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2019 , Vol. 40 >Issue 2: 289 - 299

DOI: https://doi.org/10.3969/j.issn.1000-2561.2019.02.012

生物技术与组织培养

芒果果实bHLH家族转录因子的生物信息学分析

  • 郑斌 ,
  • 文定青 ,
  • 武红霞 , * ,
  • 邹明宏 ,
  • 刘恒 ,
  • 王松标 ,
  • 赵巧丽
展开
  • 中国热带农业科学院南亚热带作物研究所/国家热带果树种质资源圃/农业农村部热带果树生物学重点实验室,广东湛江 524091
* 武红霞（WU Hongxia）,E-mail： 。

郑 斌（1989—）,男,硕士,研究实习员,研究方向：果树种质资源与分子生物学。

收稿日期: 2018-06-28

  要求修回日期: 2018-10-13

  网络出版日期: 2019-05-16

基金资助

广东省自然科学基金-粤东西北创新人才专项(2016A030307006)

国家重点研发计划项目(2017YFD0202107)

热带果树种质资源收集、鉴定、编目、繁殖更新与保存分发利用专项()

版权

版权所有，未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
收起

Bioinformatics Analysis of bHLH Transcription Factor Family in Mango (Mangifera indica Linn.)

  • ZHENG Bin ,
  • WEN Dingqing ,
  • WU Hongxia , * ,
  • ZOU Minghong ,
  • LIU Heng ,
  • WANG Songbiao ,
  • ZHAO Qiaoli
Expand
  • South Subtropical Crops Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / National Field Genebank for Tropical Fruits / Key Laboratory of Tropical Fruit Biology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Zhanjiang, Guangdong 524091, China

Received date: 2018-06-28

  Request revised date: 2018-10-13

  Online published: 2019-05-16

Copyright

Copyright reserved © 2019
Fold

摘要

bHLH家族作为植物中较大的转录因子家族之一,在真核生物生长发育调控中具有重要作用。本研究基于芒果果实转录组数据,利用生物信息学方法鉴定出87个bHLH家族蛋白,其中酸性蛋白所占比例较大,大部分为不稳定蛋白,且均为不含信号肽的亲水性蛋白,除CL10714.Contig1为膜结合转录因子外,其余均不含跨膜结构。芒果bHLH蛋白结构域有多个氨基酸位点保守性较高,87个芒果bHLH蛋白中73个（83.91%）具有E-box结合功能。GO分析发现芒果bHLH蛋白共注释到生物学过程、细胞组分和分子功能3大类功能的17个亚类。进化树分析发现芒果bHLH蛋白与拟南芥有较高的保守性,并基于进化树对部分bHLH蛋白的功能进行了预测。本研究结果将为下一步芒果bHLH蛋白的功能研究奠定基础。

关键词： 芒果; bHLH家族; 转录因子; 生物信息学

本文引用格式

郑斌 , 文定青 , 武红霞 , 邹明宏 , 刘恒 , 王松标 , 赵巧丽 . 芒果果实bHLH家族转录因子的生物信息学分析[J]. 热带作物学报, 2019 , 40(2) : 289 -299 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.02.012

Abstract

As one of the large transcription factor families, bHLH gene family plays an important role in the regulation of growth and development in eukaryotes. Based on the results of transcriptome sequencing of fruits in mango, a total of 87 bHLH family proteins were identified with bioinformatics approaches, in which acid proteins accounted for a large proportion and most of them were unstable proteins. All of those proteins were hydrophilic proteins without signal-peptide. Except CL10714.Contig1, all of them had transmembrane region. Multiple amino acids were highly conserved within the bHLH domains of mango bHLH proteins, and 73 of 87 (83.91%) mango bHLH proteins had E-box binding activity. In addition, GO (gene ontology) analysis showed that the bHLH proteins of mango were annotated into 17 subclasses of biological processes, cellular components and molecular function. Phylogenetic tree analysis showed that mango bHLH proteins were highly conserved with Arabidopsis, and the function of some bHLH proteins were predicted. These results would lay a foundation for the further functional analysis of mango bHLH proteins．

Key words： mango (Mangifera indica Linn.); bHLH family; transcription factor; bioinformatics

碱性螺旋-环-螺旋（basic Helix-Loop-Helix, bHLH）转录因子为真核生物蛋白中的一个大家族[1],在生物的生长发育调控中起着极为重要的作用。bHLH转录因子于1989年首次在动物中发现,因含有bHLH结构域而得名[2]。bHLH结构域由大约60个氨基酸组成,分为碱性氨基酸区域（basic）和α-螺旋-环-α-螺旋区（HLH）,碱性氨基酸区位于bHLH结构域的N端,长度约为15个氨基酸,主要负责与DNA顺式元件结合,HLH区位于该结构域的C-端,由大约40个氨基酸组成,具有形成二聚体的特性[2,3,4]。
植物中bHLH转录因子是仅次于MYB的第二大转录因子家族[5],其参与调控抗逆、器官发育、激素响应及代谢物合成等多个生物学进程[6]。与对照相比,拟南芥中过表达bHLH122基因的株系对干旱、NaCl和渗透胁迫的抗性增强[7];Jiang等[8]发现bHLH转录因子参与了黄瓜果实长度的调控;在拟南芥中,bHLH基因BEE1、BEE2和BEE3参与对油菜素内酯的响应,且这3个基因在油菜素内酯的信号传导中功能冗余[9];MdbHLH33参与调控苹果花色素苷的生物合成[10]。
基于高通量测序及生物信息学分析技术,人们已对一些植物的bHLH基因家族进行了挖掘、比较分析和功能预测,并对部分bHLH基因进行了功能分析。基于基因组信息,Geng等[11]在甜橙中发现56个bHLH转录因子,其中CsbHLH18通过调控抗氧化基因调节植株耐寒性及活性氧平衡。芒果素有“热带果王”之美誉,含有丰富的糖类、蛋白质、维生素、类胡萝卜素和钙质等营养成分,在我国主要分布在海南、广西、云南、四川、广东和福建等地,已成为我国热区农业的支柱产业[12],但目前关于芒果bHLH转录因子的研究还鲜有报道。为此,本研究基于芒果果实转录组测序结果,利用生物信息学手段对bHLH家族基因进行鉴定和分析,为进一步探究芒果bHLH转录因子的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

芒果蛋白序列来源于构建的转录组数据库（GenBank accession SRP035450）。拟南芥bHLH家族氨基酸序列下载于拟南芥信息资源（TAIR）数据库（http://www.arabidopsis.org/）。

1.2 方法

1.2.1 芒果bHLH家族蛋白的鉴定 从Pfam 31.0[13]数据库（http://pfam.xfam.org/）下载HLH结构域种子文件PF00010和PF14215,利用HMMER 3.1b2[14]软件分别构建Profile HMM（数值表格型隐马可夫模型）,基于Profile HMM分别检索芒果转录组蛋白数据库并对检索结果进行整合去冗余,得到候选蛋白。将候选蛋白用SMART[15]（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析HLH结构域,同时用NCBI blast（https://blast. ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）和植物转录因子数据库[16]（PlantTFDB）（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）进行进一步分析鉴定,筛选出具有全长氨基酸序列的芒果bHLH转录因子。
1.2.2 芒果bHLH家族蛋白生物信息学分析 基于筛选鉴定的芒果bHLH家族蛋白,利用在线工具ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）对其进行理化性质分析,并用在线软件SOPMA[17]（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_ sopma.html）分析其二级结构,信号肽的预测应用SignalP 4.1 Server[18]（http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/）软件进行分析,最后采用TMHMM Server v. 2.0（http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/）在线软件完成跨膜结构分析。
1.2.3 芒果bHLH家族蛋白结构域分析 使用BioEdit软件对芒果bHLH家族蛋白结构域进行比对,将比对结果用在线软件WebLogo 3（http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi）分析结构域序列标签。
1.2.4 芒果bHLH家族蛋白系统发育树构建及基序分析 利用MEGA 6.0软件内置的Clustal W程序对芒果bHLH家族蛋白的氨基酸序列进行比对分析,将比对结果采用邻接法构建系统发育树,选用Poisson模型,并进行自举评估（Bootstrap）,重复次数为1000次,缺失值处理方式为配对状态删除（pairwise deletion）,其他参数使用默认值[19]。运用MEME 4.11.02程序[20]分析芒果bHLH家族蛋白的基序,设定基序宽度为6~50,基序数量为5,其余参数为默认值。
1.2.5 芒果bHLH家族蛋白GO分析 首先使用Blast2GO 4.0软件[21]对芒果bHLH家族蛋白序列进行GO（gene ontology）注释,然后用在线软件WEGO[22]（http://wego.genomics.org.cn/cgi-bin/ wego/index.pl）绘制GO功能分类图。
1.2.6 芒果和拟南芥bHLH蛋白进化树构建 使用MEGA 6.0软件采用最大似然法将芒果bHLH蛋白和拟南芥bHLH蛋白共同构建进化树。

2 结果与分析

2.1 芒果bHLH家族成员的获得

基于从Pfam 31.0数据库下载的种子文件PF00010和PF14215,使用HMMER 3.1b2软件从芒果转录组49 117个蛋白序列中分别筛选出211个和86个候选蛋白序列,逐个进行结构域及同源比对分析,去除重复及非全长氨基酸序列,共获得87个芒果bHLH家族蛋白序列（表1）,其中最小的bHLH蛋白含89个氨基酸,最大的bHLH蛋白含944个氨基酸。
表1 芒果bHLH家族蛋白的识别、理化性质及二级结构分析

Tab. 1 Identification, physicochemical properties and secondary structure analysis of bHLH family proteins in mango

基因编号
Gene ID		 鉴定结果
Identification		 理化性质
Physicochemical properties		 二级结构
Secondary structure
氨基酸数量
Number of amino acids		 同源拟南芥基因代码
Homologous gene locus in Arabidopsis		 E值
E-value		 相对分
子量
Molecular weight
/ku		 理论等电点
Theoretical pI		 不稳定系数
Instability index		 平均疏
水指数
Grand average of hydropathicity		 α-螺旋
α-helix/%		 延伸链
Extended strand/%		 β-转角
β-turn/%		 无规
卷曲
Random coil/%
Unigene17350 324 AT5G46690.1 4E-65 36.11 8.70 48.08 -0.222 52.78 15.43 4.63 27.16
CL9462.Contig3 318 AT1G72210.1 3E-75 35.96 6.08 57.71 -0.549 41.19 15.72 5.66 37.42
CL9462.Contig4 306 AT1G72210.1 7E-77 35.00 5.67 49.99 -0.550 43.46 15.69 5.88 34.97
CL9964.Contig2 192 AT3G06120.1 2E-88 21.45 8.69 62.75 -0.050 46.88 21.35 5.21 26.56
CL4699.Contig2 406 AT3G24140.1 1E-138 46.18 5.30 64.52 -0.698 40.64 12.81 6.65 39.90
CL5816.Contig6 394 AT3G61950.1 1E-86 44.89 6.11 67.84 -0.649 40.61 14.72 7.61 37.06
CL7468.Contig2 238 AT5G54680.1 4E-93 26.11 7.72 49.91 -0.573 39.92 13.03 6.30 40.76
Unigene8036 239 AT5G54680.1 3E-85 26.50 8.30 62.12 -0.478 46.44 12.55 4.60 36.40
CL7992.Contig2 218 AT4G14410.2 9E-84 24.83 5.70 58.34 -0.832 54.13 8.26 5.05 32.57
CL2426.Contig1 343 AT3G19860.1 2E-83 37.90 7.07 56.00 -0.912 38.78 7.29 3.50 50.44
CL3407.Contig1 240 AT3G47640.2 1E-72 26.27 5.68 46.95 -0.687 45.83 5.83 5.00 43.33
Unigene7386 92 AT1G26945.1 4E-28 10.26 7.92 91.41 -0.477 67.39 1.09 4.35 27.17
Unigene6963 89 AT3G28857.1 2E-35 10.17 7.94 84.85 -0.504 77.53 1.12 3.37 17.98
CL8621.Contig1 215 AT4G20970.1 2E-34 24.38 5.67 50.01 -0.416 50.23 13.49 4.65 31.63
CL2828.Contig1 185 AT4G20970.1 7E-44 21.06 7.91 46.69 -0.633 56.22 9.73 5.41 28.65
Unigene439 173 AT1G10585.1 1E-25 19.65 9.71 59.39 -0.516 50.29 16.76 5.78 27.17
Unigene1413 696 AT4G09820.1 1E-102 77.37 5.51 67.27 -0.610 41.52 12.93 5.32 40.23
Unigene22638 698 AT4G09820.1 1E-104 77.40 5.70 61.74 -0.535 45.70 11.03 7.31 35.96
CL3741.Contig3 587 AT5G41315.1 0 65.49 5.46 47.39 -0.361 32.88 19.42 8.35 39.35
CL6262.Contig2 657 AT5G41315.1 1E-164 73.75 5.68 48.79 -0.494 43.07 12.94 8.22 35.77
CL1202.Contig3 484 AT4G00870.1 8E-66 54.46 6.06 38.79 -0.413 40.29 21.28 7.23 31.20
CL2219.Contig1 488 AT4G00870.1 1E-85 54.57 5.88 49.73 -0.488 36.89 20.90 6.56 35.66
CL634.Contig2 607 AT1G01260.1 0 67.02 5.66 46.13 -0.469 43.33 16.14 6.75 33.77
Unigene21033 502 AT4G16430.1 0 55.35 6.41 43.78 -0.452 40.44 18.92 7.17 33.47
Unigene22477 654 AT1G32640.1 0 71.73 5.53 50.07 -0.606 38.07 16.97 7.95 37.00
CL5802.Contig2 750 AT2G31280.1 0 83.04 5.70 43.62 -0.326 35.33 20.13 7.87 36.67
Unigene21025 944 AT2G31280.1 7E-58 102.47 5.97 38.00 -0.349 38.35 13.24 10.17 38.24
CL8054.Contig2 242 AT5G57150.1 2E-93 27.50 5.35 54.39 -0.496 54.96 11.98 5.37 27.69
CL459.Contig5 267 AT3G26744.1 1E-103 29.97 5.42 52.30 -0.583 47.94 13.11 6.74 32.21
Unigene16335 549 AT3G26744.1 1E-112 60.08 5.43 44.71 -0.594 31.69 17.49 9.65 41.17
CL3000.Contig1 342 AT5G65640.1 3E-91 38.87 5.15 62.11 -0.666 35.96 13.16 5.85 45.03
Unigene19459 310 AT5G65640.1 9E-87 35.24 4.93 70.89 -0.535 41.29 11.94 4.19 42.58
CL459.Contig3 465 AT3G26744.1 1E-113 51.49 5.35 49.91 -0.530 32.04 16.77 8.17 43.01
CL9208.Contig1 550 AT5G08130.2 1E-111 60.44 8.89 53.92 -0.792 28.00 18.00 6.18 47.82
CL5018.Contig2 344 AT5G38860.1 6E-61 38.40 5.03 60.68 -0.781 40.41 12.21 6.98 40.41
CL10163.Contig3 327 AT1G69010.1 1E-104 36.71 5.32 60.96 -0.920 37.61 10.70 5.20 46.48
CL5906.Contig1 342 AT1G68810.1 5E-82 37.99 5.96 62.10 -0.566 43.27 13.16 5.85 37.72
基因编号
Gene ID		 鉴定结果
Identification		 理化性质
Physicochemical properties		 二级结构
Secondary structure
氨基酸数量
Number of amino acids		 同源拟南芥基因代码
Homologous gene locus in Arabidopsis		 E值
E-value		 相对分
子量
Molecular weight
/ku		 理论等电点
Theoretical pI		 不稳定系数
Instability index		 平均疏
水指数
Grand average of hydropathicity		 α-螺旋
α-helix/%		 延伸链
Extended strand/%		 β-转角
β-turn/%		 无规
卷曲
Random coil/%
CL5906.Contig2 339 AT1G68810.1 1E-83 37.71 5.82 60.65 -0.539 43.07 12.39 7.37 37.17
CL1356.Contig2 240 AT2G41130.1 4E-91 27.25 7.67 52.91 -0.468 47.08 15.00 5.00 32.92
CL6767.Contig4 262 AT2G40200.1 4E-43 29.15 9.28 41.74 -0.426 37.40 16.03 6.87 39.69
Unigene24183 266 AT3G25710.1 6E-29 29.57 7.62 56.30 -0.359 53.38 11.65 8.65 26.32
CL7072.Contig2 265 AT3G56770.1 6E-28 28.74 9.51 54.56 -0.337 39.62 16.60 7.92 35.85
CL8009.Contig1 535 AT3G59060.4 3E-47 58.53 6.87 46.63 -0.687 27.85 14.95 8.97 48.22
Unigene17765 527 AT2G20180.2 7E-72 57.43 6.18 60.11 -0.622 30.55 9.30 5.31 54.84
CL2367.Contig2 293 AT4G36930.1 4E-45 32.14 5.05 61.26 -0.551 27.99 15.02 3.41 53.58
CL2656.Contig6 738 AT1G09530.2 2E-56 79.78 5.63 54.79 -0.636 27.91 12.60 7.32 52.17
CL1110.Contig3 553 AT1G09530.2 9E-32 62.10 8.68 63.30 -0.753 33.27 10.31 6.69 49.73
CL9257.Contig2 387 AT4G00050.1 1E-31 42.98 9.30 68.60 -0.703 34.88 11.11 4.91 49.10
CL10714.Contig1 475 AT4G00050.1 1E-105 51.78 6.89 53.54 -0.589 29.89 10.11 3.58 56.42
CL607.Contig1 250 AT1G35460.1 2E-67 27.61 6.22 56.81 -0.817 41.60 8.00 6.40 44.00
CL8394.Contig1 371 AT2G42280.1 1E-107 41.08 8.82 41.84 -0.739 28.84 11.86 6.20 53.10
CL2955.Contig3 419 AT2G42280.1 2E-64 46.33 8.35 46.52 -0.772 33.89 13.84 8.83 43.44
CL2955.Contig4 419 AT2G42280.1 1E-64 46.26 8.08 45.65 -0.773 33.41 13.60 8.59 44.39
CL3840.Contig12 388 AT1G51140.1 2E-81 43.36 6.23 70.51 -0.849 40.72 9.79 5.67 43.81
CL3840.Contig11 401 AT1G51140.1 1E-64 45.12 6.87 66.30 -0.916 38.65 8.98 6.73 45.64
Unigene15760 348 AT1G05805.1 3E-93 37.52 8.77 59.91 -0.620 30.46 13.22 8.05 48.28
CL7240.Contig1 437 AT2G24260.1 5E-59 45.91 5.67 52.32 -0.405 43.02 9.84 5.72 41.42
CL7240.Contig2 466 AT2G24260.1 3E-58 49.05 5.90 46.21 -0.498 37.77 11.59 7.08 43.56
Unigene20795 329 AT4G02590.3 2E-54 35.31 5.56 50.10 -0.338 34.35 9.73 6.08 49.85
CL4419.Contig1 302 AT4G02590.2 1E-119 32.11 6.01 49.62 -0.363 37.42 12.25 7.62 42.72
CL5269.Contig4 270 AT1G59640.1 2E-95 29.69 5.61 45.61 -0.717 30.74 18.89 8.52 41.85
CL1890.Contig2 276 AT5G62610.1 2E-89 29.76 6.09 53.22 -0.695 34.78 12.68 8.33 44.20
CL10916.Contig3 556 AT3G07340.1 3E-97 60.94 5.87 54.53 -0.676 33.99 9.71 6.12 50.18
CL10831.Contig2 556 AT3G07340.1 1E-111 61.10 6.42 52.12 -0.658 36.51 9.53 5.58 48.38
CL10916.Contig2 570 AT3G07340.1 2E-99 62.44 6.33 51.01 -0.697 33.51 9.82 6.84 49.82
CL2567.Contig1 427 AT1G10120.1 2E-75 45.77 5.97 51.12 -0.591 29.51 13.82 8.43 48.24
Unigene18261 246 AT5G50915.2 2E-31 27.82 8.31 54.88 -0.707 32.93 15.04 8.54 43.50
Unigene7009 273 AT1G73830.1 1E-50 31.27 5.77 51.62 -0.781 51.28 6.59 4.40 37.73
CL577.Contig1 543 AT1G68920.3 1E-149 58.31 5.71 50.40 -0.632 30.76 13.08 8.47 47.70
CL2641.Contig1 558 AT1G68920.3 1E-141 59.79 5.70 54.59 -0.624 26.52 15.23 7.35 50.90
CL4283.Contig2 424 AT4G34530.1 7E-62 46.44 6.40 53.46 -0.518 36.08 15.09 6.60 42.22
CL4283.Contig3 433 AT4G34530.1 3E-62 47.52 5.99 55.44 -0.528 42.26 12.24 6.70 38.80
CL4429.Contig4 351 AT3G57800.2 2E-90 38.88 5.85 61.31 -0.704 35.61 9.12 5.41 49.86
CL4429.Contig3 352 AT3G57800.2 1E-85 38.64 5.73 56.72 -0.637 34.09 11.65 5.68 48.58
CL7547.Contig2 360 AT3G57800.2 2E-91 39.99 6.50 58.69 -0.678 33.06 13.33 5.00 48.61
CL8764.Contig1 527 AT5G56960.1 1E-68 59.37 6.88 55.68 -0.512 38.14 14.23 5.50 42.13
Unigene15094 254 AT5G43650.1 4E-44 29.42 8.33 64.91 -0.645 60.24 13.39 3.15 23.23
CL7576.Contig1 350 AT2G22760.1 3E-63 39.49 5.79 58.11 -0.457 42.00 16.86 4.29 36.86
CL7270.Contig1 469 AT1G61660.1 2E-60 51.58 5.81 54.91 -0.625 23.88 15.78 6.40 53.94
Unigene19240 143 AT1G05710.3 3E-66 15.90 9.12 49.48 -0.340 41.96 11.89 7.69 38.46
Unigene19238 143 AT1G05710.3 1E-63 15.78 8.71 45.77 -0.252 34.27 16.08 9.79 39.86
基因编号
Gene ID		 鉴定结果
Identification		 理化性质
Physicochemical properties		 二级结构
Secondary structure
氨基酸数量
Number of amino acids		 同源拟南芥基因代码
Homologous gene locus in Arabidopsis		 E值
E-value		 相对分
子量
Molecular weight
/ku		 理论等电点
Theoretical pI		 不稳定系数
Instability index		 平均疏
水指数
Grand average of hydropathicity		 α-螺旋
α-helix/%		 延伸链
Extended strand/%		 β-转角
β-turn/%		 无规
卷曲
Random coil/%
CL4507.Contig1 303 AT4G29100.1 5E-48 33.07 5.31 66.36 -0.557 22.77 14.85 7.26 55.12
CL4507.Contig7 346 AT4G29100.1 5E-83 37.96 6.51 66.69 -0.642 27.17 15.03 8.09 49.71
CL4004.Contig2 417 AT1G27660.1 4E-90 45.59 8.39 60.57 -0.565 31.18 14.15 7.67 47.00
CL7244.Contig2 239 AT1G29950.1 1E-36 26.76 6.23 67.25 -0.677 35.56 11.30 4.18 48.95
CL7244.Contig1 237 AT1G29950.1 2E-29 26.29 7.68 59.87 -0.661 38.82 8.44 3.80 48.95
CL3261.Contig1 419 AT3G21330.1 9E-62 46.20 6.05 58.06 -0.614 36.75 13.13 5.97 44.15

2.2 芒果bHLH家族蛋白特性分析

对芒果bHLH家族蛋白进一步进行生物信息学分析（表1）,理化性质分析发现：87个芒果bHLH家族蛋白的相对分子量在10.17~102.47 ku之间,其中含61个酸性蛋白（理论等电点<7）和26个碱性蛋白（理论等电点>7）;不稳定指数（Ⅱ）分析发现除Unigene21025和CL1202.Contig3为稳定蛋白外（Ⅱ<40）,其余均为不稳定蛋白（Ⅱ>40）;平均疏水指数均小于0,为亲水性蛋白。二级结构分析发现：芒果bHLH家族蛋白中无规卷曲和α-螺旋所占比例较大,其中50个为无规卷曲所占比例最大,36个为α-螺旋所占比例最大,CL5018.Contig2二级结构中α-螺旋和无规卷曲所占比例一致。87个bHLH家族蛋白均不含信号肽。跨膜结构分析发现CL10714.Contig1含跨膜结构,为膜结合转录因子,其余bHLH蛋白均不含跨膜结构。

2.3 芒果bHLH蛋白结构域分析及分类

使用BioEdit对87个芒果bHLH蛋白的结构域进行比对,并用WebLogo 3获得芒果bHLH蛋白的结构域序列标签（图1）。分析发现,在芒果bHLH结构域的2个α-螺旋区内,23和54位点均为疏水性氨基酸亮氨酸（L）,100%的20、44和51位点,98.85%的16位点以及97.70%的27位点为疏水性氨基酸（A、F、I、L、M、P、V、W或Y）,而这些疏水性氨基酸对bHLH的蛋白二级结构的稳定性起着关键作用[23]。
图1 芒果bHLH蛋白结构域

Fig. 1 Highly conserved DNA binding domain of mango bHLH proteins

在bHLH结构域的碱性区内,有多个关键位点用于识别并结合DNA特定碱基序列,其中9位点的谷氨酸（E）用于与DNA双螺旋结构的大沟结合[23],分析发现,73个（83.91%）芒果bHLH结构域的9位点为谷氨酸（E）,其中72个在9位点为谷氨酸（E）且12位点为精氨酸（R）,而且研究发现具有9位点为E且12位点为R结构的bHLH蛋白具有识别并结合E-box序列（CANNTG）的功能[24],57个（65.52%）bHLH蛋白结构域在5位点为组氨酸（H）或赖氨酸（K）、9位点为谷氨酸（E）且13位点为精氨酸（R）,而在植物中该结构被证实用于识别并结合G-box[25]。在14个9位点不是谷氨酸（E）的bHLH结构域中,有3个bHLH结构域的碱性区内含5个及以上碱性氨基酸（R、K或H）,这3个bHLH蛋白可能在非E-box序列处与DNA结合[4]。11个bHLH结构域9位点不是谷氨酸（E）且碱性区内含5个以下碱性氨基酸（R、K或H）,该类bHLH蛋白不具有结合DNA功能[26]。

2.4 芒果bHLH家族蛋白进化树及基序分析

通过MEGA 6.0软件构建芒果bHLH家族蛋白的系统进化树。由图2可知,在进化树中,相同类型的bHLH蛋白聚在一起,且相近分支的bHLH序列长度及结构域位置相近。
图2 芒果bHLH家族蛋白结构域、进化树及基序分析

A结构域及进化树分析;B基序分析。

Fig. 2 Domains, phylogenetic tree and motifs analysis of mango bHLH family proteins

A. Domains and phylogenetic tree analysis; B. Motifs analysis.

用MEME在线软件分析出芒果bHLH家族蛋白的5个基序（图3）,基序1（AERRRREKJNERMKALQSLVP）、基序2（DKKTDKASMLDEAINYVKELQRQVQFLSM）、基序3（PPSVYIHVRARRGQATDSHSJ）、基序4（CERRPGLLLKLIQALENLGLD）和基序5（TFSRALLAKSAGIQTVVCIPLLDGVVELG）,基序1和基序2包含bHLH结构域的主要组成,存在于所有芒果bHLH蛋白中,结合进化树可以看出,相近分支bHLH蛋白的基序组成相同且分布位置相近（图2）。
图3 芒果bHLH家族蛋白基序

Fig. 3 Motifs of mango bHLH family proteins

2.5 芒果bHLH蛋白GO聚类分析

利用Blast2GO软件对87个芒果bHLH蛋白进行GO功能注释,并用WEGO软件统计分析（图4）,87个芒果bHLH蛋白共注释到了生物学过程、细胞组分和分子功能3大类功能的17个亚类。细胞组分类别中,16、16、16和2个bHLH蛋白分别注释到细胞部件（cell part）、细胞（cell）、细胞器（organelle）和大分子复合物（macromolecular complex）。分子功能类别中,49个bHLH蛋白注释到结合功能（binding）,14个注释到转录调控活性（transcription regulator activity）,4个注释到催化活性（catalytic activity）。生物学过程类别中,注释到细胞过程（cellular process）和代谢过程（metabolic process）的分别有16个和15个bHLH蛋白,注释到发育过程（developmental process）的有5个,注释到繁殖（reproduction）、应激响应（response to stimulus）、生物调节（biological regulation）的均有3个,注释到多细胞有机体过程（multicellular organismal process）、生殖过程（reproductive process）、生物过程调控（regulation of biological process）的均为2个,仅CL6262. Contig2注释到信号转导（signaling）。
图4 芒果bHLH蛋白GO功能分类

Fig. 4 GO function classification of mango bHLH proteins

2.6 芒果与拟南芥bHLH蛋白系统发育树比对

利用MEGA软件对芒果和拟南芥bHLH蛋白进行系统发育树分析（图5）,大部分芒果bHLH蛋白与拟南芥不同亚组的bHLH蛋白聚在一起,说明芒果bHLH蛋白与拟南芥有较高的保守性。在拟南芥中相同亚组的bHLH蛋白具有相同或相似的功能[27],推测聚在不同亚组的芒果bHLH蛋白与拟南芥该亚组具有相同或相似的功能,其中与拟南芥Ⅲe亚组AtbHLH006（MYC2）、AtbHLH005（MYC3）和AtbHLH004（MYC4）相近的Unigene22477可能参与茉莉素介导的开花抑制[28];与Ⅲf亚组[27]聚在一个进化支的Unigene22638、Unigene1413、CL6262.Contig2和CL3741.Contig3可能参与类黄酮/花色苷的生物合成或毛状体的发生;与Ⅳc亚组[29,30]聚在一个进化支的CL7992.Contig2、Unigene8036、CL7468.Contig2可能参与调控铁代谢平衡;与Ⅶ亚组AtbHLH024[31]及AtbHLH073[32]相近的CL2367.Contig2可能参与花结构的形成;与Ⅹ亚组AtbHLH112[33]相近的CL7270.Contig1可能具有提高芒果抗非生物胁迫的能力;与Ⅻ亚组AtbHLH48和AtbHLH60[34]相近的CL4429.Contig4、CL4429.Contig3、CL7547.Contig2、Unigene18261可能参与调控GA介导的开花。
图5 芒果与拟南芥bHLH蛋白系统进化树

Fig. 5 Phylogenetic tree of bHLH proteins in mango and Arabidopsis thaliana

3 讨论

植物bHLH蛋白参与抗逆、生长发育、生物合成及信号传导等生理生化过程[35]。基于生物信息学分析技术,目前已从一些植物如拟南芥[36]、水稻[37]、人参[38]、西瓜[39]、茶树[40]、葡萄[41]、苹果[42]等分别鉴定出162、167、169、96、120、110、175个bHLH蛋白。
本研究基于芒果果实转录组数据,鉴定出87个bHLH家族蛋白,其中酸性蛋白所占比例较大,大部分为不稳定蛋白,且均为不含信号肽的亲水性蛋白,此现象与‘短柄樱桃’[43]等多种植物的bHLH家族蛋白相似。除CL10714.Contig1为膜结合转录因子外,其余bHLH蛋白均不含跨膜结构,推测CL10714.Contig1与芒果对环境的胁迫响应有关[44]。大部分芒果bHLH家族蛋白二级结构中无规卷曲所占比例最大,该结果与云南红皮梨bHLH转录因子一致[45]。
芒果bHLH蛋白结构域有多个氨基酸位点保守性较高,且保守位点与西瓜[39]和莲[46]bHLH蛋白的分析结果相似。87个芒果bHLH蛋白中的73个（83.91%）具有E-box结合功能,57个（65.52%）具有G-box结合功能,该结果与拟南芥（60.54%）和水稻（56.89%）[37]的分析结果相似。
进化树上相近分枝的芒果bHLH的基序组成相同,序列长度及结构域位置相近,与拟南芥bHLH的分析结果相似[27]。
芒果bHLH蛋白共注释到GO分类中生物学过程、细胞组分和分子功能3大类功能的17个亚类,其中56.32% bHLH蛋白注释到结合功能。
对芒果和拟南芥bHLH蛋白共同构建的进化树分析发现,芒果bHLH蛋白与拟南芥有较高的保守性,大部分芒果bHLH蛋白与拟南芥不同亚组的bHLH蛋白聚在一起,推测芒果bHLH蛋白与相近的拟南芥bHLH蛋白具有相似的功能,该分析将为下一步芒果bHLH蛋白的功能分析提供参考。基于此方法,Chen等[47]发现与拟南芥AtbHLH112同源的水稻OsbHLH068在参与盐胁迫响应时与AtbHLH112功能一致,参与花期调控时与AtbHLH112功能相反。
bHLH蛋白参与植物的多种生命活动,本研究从芒果转录组数据中鉴定87个bHLH家族蛋白,为今后芒果bHLH家族蛋白的研究提供了基础。由于转录组数据的局限性,所鉴定的仅为芒果bHLH家族的部分蛋白序列,因此,芒果bHLH家族蛋白还有待进一步挖掘和研究。本研究仅对部分芒果bHLH蛋白进行了功能预测,其具体功能有待进一步验证。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。

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Chen H, Hsieh-Feng V, Liao P , et al. The function of OsbHLH068, is partially redundant with its homolog, AtbHLH112, in the regulation of the salt stress response but has opposite functions to control flowering in Arabidopsis[J]. Plant Molecular Biology, 2017,94(4-5):531-548.

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