虽然张木清等[12]、孙富等[13]和陈明辉等[14]研究表明甘蔗叶片经过低温胁迫处理后叶绿素含量明显减少,PSⅡ原初光能转换效率和潜在光合作用活力均受到抑制,且直接影响光合作用的碳同化,而从光合色素含量和构成比例对光能的利用与耗散的作用,阐述在早期低温胁迫中耐寒型作物（甘蔗品种）通过避免光合机构的光破坏而减少活性氧产生的保护机制的研究报道极少。
植物叶片的叶绿素和类胡萝卜素参与了光合作用涉及光能的吸收、传递和转化的过程。植物叶片的叶绿素包括叶绿素a和叶绿素b,一部分在光反应中心负责将光能转变为化学能,其余叶绿素则负责光能的捕获和传递[15,16];类胡萝卜素包括2大类：一类为含氧的类胡萝卜素,如紫黄质、花药黄质、玉米黄质和黄体素等,统称为叶黄质;另一类为不含氧的类胡萝卜素,如β-胡萝卜素、α-胡萝卜素等,统称为胡萝卜素。类胡萝卜素主要行使两个功能：光能捕获和光破坏防御[17,18]。叶片光合机构的PSⅠ和PSⅡ的光反应中心复合体主要结合叶绿素a和β胡萝卜素,还有一部分叶绿素a位于LHCII中,叶绿素b则主要位于LHCII中[19]。黄体素既为吸收光能的辅助色素,可以完全将激发能传递给叶绿素a[20],又可在持续胁迫条件下与玉米黄质一起进行热能耗散[21,22]。朱鹏锦等[23]通过分析叶片光合色素含量和构成比例以及叶绿素荧光参数,发现所观测的高山植物能调整其叶片光合色素含量和比例进行有效的光能利用和分配。
因此,本研究以不同抗寒能力的甘蔗种质为研究材料,采用叶绿素荧光图像分析系统（CF Imager）观测了低温胁迫对甘蔗叶片光合生理过程的影响并测定分析了光合色素的含量和构成比例的变化,探究甘蔗避免光合机构的光破坏而减少活性氧产生的保护机制,为评价和选育甘蔗抗寒品种提供理论依据和实验基础。
1 材料与方法
1.1 材料
参试材料有来自广西甘蔗研究所选育的‘桂糖28号’（GT28）、广西蔗区主栽品种‘新台糖22号’（ROC22）、福建农林大学选育的‘福农39号’（FN39）和广西亚热带作物研究所新选育的‘桂热2号品系’（GR2）。
1.2 方法
1.2.1 实验设计与管理 选择无病虫害、蔗茎大小均匀的种茎切成单芽段,先用清水冲洗种茎并用干布擦洗干净,接着用50%多菌灵可湿性粉剂1000倍液浸12 h消毒,再用蒸馏水浸洗种茎1 min后,用蒸馏水浸洗拧干的棉布将种茎包好并做好标记,然后用橡皮筋扎好放进温度为25 ℃的恒温箱催芽。当种茎萌芽并长出幼根时,将其移植到装有营养土的塑料盆并做好标记。每盆1段种茎,盆高17.5 cm,盆宽16 cm。育苗期间,每株施用完全营养液2次,每次10 mL。当幼苗2叶一心时,选择长势,大小均一的进行低温处理。低温胁迫处理为4 ℃,光照强度为5000 lx,低温处理0.5 h,8 h,1 d,3 d和7 d;对照（CK）温度设计为28 ℃,光照强度为5000 lx。
1.2.2 光合色素的测定 选取的叶片与测定叶绿素荧光参数的要求相同,用去离子水洗净其表面灰尘后,避开主脉,立即剪碎混均匀,每份称取0.2 g,每个处理3份,将叶圆片分别放入装有10 mL叶绿素提取液（V丙酮∶V乙醇∶V水=45∶45∶10）的试剂瓶中,密封低温保存至叶片无色（约12 d）。用紫外分光光度计检测在663、645、440 nm波长处的吸光值。叶绿素含量、类胡萝卜素含量的计算按照以下公式：
叶绿素a (Chl a) = (12.21A663–2.81A646)×V/ 1000W
叶绿素b (Chl b) = (20.13A646–5.03A663)×V/ 1000W
类胡萝卜素(Car)=(4.4A470–0.01×Chl a–0.45× Chl b)×V/1000W
式中,A为吸光值,V为提取液总体积（mL）,W为叶片鲜重（g）,含量以单位叶片鲜重表示。
1.2.3 叶绿素荧光测定 叶绿素荧光图像分析系统（CF Imager; Technologica, UK）,具有快速、灵敏、无损伤测定样品叶绿素荧光参数的优点,可以检测叶片每个像素的光合活性,通过荧光成像来反映叶片生理状态的异质性。本研究在低温胁迫甘蔗幼苗0.5、8、24、72、168 h后,采用叶绿素荧光图像分析系统,进行甘蔗叶片的叶绿素荧光参数数据采集。根据CF Imager使用手册设定光化作用光、照光处理时间、饱和脉冲光和暗适应期等测定程序以及Fv′/Fm′、ФpsⅡ、qP和NPQ等荧光参数均由测定软件控制并自动计算。测定时,选择自+2叶（心叶向下的第2片叶,确保叶子是完全展开且成熟）,取其相同叶位新鲜叶片测量叶绿素荧光图像。每处理测4片叶,取其平均值。
1.3 数据分析
原始数据的计算与处理采用Excel软件,用SPSS 18.0软件进行统计分析,各品种间的差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA）,多重比较采用最小显著差异法（LSD）,显著性水平设定为α=0.05。
2 结果与分析
2.1 低温胁迫对甘蔗叶片光合色素含量和构成的影响
光合色素在光合作用中参与光能的吸收、传递和转化的过程,可以客观反映植物光合生理能力对逆境胁迫的响应。如图1A所示,在4 ℃低温胁迫下,同一参试材料随着胁迫时间的延长其叶绿素a含量逐渐减少,其中72、168 h处理后,与CK相比参试甘蔗材料幼苗叶片的叶绿素a含量显著减少;不同参试材料之间叶绿素a含量具有一定差异且随着胁迫时间的延长而变化,其中GR2叶绿素a含量最高,GT28位居第二,而GR2、GT28的叶绿素a含量显著高于ROC22和FN39,经过72 h低温处理后,与GT28的叶绿素a含量相比GR2的减少明显,ROC22的叶绿素a含量减少比FN39明显,在168 h处理后,GT28的叶绿素a含量略高于GR2,而FN39的叶绿素a含量明显高于ROC22。低温胁迫对参试甘蔗叶片叶绿素b含量的影响（图1B）,同一参试材料其叶绿素b含量随着胁迫时间的延长而减少,其中处理24 h后,与CK相比参试甘蔗材料幼苗叶片的叶绿素b含量显著减少,继而处理72、168 h幼苗叶片的叶绿素b含量变化不大;4个参试材料中GR2叶片的叶绿素b含量相对较高,而24 h低温处理后,GR2号叶片的叶绿素b含量显著高于ROC22和FN39,随着胁迫时间的延长各材料叶片的叶绿素b含量差异反而缩小且无显著差异。类胡萝卜素与捕光色素蛋白复合体结合,具有辅助吸收光能并传递给光系统反应中心的叶绿素a的作用,还有在环境胁迫下促进非光化学淬灭耗散多余的光能避免光损伤发生的作用。如图1C所示,同一参试材料在低温胁迫的早期（0.5、8、24 h）变化幅度很小,但随着胁迫时间的延长其类胡萝卜素含量逐渐减少,其中处理72 h后,与CK相比参试甘蔗材料幼苗叶片的类胡萝卜素含量明显减少。不同材料幼苗叶片的类胡萝卜素含量比较,发现在低温处理0.5、8、24 h 后,GR2、GT28显著高于ROC22和FN39,其中GR2的含量最高,但随着胁迫时间的延长,GR2的类胡萝卜素含量与GT28的差异逐渐减少,甚至在168 h处理后,GT28的类胡萝卜素含量略高于GR2。如图1D所示,各材料低温处理后叶片的叶绿素a/b值与CK的比较,在低温处理8、24、72 h,GR2处理前后叶片的叶绿素a/b值的差值最高,其次是GT28,而ROC22和FN39处理前后叶片的叶绿素a/b值的差值在处理24 h后,就出现负值,随着胁迫时间延长至168 h后,全部参试材料处理前后叶片的叶绿素a/b值的差值都为负值,这说明低温处理后叶片的叶绿素a受到破环或合成受阻导致含量下降。
图1 低温胁迫对甘蔗幼苗叶片光合色素含量的影响不同小写字母表示显著差异（P<0.05）,误差线表示标准差（SD）。常温下生长的幼苗为CK;4 ℃低温胁迫为T。 Fig. 1 Effect of low-temperature stress on the photosynthetic pigments content of sugarcane seedling leaves Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05) according to ANOVA analysis. The error bar indicates the ± SE of the means. Plants raised under normal temperature represent the control (CK); artificial simulation of 4 ℃ cryogenic treatment (T). |
2.2 低温胁迫对甘蔗叶绿素荧光参数的影响
2.2.1 低温胁迫对甘蔗叶片的PSⅡ光化学效率的影响 植物叶片的PSⅡ有效光化学效率（Fv'/Fm'）反映开放的PSⅡ反应中心原初光能捕获效率;PSⅡ实际光化学效率（ΦpsⅡ）,代表线性电子传递的量子效率。如图2A所示,在低温处理0.5 h后,4个材料叶片的PSⅡ有效光化学效率迅速下降,但相互之间无显著差异。在低温处理8 h后,GR2、GT28的PSⅡ有效光化学效率变化不明显,相反ROC22和FN39的PSⅡ有效光化学效率受低温抑制而降低,彼此的差异变大。然而经过短期调节,在低温处理24 h后,全部参试材料的PSⅡ有效光化学效率均略有回升,但随胁迫时间增加至72 h后,参试材料的PSⅡ有效光化学效率急剧下降,而低温处理168 h与其相比几乎没有变化,而耐寒能力强的GR2和GT28的PSⅡ有效光化学效率明显高于耐寒性差的ROC22和FN39。与此同时,PSⅡ实际光化学效率（ΦpsⅡ）也因受到胁迫而呈现明显抑制（图2B）,在低温处理0.5 h,呈现快速降低的趋势,而在低温处理0.5~24 h期间,参试材料的PSⅡ实际光化学效率随着胁迫时间延长而下降且相互之间的差异变大,其中低温处理24 h,耐寒性强的GR2的PSⅡ实际光化学效率显著高于低温敏感型ROC22和FN39。随胁迫时间延长至72 h,GR2的PSⅡ实际光化学效率与GT28的差异开始缩小,甚至在低温胁迫168 h后,GR2的PSⅡ实际光化学效率低于GT28。结合图1的数据分析表明PSⅡ有效光化学效率与其光合色素含量有关。
图2 低温胁迫对甘蔗幼苗叶片PSII光化学效率参数的影响“*”表示显著差异（P<0.05）。常温下生长的幼苗为CK;4 ℃低温胁迫为T。 Fig. 2 Effects of low temperature stress on photochemical efficiency parameters of PS Ⅱ in sugarcane seedling leaves “*” indicates significant difference according to ANOVA analysis(P<0.05). Plants raised under normal temprature represent the control (CK) ; Artificial simulation of 4 ℃ cryogenic treatment (T) . |
2.2.2 低温胁迫对甘蔗叶片的光化学淬灭和非光
化学淬灭的影响 化学淬灭以系数（qP）表示,是PSⅡ反应中心中开放度的反应中心所占比例的指标,或者将捕获的光子能量用于光化学反应的能力指标。在低温胁迫下,叶片的光合机构受到抑制导致PSⅡ反应中心捕获的光子能量用于光化学反应的能力减弱。如图3A所示,不同甘蔗材料在4 ℃低温胁迫下,qP的变化与实际光化学效率（ΦpsⅡ）的趋势相似,只是在低温处理8、24 h后,GR2的qP显著高于ROC22和FN39。这说明在低温胁迫早期阶段（0~24 h）叶片qP的变化是甘蔗幼苗进行快速调节的现象,随着胁迫的时间延长（72~ 168 h）,叶片qP的变化是甘蔗幼苗通过短期适应的结果;但不同材料因光合色素的含量与构成比例的不同,其qP的变化也各不相同。非光化学淬灭以系数（NPQ）表示,反映天线色素吸收的光能中,不能参与光化学反应的部分引起的荧光淬灭。如图3B所示,在低温胁迫0.5 h后,NPQ急剧上升,是因为低温限制了光合机构对吸收光能用于光化学反应的部分迅速增加导致的,在胁迫0.5~24 h过程中,ROC22、FN39和GT28的NPQ仍持续增大,相比之下GR2的升幅较明显,随着胁迫时间的延长至72 h,NPQ又呈现急剧上升,但处理168 h后与其相比无明显变化。
图3 低温胁迫对甘蔗幼苗叶片光化学淬灭和非光化学淬灭的影响的影响“*”表示显著差异（P<0.05）。常温下生长的幼苗为CK;4 ℃低温胁迫为T。 Fig. 3 Effects of low temperature stress on photochemical quenching and non-photochemical quenching of sugarcane seedling leaves “*” indicates significant difference according to ANOVA analysis (P<0.05). Plants raised under normal temprature represent the control (CK); Artificial simulation of 4 ℃ cryogenic treatment (T) . |
3 讨论
早期响应（0~24 h）阶段,在4 ℃低温胁迫0~0.5 h期间,甘蔗叶片光合色素含量和构成比列几乎没有变化,但是叶片的PSⅡ有效光化学效率（Fv'/Fm'）和实际光化学效率（ΦpsⅡ）出现明显的降低,光化学淬灭系数（qP）的变化趋势也相似,而叶片的非光化学淬灭系数（NPQ）迅速增大。这说明低温胁迫抑制了与甘蔗光合作用过程相关的酶活性,还抑制了甘蔗的抗氧化酶系统的酶活性导致活性氧迅速增加[28]。在0.5~24 h处理期间,甘蔗叶片光合色素含量略有降低,而其构成比列的差异呈现逐渐增大,此时同一品种叶片的Fv'/Fm'、ΦpsⅡ、qP和NPQ参数的变化不大,但GR2、GT28的qP和NPQ参数明显高于其他品种（系）,说明它们具有较强的低温耐受能力。在早期响应阶段其叶片不仅将吸收的光能用于光化学电子传递的效率比较高,而且耗散过剩能量的能力也较强,能有效地减少活性氧的产生进而对细胞的质膜起到一定的保护作用。这与Baker等[29]和Holt等[30]研究结果一致,认为叶片能通过非辐射的热能耗散途径耗散过剩的光能,从而避免对光合机构的继续伤害。因此,在逆境胁迫下非光化学淬灭过程通过能量耗散增强可有效清除PSⅡ反应中心过剩激发能的积累,被认为是植物体维持光合机构有效运行的一种保护策略[30,31]。
短期适应（24~168 h）阶段中,参试材料在（24~72 h）的胁迫期间,叶片光合色素因为低温造成的合成受阻及结构破坏,导致含量大幅减少且构成比列也明显改变。这种光合色素含量与构成的变化进而抑制了光合作用过程的光能的吸收、光化学反应转化光能、非光化学热能耗散以及叶绿素荧光形式耗散过剩光能。因此甘蔗叶片的Fv'/Fm'、ΦpsⅡ再次大幅降低,qP也迅速减小,而NPQ与之相反持续增大。其中GR2的非光化学淬灭的能量耗散显著加强,这可以减少PSⅡ反应中心和电子传递链的过分还原,与叶黄素循环的运行状况及叶黄素库的大小相关,是植物防止光能过剩导致光合机构光破坏的保护性机制[32,33,34]。但胁迫时间的延长活性氧导致细胞质膜过氧化加剧,叶绿体等细胞器受损,造成了PSⅡ的部分失活或伤害,限制了光合碳代谢的电子供应,从而抑制了光合作用。然而活性氧也是一种信号分子启动并控制清除活性氧相关抗基因的表达,这种损伤须要经过一定时间的减缓或者恢复[14, 35]。在72~168 h处理期间,同一参试材料的光合色素含量变化幅度很小,其叶片的Fv'/Fm'、ΦpsⅡ、qP和NPQ变化的趋势不明显,但是不同参试材料其色素构成变化相对明显,而且耐寒性较强的GR2和GT28叶片荧光参数Fv'/Fm'、ΦpsⅡ、qP都明显高于耐寒性差的ROC22、FN39。特别是168 h处理后GT28的Fv'/Fm'、ΦpsⅡ、qP参数与GR2相比略有升高,这可能是GT28经过一段时间的适应其抗氧化酶保护系统等保护机制综合优势体现,对光合机构起到了保护作用。
植物的光合作用过程受低温、干旱、强光等环境因素的影响比较明显。本研究通过模拟低温胁迫对甘蔗幼苗的光合色素含量与构成及光合生理特性影响,发现甘蔗对低温胁迫的适应包含早期响应和短期适应阶段,能够通过增加光合机构过剩激发能的耗散和调整其叶片光合色素含量与构成进行有效的光能利用和分配。据此认为,这可能是植物对低温胁迫的一种保护性策略。