狗牙根[Cynodon dactylon (L.) Pers]是一种耐高温、耐干旱能力强的多年生暖季型草坪草。狗牙根的根茎和匍匐茎十分发达,且具有再生能力强、耐践踏、抗旱、色泽鲜艳、质地好、成坪快等优良特性,是我国最重要的暖季型草坪草之一,被广泛应用于运动草坪、游憩草坪及护坡草坪建植中[1-][2]3]。
低温是限制暖季型草坪草分布和利用的主要因素[4]。狗牙根是典型的暖季型草坪草,其最适生长温度为26~32 ℃,气温低于15 ℃即停止生长,7~10 ℃时变为棕黄色[5,6],因此,对低温胁迫的耐受性是评价狗牙根坪用质量的一个重要指标。前人已对狗牙根的抗寒性进行了大量研究报道,Fry等研究发现狗牙根半致死温度范围为-17.1 ℃至-4 ℃[7];Taliaferro 等[8]通过模拟低温胁迫来研究狗牙根对低温的耐受性,结果显示,狗牙根的半致死温度范围是-10.3 ℃~-5.4 ℃。景艳杰等[9]用电解质外渗法对102份新疆狗牙根和10份疆外狗牙根进行抗寒性评价,结果显示,疆内和疆外狗牙根叶片平均LT50分别是-14.84 ℃和-12.31 ℃,变异系数分别为9.92%和13.88%。通过以上研究可以看出,不同品种的狗牙根及种源间的抗寒性存在较大的遗传变异。电解质外渗法常用于评估低温引起的细胞损伤水平,并可以用来评估草坪草的相对冷冻耐受性[10]。Shashikuma等[11]通过电解质外渗法和TTC法评价狗牙根的耐寒性,发现供试品种间抗寒性存在显著性差异,且电解质外渗法与TTC法实验结果吻合,说明电解质外渗法可以用来作为评价狗牙根抗寒性的指标。刘燕等[12]用恢复实验法,来评价国产海雀稗对低温的耐受性,发现通过测定再生嫩枝的数目来评价植物抗寒性是一种有效的方法。
目前国内生产上应用的狗牙根品种多为进口的Tif系列狗牙根,如‘Tifway’、‘Tifgreen’、‘Tifdrawf’等。这类引进品种普遍存在成本高、适应性差、养护水平要求高、应用范围小等问题。为选育适合我国本土的狗牙根品种,江苏省中国科学院植物研究所从1993年从国内外大量收集暖季型草坪草种质资源,并开展了一系列的评价工作,选育出优质抗逆的狗牙根新品种‘阳江’狗牙根。但是‘阳江’狗牙根同时也存在花序密度较高的问题,影响坪用质量,并且会增加管理成本。许多研究表明,辐射诱变育种是获得优良新种质的一种快速有效的育种手段,且辐射诱变在引起形态变异的同时也会改变草坪草的抗逆性。Li等用50Gy和70Gy的60Co γ射线辐照钝叶草匍匐茎茎节获得了花序密度低且节间较短的突变体[13];Chen等用200Gy60Co γ射线辐照狗牙根的种子,对诱变后代进行抗旱性鉴定,结果表明,狗牙根辐射诱变后代的抗旱性较亲本增强[14];宋华伟等对ZS-SJZ结缕草60Co γ诱变后代进行抗寒性鉴定,发现辐射诱变可以改善结缕草的抗寒性[15]。因此本课题组于2015年以‘阳江’狗牙根的匍匐茎为外植体,开展了辐射诱变育种的工作,通过60Co γ射线进行辐射诱变,单节种植,获得了42个诱变后代。经过初步形态观测,从中选出了12个坪用价值高且花序密度低的后代。恢复实验法可直接鉴定植物抗寒性,是一种较为简单的传统鉴定方法;电导法属于比较经典的抗寒性鉴定方法,目前采用较多,且操作简单、可信度高。本研究通过电解质外渗法和低温胁迫后匍匐茎恢复实验对这些狗牙根诱变后代进行抗寒性评价,与‘阳江’狗牙根亲本进行比较,以明确其抗寒性,为新品系的推广应用和进一步改良奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究的实验材料为阳江狗牙根[Cynodon dactylon (L.) Pers]及其通过60Co γ射线辐射诱变‘阳江’狗牙根匍匐茎外植体获得的12个坪用价值高且花序密度低的诱变后代,分别为M1、M4、M10、M16、M18、M22、M25、M26、M28、M29、M31、M37。
1.2 方法
1.2.1 电解质外渗率测定法 根据郭海林等[16]的方法,采用电导法对叶片的电解质透出率进行测定,4次重复。取供试材料健康植株的叶片,清水冲洗干净后用去离子水漂洗3次,用滤纸吸干表面水分,将叶片剪至0.2 cm左右长,分成5份,每份1 g,用湿纱布包好置于试管中,在4 ℃冰箱中过夜,第2天在低温循环仪（Polyscience公司,Model：SD28R-30-A12Y）中进行低温处理。温度梯度设为0、-5、-10、-15、-20 ℃处理1.5 h,处理后置于4 ℃冰箱解冻,第三天将每个处理分成4等分（4个重复）,置于试管中,加入去离子水20 mL,在室温下浸提。第四天用电导仪（上海雷磁仪器,Model：DDS-307）测定电导率,然后沸水浴15 min,待其冷却到室温后,测定其煮沸电导率。
电解质外渗率=(冷冻电导率/煮沸电导率)×100%
1.2.2 匍匐茎恢复生长实验 选取13份参试狗牙根生长基本一致的茎尖以下的2~4节共含3节的匍匐茎,进行5个梯度（同叶片处理温度）的冷冻处理,每个处理用6根匍匐茎。将冷冻处理的材料放在4 ℃冰箱解冻24 h,然后种植在规格为10 cm×10 cm的花盆中（栽培基质为半土半沙）,在大棚中进行统一管理。
根据Dunn[17]的方法,以冷冻处理后的匍匐茎在恢复生长实验中长出的嫩枝数目评价其抗寒性。实验前,统计每个处理6根茎3个节上的潜伏芽数均为36,冷冻材料在种植4个星期后统计每个匍匐茎长出的嫩枝数目（萌芽数）,计算恢复生长的百分率,作为评价其抗寒性的指标。
1.3 数据处理
2 结果与分析
2.1 叶片电解质外渗率测定结果
2.1.2 LT50比较分析 表1为根据供试材料在模拟低温处理下电解质渗出率求得的Logistic方程及其拟合度和半致死温度。
表1 Logistic方程及LT50值Tab. 1 The Logistic equations and LT50 |
| 材料 Samples | Logistic方程 Logistic equations | 拟合度 R2 | 半致死温度 LT50/℃ |
|---|---|---|---|
| M18 | $Y=\frac{89.065\ 85}{1+3.656\ 95{{e}^{-0.17227X}}}$ | 0.9412** | -7.6 |
| M4 | $Y=\frac{85.199 57}{1+3.068 53{{e}^{-0.15366X}}}$ | 0.9898** | -7.3 |
| M26 | $Y=\frac{113.624 73}{1+1.878 73{{e}^{-0.11727X}}}$ | 0.9149* | -5.4 |
| M28 | $Y=\frac{98.799 97}{1+3.305 82{{e}^{-0.25847X}}}$ | 0.9483** | -4.6 |
| M22 | $Y=\frac{98.714 26}{1+1.752 60{{e}^{-0.14502X}}}$ | 0.8046* | -3.9 |
| CK | $Y=\frac{97.040 65}{1+2.777 40{{e}^{-0.28079X}}}$ | 0.9726** | -3.6 |
| M29 | $Y=\frac{96.957 56}{1+2.450 62{{e}^{-0.29983X}}}$ | 0.9460** | -3.0 |
| M31 | $Y=\frac{103.730 00}{1+7.720 74{{e}^{-0.18106X}}}$ | 0.9303** | -3.0 |
| M10 | $Y=\frac{72.927 29}{1+1.604 96{{e}^{-0.17061X}}}$ | 0.9430** | -2.8 |
| M37 | $Y=\frac{93.923 21}{1+1.745 08{{e}^{-0.24659X}}}$ | 0.9277** | -2.3 |
| M16 | $Y=\frac{69.926 69}{1+1.296 38{{e}^{-0.17342X}}}$ | 0.8777* | -1.5 |
| M1 | $Y=\frac{91.626 72}{1+1.070 40{{e}^{-0.05487X}}}$ | 0.7712* | -1.2 |
| M25 | $Y=\frac{88.361 60}{1+1.050 00{{e}^{-0.30389X}}}$ | 0.9634** | -0.2 |
注：**和*分别表示拟合度达极显著（P<0.01）和显著（P<0.05）水平。材料顺序按照半致死温度的值升序排列。 | |
Note: ** and * represent R significant at P<0.01 and P<0.05, respectively. Material order in ascending order of semi-lethal temperature values. |
由表1可见,方程的拟合度均达到了显著（P<0.05）水平,表明LT50可以作为评价狗牙根抗寒性的依据。从半致死温度结果可以看出,供试材料的LT50变化范围为-7.6 ~-0.2 ℃,最低值与最大值相差7.4 ℃,可见供试诱变后代的抗寒性存在差异。其中,半致死温度低于-5 ℃的有M18（LT50=-7.6 ℃）、M4（LT50=-7.3 ℃）、M26（LT50=-5.4 ℃）,叶片抗寒性较强;半致死温度在-5 ~-2 ℃之间的诱变后代有M28（LT50= -4.6 ℃）、M22（LT50=-3.9 ℃）、M29（LT50= -3.0 ℃）、M31（LT50=-3.0 ℃）、M10（LT50= -2.8 ℃）、M37（LT50=-2.3 ℃）叶片抗寒性相对较强;半致死温度高于-2 ℃的有M16（LT50= -1.5 ℃）、M1（LT50=-1.2 ℃）、M25（LT50 = -0.2 ℃）,叶片抗寒性较弱。
与亲本相比,供试诱变后代中,M29、M31、M10、M37、M16、M1、M25的叶片半致死温度高于亲本,叶片抗寒性弱于亲本。其余诱变后代（M18、M4、M26、M28、M22）半致死温度均低于亲本,叶片抗寒性优于亲本。由表1可知,供试诱变后代中,M18的半致死温度最低,为-7.6 ℃,较亲本低4 ℃,而诱变后代M25的半致死温度最高为-0.2 ℃,较亲本高3.4 ℃,由此可见,供试诱变后代的抗寒性与亲本存在明显差异。
2.2 匍匐茎恢复生长实验
供试材料匍匐茎萌芽率统计结果见表2,材料顺序按照总萌芽率降序排列。
表2 不同低温处理下匍匐茎恢复生长率Tab. 2 Stolon shooting rate after different low temperature % |
| 材料 Samples | 温度Temperature/℃ | 材料 Samples | 温度Temperature/℃ | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 0 | -5 | -10 | -15 | -20 | 0 | -5 | -10 | -15 | -20 | ||
| M1 | 83.3+ | 63.9+ | 0 | 0 | 0 | M26 | 63.9+ | 44.4+ | 5.6 | 0 | 0 |
| M4 | 38.9 | 36.1 | 5.6 | 0 | 0 | M28 | 75.0+ | 38.9 | 5.6 | 0 | 0 |
| M10 | 52.8+ | 36.1 | 0 | 0 | 0 | M29 | 58.3+ | 41.7* | 0 | 0 | 0 |
| M16 | 47.2 | 25.0 | 0 | 0 | 0 | M31 | 54.3+ | 42.9+ | 0 | 0 | 0 |
| M18 | 50.0* | 44.4+ | 0 | 0 | 0 | M37 | 66.7+ | 36.1 | 0 | 0 | 0 |
| M22 | 58.3+ | 52.8+ | 0 | 0 | 0 | CK | 50.0 | 41.7 | 0 | 0 | 0 |
| M25 | 72.2+ | 61.1+ | 0 | 0 | 0 | ||||||
Note: + indicates that the recovery growth rate is higher than the CK, - indicates that the recovery growth rate is lower than the CK, and * indicates that the recovery growth rate is consistent with the CK. | |
注：+表示恢复生长率高于亲本,-表示恢复生长率低于亲本,*表示恢复生长率与亲本一致。 |
由表2可见,所有供试材料在-15 ℃冷冻处理后,匍匐茎均不能恢复生长;在-10 ℃冷冻处理下有3份诱变后代可以恢复生长,即M4、M26、M28,且恢复生长率均为5.6%,其余材料全部死亡。在0 ℃低温处理下,所有供试诱变后代均能恢复生长,诱变后代中仅M4和M16的恢复生长率低于亲本,其中M4恢复生长率最低,仅有38.9%;M1的恢复生长率最高为83.3%,M25的恢复生长率仅次于M1为72.2%。同样,在-5 ℃低温下,所有供试材料均能恢复生长,诱变后代中M4、M10、M16、M28和M37的恢复生长率低于亲本,M16的恢复生长率最低,为25%,M1的恢复生长率最高为63.9%,M25的恢复生长率仅次于M1为61.1%。
综合以上分析可以得出,诱变后代M1、M22、M26、M31、M25在0 ℃和-5 ℃低温胁迫后的恢复生长率都高于亲本,恢复能力均优于亲本;M10、M37、M28在-5 ℃低温胁迫下,恢复生长能力低于亲本,抗寒性相对较弱,M16和M4在0 ℃和-5 ℃低温胁迫下,恢复生长率都低于亲本,抗寒性明显弱于亲本。
2.3 叶片半致死温度（LT50）与匍匐茎恢复生长的关系
叶片电解质外渗法结果表明,供试诱变后代中M18、M4、M26、M28、M22的半致死温度低于亲本,其中M18、M4的半致死温度均低于-7 ℃,抗寒性明显优于亲本;诱变后代M29、M31、M10、M37、M16、M1、和M25的半致死温度（LT50）均高于亲本,且M16、M1、和M25的半致死温度（LT50）均高于-2 ℃,抗寒性明显弱于亲本。匍匐茎恢复实验结果表明：在0 ℃低温胁迫后仅有M16、M4的恢复生长率低于亲本,在-5 ℃低温胁迫后,M28、M37、M4、M10、M16的恢复生长率低于亲本。其中,M1、M22、M25、M26、M31在0 ℃和-5 ℃低温下恢复生长率均高于亲本,抗寒性明显优于亲本。而M4和M16恢复生长率均低于亲本,抗寒性明显弱于亲本。
2种方法结果显示：诱变后代M1、M25在电解质外渗法中表现抗寒性较弱,而在恢复实验中表现抗寒性较好,而M28和M24在恢复实验中表现为抗寒性较弱,在电解质外渗法中表现抗寒性较好;M10、M16和M37在2种方法中都表现较弱的抗寒性;M22、M18、M26在2种方法中都表现较强的抗寒性。
3 讨论
植物对低温的抵抗能力,即抗寒性,是限制狗牙根应用的重要环境因素。测定狗牙根抗寒性常用的4种方法有电导法[20]、恢复实验法[12]、TNC法[21]、PEGE凝胶法[22,23]。恢复实验法较为简单,是一种传统的直接鉴定法,但外界干扰因素较多,不易控制;电导法目前采用较多,属于比较经典的测定狗牙根抗寒性的方法,且操作简单、可信度高;TNC法和PAGE法由于抗寒机理复杂,尚未得到充分揭示。所以,对狗牙根抗寒性的评价大多采用电导法和恢复实验法。为了提高抗寒性测定结果的准确性,本研究综合应用电导法和恢复实验法对‘阳江’狗牙根诱变后代进行抗寒性鉴定,通过对两种方法实验结果的比较分析,明确了诱变后代的抗寒能力,为新品系的推广应用和进一步改良提供基础。
本研究结果表明,半致死温度（LT50）最低的诱变后代M1（LT50=-7.6 ℃）与半致死温度（LT50）最高的诱变后代M25（LT50=-0.2 ℃）较亲本（LT50=-3.6 ℃）半致死温度分别相差低4 ℃和3.4 ℃。郭海林等[24]用电解质外渗法对杂交狗牙根60Co γ射线诱变后代进行抗寒性鉴定,结果表明,诱变后代的叶片半致死温度（LT50）均高于对照,且最高半致死温度（LT50）与对照相差5.16 ℃。张彦芹等[25]用电解质外渗法对高羊茅诱变后代进行抗寒性评价发现,诱变后代的电解质外渗率与亲本差异极显著,且抗寒性明显优于亲本。由此可见,辐射诱变后代的抗寒性与亲本存在明显差异,且辐射诱变可以改善狗牙根的抗寒性,为狗牙根种质创新奠定了基础。参试诱变后代半致死温度（LT50）变化范围为-7.6~-0.2 ℃,王志勇等[26]用电导法对国内30份普通狗牙根进行抗寒性评价,得到的半致死温度（LT50）范围为-6.57~-0.29 ℃,与本研究测定的狗牙根LT50变化范围相当。Anderson等[27]通过测定低温胁迫后狗牙根再生长量来对不同地区的狗牙根品种进行抗寒性评价,结果发现狗牙根的抗寒性与其地理位置显著相关,热带亚热带地区狗牙根抗寒性较弱。供试诱变后代的亲本‘阳江’狗牙根原产广东阳江,所以半致死温度的试验结果与亲本本身的抗寒性有关。
匍匐茎恢复实验采用与叶片电解质外渗法同样的温度梯度,对诱变后代的匍匐茎进行低温处理,通过潜伏芽恢复生长的百分率来评价其抗寒性。匍匐茎恢复实验可直接表明诱变后代在低温胁迫下的恢复生长能力。从结果可以看出,所有供试材料在0 ℃和-5 ℃低温胁迫下均能恢复生长,低于-10 ℃均不能恢复生长,郭海林等[10]用恢复实验法对结缕草杂交后代进行抗寒性评价,结果显示,所有供试材料在低于-6 ℃时,均不能恢复生长,在-2 ℃时,参试材料均可恢复生长,可见‘阳江’狗牙根部分诱变后代的恢复生长能力高于结缕草杂交后代。在-5 ℃低温胁迫下,M4、M10、M16、M28、M37的恢复生长率低于亲本,其中,M16的恢复生长率最低,仅有25%,抗寒性明显弱于亲本,M37、M4、M10仅次于M16,恢复生长率均为36.1 ℃,抗寒性相对较弱。诱变后代M1、M22、M25、M26、M31在0 ℃和-5 ℃低温胁迫后的恢复生长率均高于亲本,其中M1和M25恢复生长率最高,抗寒性最好。
由以上分析可知,2种实验结果并不完全一致,诱变后代M1和M25叶片抗寒性较弱,但在恢复实验中表现较强的恢复生长能力,说明这2个品种在环境温度降低时会把叶片的能量转移到茎内,所以在叶片枯黄之后仍保留较强的恢复能力;诱变后代M28和M4的半致死温度较低,但在恢复实验中表现抗寒性较弱,说明这2个品种的青绿期较长,在寒冷期会消耗大量能量来保持叶色,因而匍匐茎中的能量减少,恢复能力变弱;其他诱变后代的半致死温度结果与恢复实验吻合,说明在环境温度降低时叶片和匍匐茎之间能量维持平衡的状态。恢复生长能力和青绿期对于一个草坪草种而言是至关重要的,它决定草坪草的返青状况和坪用质量,所以应结合电解质外渗法和恢复实验法从不同层面来对草坪草种的抗寒性进行综合分析。
根据2种方法对狗牙根诱变后代的鉴定结果：诱变后代M1、M25的恢复能力较强;M4、M28的叶片抗寒性较好,青绿期较长;M22、M18、M26的叶片抗寒性和匍匐茎恢复能力均较强;M29、M31的叶片抗寒性和匍匐茎恢复能力与亲本相似;M10、M16、M37的叶片抗寒性和匍匐茎恢复能力均较弱,整体抗寒性较弱。此结果将作为今后选取花序密度低且性状优良的优质狗牙根新品种的依据,为新品系的推广应用和进一步改良奠定基础。