辣木（Moringa oleifera Lam.,辣木科辣木属）,原产于非洲地区和印度北部,现在中国广西、广东、海南、云南等省（区）均有种植[1]。辣木籽是辣木营养价值和经济价值较高的部位之一。它富含蛋白质和油脂,含有丰富的维生素、甾醇、微量元素等营养物质[2⇓-4]。辣木籽渣是辣木籽经高温榨油后的加工副产物,其蛋白质含量高达35%,然而常作为废弃物或作为饲料添加物添加到动物饲料里,利用率低且造成资源浪费。本课题组前期研究发现辣木籽渣蛋白（MSRP）制备的Pickering乳液具有较低的乳化指数、较小的粒径、较高的电势、优良的形态特征和较好的流变性[5]。目前国内外对辣木籽的研究主要集中在辣木籽油、辣木籽蛋白和辣木籽多酚上[6⇓⇓-9]。对辣木籽渣研究极少,导致含有丰富蛋白质的辣木籽渣只能作为饲料和废弃物处理。因此,为进一步提高资源的综合利用,增加辣木籽渣的附加值,需进一步挖掘辣木籽渣蛋白乳液作为乳化剂在食品工业中的应用。
槟榔是海南省第二大经济作物。鲜食槟榔能保持原有的营养成分,减轻木制纤维及其他有害物质对口腔的损害[10]。然而,新鲜槟榔在采摘后,容易发生腐败褐变,失去食用价值[11]。尽管国内外科研人士对槟榔的贮藏和保鲜做了许多研究,但将研究成果运用到实际生活中的却很少。根据本课题组前期研究,我们发现辣木籽渣蛋白乳液具有较佳的运载功能,已有研究表明将植物精油进行纳米级封装制备成纳米乳液可以有效地改善植物精油的挥发性和水溶性,同时提高其抗菌和抗氧化能力[12-13]。
因此本研究利用辣木籽渣蛋白Pickering乳液负载不同浓度的茶树精油,涂抹于新鲜槟榔的表面,测定其可溶性固形物含量、失重率、色差、细胞膜透性等理化指标,以期为槟榔保鲜提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料与试剂
新鲜槟榔由海南景和农业发展有限公司提供;辣木籽渣由河南金辣木生物科技有限公司提供;茶树精油由湛江市霞山区中热科技有限公司提供;LB肉汤培养基、LB琼脂培养基广东环凯微生物科技有限公司。试验所用其他试剂均为分析纯。
1.1.2 仪器与设备
Color i 5D台式分光光度仪美国X-Rite公司;CT3-50K物性测试仪美国Brookfield公司;ZHJH-C1115B垂直超净工作台上海智诚分析仪器制造有限公司;DDS-11C电导率仪上海精密科学仪器有限公司;TURRAX分散机德国IKA公司;HG-50高压灭菌锅华粤行仪器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 负载茶树精油的辣木籽渣蛋白（MSRP）乳液涂膜液的制备
MSRP的提取参考DU等[14]报道的方法并稍加修改。辣木籽渣脱脂粉与0.5 mol/L (NH4)2SO4溶液按1∶10（W/V)的料液比进行混合,室温搅拌2 h, 5000 g 离心15 min,过滤,得到上清液。在上清液中加入(NH4)2SO4至80%饱和度,4℃静置2 h,离心,得到沉淀物。将沉淀物透析5 d后经冷冻干燥,得到MSRP冻干物。
将MSRP溶于PBS缓冲液中,水化过夜,制备得1%（W/V）MSRP母液。将单宁酸（TA）加入到PBS中,搅拌1 h直至TA完全溶解,用NaOH溶液调节pH至7,制备得4%（W/V）TA母液。将MSRP母液和TA母液在不断搅拌下组合,形成MSRP母液∶TA母液=1∶0.125的复合物,然后加入50%的大豆油,用分散机均质3 min,分别加入0%、0.1%、0.3%、0.5%的茶树精油。最后得到本研究所需的茶树精油–MSRP乳液、0.1%茶树精油–MSRP乳液、0.3%茶树精油–MSRP乳液、0.5%茶树精油–MSRP乳液。
1.2.2 负载茶树精油的MSRP乳液抗菌试验
菌种活化：在无菌条件下分别将2种供试菌种（大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus）接种到装有LB液体培养基的锥形瓶中,置于37℃摇床中120 r/min培养24 h,备用。
抑菌圈测定：采用滤纸片扩散法测定抑菌圈。在超净工作台中用无菌生理盐水将二次活化后的大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌液稀释至106~107 CFU/mL,吸取100 µL菌液滴加到平板上并涂布均匀,再用镊子将灭菌滤纸片（直径7 mm）间隔摆放在平板的3个位置。在培养皿上放3块用负载茶树精油的MSRP乳液浸染过的滤纸片,各块中心之间相距25 mm以上,与培养皿的周缘相距15 mm以上（3个孔为一组）。将平板倒置培养24 h,用游标卡尺测量抑菌圈的直径并记录,评定标准见表1。
表1 滤纸片法测定抑菌圈的评定标准Tab. 1 Criteria for evaluating the bacteriostatic zone by filter paper method |
| 评定标准 Evaluation criteria | 抑菌圈直径 Inhibitory zone diameter/mm |
|---|---|
| 高敏 | ≥20 |
| 中敏 | 10~19 |
| 纯敏 | 7~9 |
| 无抑菌作用 | ≤6 |
1.2.3 槟榔保鲜处理
选取大小均一、色泽饱满、无机械损伤的新鲜槟榔剪枝清洗,ClO2溶液（100 mg/L）浸泡3 min,以减少微生物数量,保证样品均一性。将处理好的槟榔随机平均分为6组,每组20个,将二氧化氯溶液浸泡后的槟榔分组后分别在0%、0.1%、0.3%和0.5%茶树精油–MSRP乳液涂膜及0.1%茶树精油中充分浸泡1 min,然后取出放置于干燥阴凉处沥干水分以蒸馏水为空白对照,将处理后的槟榔再分别装入保鲜袋中常温贮藏11 d,分别于第1、3、5、7、9、11天测定槟榔贮藏期间的可溶性固形物、失重率、色差、硬度和细胞膜透性等理化指标。
1.2.4 可溶性固形物含量的测定
按照NY/ T2637—2014进行测试。姚小玲等[15]发现槟榔果仁中含有较高的营养物质,果仁中可溶性固形物比果皮高,因此取样时为减小误差,取15 g样品,其中包括5 g槟榔果仁及10 g果皮样品,加入30 g去离子水混合,于打浆机中破碎,滤出匀浆汁液,取2~3滴滤液于折光仪中央读取可溶性固形物含量百分数,每个样品重复测试3次。
1.2.5 失重率的测定
槟榔采摘后失水会导致果皮失水皱缩,采用差重法[16]进行测定,具体计算公式如下：w=(m1-m2)/m1×100%,式中,w为失重率（%）;m1为贮藏前果实质量（g）;m2为贮藏数天后果实的质量（g）。
1.2.6 色差的测定
采用Color I 5D台式分光光度计测定槟榔果皮的红绿度值a*和b*进行测定,每组样品取3个槟榔,每个槟榔随机取3个点测定,取平均值。
1.2.7 硬度的测定
采用CT350K台式物性测试仪在室温下测定处理前后槟榔表面的硬度。探头为TA39,测试速度为0.5 mm/s,测试目标值为6 mm,每个槟榔取3个点,试验数据取其平均值。
1.2.8 细胞膜透性的测定
细胞膜透性测定采用相对电导率法[17]：用水果刀切取槟榔表皮,切成长、宽、厚约为15 mm×5 mm×0.5 mm的长条,精确称取2 g,用蒸馏水清洗2遍后去除表面水分置于锥形瓶中,加入50 mL蒸馏水,室温条件下振荡30 min。用电导率仪测定浸提液的电导率P1。然后将浸取液加热至沸腾15 min后,自然冷却至室温。并补充加热过程中减少的水分,再测定其电导率P2。以槟榔表皮浸提液前后两次电导率的比值来表示槟榔的细胞膜透性。
1.3 数据处理
采用SPSS 17.0软件中的方差分析法对数据进行差异显著性检验分析,数据以平均值±标准差的形式来表示。
2 结果与分析
2.1 负载精油的MSRP乳液涂膜对槟榔可溶性固形物含量（SSC）的影响
可溶性固形物含量的高低是反映槟榔口感的重要指标之一,主要指可溶性的糖类,随着成熟度的增加,固形物含量呈现升高的趋势,其主要原因是大分子糖类被分解为单糖引起。随着贮藏时间延长,各组槟榔的可溶性固形物含量均有上升,其中对照的SSC增长的最快,在第11天时,其SSC值达到了4.7%,各样品处理均低于对照,其中负载0.1%和0.3%茶树精油–MSRP乳液涂膜的SSC值分别为2.7%和3.2%（图1）,可能是涂膜对呼吸作用有抑制作用,大分子糖类分解出的单糖少,减缓了SSC值的增加,进而减缓了槟榔的成熟进程。
2.2 负载精油的MSRP乳液涂膜对槟榔失重率的影响
新鲜槟榔在贮藏过程中容易失水导致果实表面皱缩,失重率能够反映槟榔果实在贮藏过程中水分的流失。随着贮藏时间延长,各组的失重率均呈上升趋势,其中对照的失重率最高,贮藏11 d时,对照失重率高达43.77%,负载0.1%、0.3%和0.5%茶树精油–MSRP乳液涂膜槟榔的失重率分别31.15%、28.11%和35.88%,其中,0.3%茶树精油–MSRP乳液涂膜的失重率最低（图2）,证明0.3%茶树精油–MSRP乳液涂膜能有效减少果实水分蒸发。在贮藏7 d后,MSRP乳液涂膜、0.5%茶树精油–MSRP乳液涂膜及0.1%茶树精油失重率升高速率较快,主要是由于在贮藏后期,槟榔开始腐烂,使MSRP乳液膜有部分脱落的情况,槟榔表面的微生物快速生长,这也会消耗槟榔内的营养成分和水分,导致质量损失。且未经涂膜的精油直接与果实表皮接触,导致果实皱缩。
2.3 负载精油的辣木仔渣蛋白乳液涂膜对槟榔果皮颜色及外观形态的影响
a代表红绿色度,Δa是正值时表示红色程度,说明样品比初始值红;b代表黄蓝色度,Δb正值时表示黄色程度,说明样品比初始值偏黄。随着贮藏时间的延长,槟榔表皮颜色先变黄,然后变黑,其中0.3%茶树精油–MSRP乳液涂膜后,贮藏的槟榔护绿效果最佳,其次是0.5%茶树精油–MSRP乳液。贮藏11 d时,对照的Δa值为5.51,其他处理均低于对照,从大到小依次为：0.1%茶树精油（4.88）>0.5%茶树精油–MSRP乳液（4.85）> MSRP乳液（4.22）>0.1%茶树精油–MSRP乳液（3.84）>0.3%茶树精油–MSRP乳液（3.41）。对照的Δb值为6.51,其他处理均低于对照,从大到小依次为：0.1%茶树精油（5.27）>0.5%茶树精油–MSRP乳液（4.90）>MSRP乳液（3.22）>0.1%茶树精油–MSRP乳液（3.14）>0.3%茶树精油–MSRP乳液（2.42）（图3、图4）。涂膜的护绿效果均优于对照和0.1%茶树精油,未经包埋的精油易挥发且气味较重,保鲜效果欠佳（图5）。从果实外观来看,第13天,除0.3%茶树精油–MSRP乳液涂膜保持表皮绿色色泽,其他处理均出现霉变或大面积转黄现象;第11天时,0.1%茶树精油处理的槟榔开始变黄,而0.1%茶树精油–MSRP乳液只有略微变黄的趋势,第13天时,0.1%茶树精油处理的槟榔开始发病,0.1%茶树精油–MSRP乳液涂膜的槟榔出现褐变,说明在贮藏后期精油挥发严重,保鲜护绿效果下降,负载茶树精油的MSRP乳液涂膜有一定的护绿保鲜效果。可能精油涂膜能通过抑制槟榔果实类胡萝卜素含量的增加、保持叶绿素含量,从而延缓槟榔果实黄化。
图3 辣木籽蛋白渣乳液涂膜对槟榔△a值的影响Fig. 3 Effect of M. oleifera seed protein residue emulsion coating on the △a value of areca nut |
图4 辣木籽蛋白渣乳液涂膜对槟榔△b值的影响Fig. 4 Effect of M. oleifera seed protein residue emulsion coating on the △b value of areca nut |
2.4 负载精油的MSRP乳液涂膜对槟榔硬度的影响
槟榔的硬度是衡量贮存效果好坏的重要指标,也是槟榔品质主要指标和消费者评价其质量的重要因素,贮藏过程中硬度的减小将缩短货架期。在贮藏过程中,槟榔总体硬度呈先缓慢下降后迅速下降的趋势。刚采摘的槟榔成熟度不足,细胞之间有果胶,细胞排列紧密,硬度较大。7 d后槟榔成熟,果胶在果胶酶的作用下分解,细胞游离,槟榔果实组织软化。贮藏后期（第11天时）,0.3%茶树精油-MSRP乳液（51.46 N）>0.5%茶树精油-MSRP乳液（48.64 N）>0.1%茶树精油-MSRP乳液（46.19 N）,均显著高于对照槟榔的硬度（图6）,这与2.3中的槟榔表皮色泽结果趋势一致,表明0.3%茶树精油-MSRP乳液涂膜保鲜效果最佳,延缓了槟榔果实的软化。
2.5 负载精油的辣木渣蛋白乳液涂膜对槟榔细胞膜透性的影响
相对电导率是衡量果肉细胞膜完整性的一个重要指标,果蔬细胞膜对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要的作用,果蔬组织衰老过程中,细胞质膜功能活性下降,膜通透性增加,细胞内电解质往外渗,相对电导率增加,电导率越大细胞膜的通透性就越大,反之则越小[18]。在贮藏过程中,6组处理的槟榔果实电导率随着贮藏时间的延长均呈上升趋势。在整个贮藏过程中,涂膜处理的槟榔果实电导率均比对照低,贮藏初期各组相对电导率差异不显著。贮藏7 d后槟榔品质急剧下降,相对电导率开始出现较大变化,处理与对照有明显差异。特别贮藏第11天时,0.3%茶树精油–MSRP乳液涂膜的相对电导率最低为64.20%,其次是0.5%茶树精油–MSRP乳液涂膜69.87%,对照则最高为92.86%（图7）,表明负载精油的辣木渣蛋白乳液涂膜能有效抑制槟榔果实细胞膜透性上升,维持细胞结构的完整性。综上所述,这与李尚斌[10]的研究结果一致,保鲜剂结合涂膜处理能抑制细胞膜透性的升高,可能是通过抑制细胞膜脂过氧化作用及MDA的积累而达到的效果。
2.6 负载茶树精油的MSRP乳液涂膜的抑菌活性
抑菌圈直径越大表示抑菌活性越好,大于15 mm为高度敏感,9~15 mm为中度敏感,7~9 mm为低度敏感,小于7 mm为不敏感。抑菌试验表明负载0.3%茶树精油的MSRP乳液对大肠杆菌（E. coli）的抑菌直径为11.33 mm,对金黄色葡萄球菌（S. aureus）的抑菌直径为13.38 mm,介于9~15 mm之间,均为中度敏感,说明负载0.3%茶树精油的MSRP乳液对食源性致病菌有良好抑制作用,且对金黄色葡萄球菌抑制效果优于大肠杆菌。这可能是因为大肠杆菌与金黄色葡萄球菌相比,具有外壁层,其主要由脂多糖及脂蛋白组成,脂多糖可以有效阻碍大分子物质进入,从而有效保护大肠杆菌。金黄色葡萄球菌细胞壁肽聚糖含量高,抗菌剂可干扰肽聚糖的合成,从而抑菌金黄色葡萄球菌。
表2 0.3%茶树精油MSRP乳液抑菌圈直径Tab. 2 Diameter of antibacterial zone of 0.3% M. oleifera seed residue protein emulsion |
| 样品 Sample | 抑菌圈直径 Inhibitory zone diameter/mm | |
|---|---|---|
| 金黄色葡萄球菌 S. aureus | 大肠杆菌 E. coli | |
| 0.3%茶树精油- MSRP乳液涂膜液 | 13.38±0.88 | 11.33±0.81 |
| 空白对照 | <6 | <6 |
3 讨论
本研究中,探讨了负载不同浓度茶树精油的MSRP乳液涂膜对新鲜槟榔常温贮藏保鲜的影响,其中槟榔的硬度、失重率、色差值、细胞膜通透性等指标与槟榔保鲜效果有直接相关性,且负载一定浓度的精油可增加可食用膜的抗菌性,但浓度过高亦会出现气味过重、影响槟榔品质的负面作用,将茶树精油进行纳米级封装制备成纳米乳液可以有效改善其挥发性和水溶性,与纯精油及纯乳液涂膜相比,有显著的保鲜效果,可延缓槟榔表皮黄化、腐烂的进程。另外,负载茶树精油的MSRP乳液涂膜液所采用的原料均为天然植物来源,且该乳液涂膜液为水溶性,后续槟榔的清洗即可完全去除,对槟榔的加工及食用性无安全性隐患,该项技术可为槟榔开发新的绿色活性保鲜剂提供一个方向和技术指导。但常温贮藏的保鲜期有限,与文献中冷藏保鲜的效果有一定差距,因此,贮藏温度也是影响其保鲜效果的重要因素。
负载0.1%、0.3%和0.5%茶树精油–MSRP乳液对抑制槟榔的腐烂具有较好的效果,且随着浓度的增加（0%~0.3%）,抑制越显著,但精油浓度高至0.5%效果减弱,其中0.3%浓度的茶树精油涂膜可有效减少新鲜槟榔贮藏期内水分的蒸发,进而减缓质量的损失,同时还能有效维持较高的硬度,减缓组织软化,可有效减缓槟榔表皮转黄,保持较好色泽形态,常温贮藏期达到11 d,且抑菌试验表明负载0.3%茶树精油的MSRP乳液对大肠杆菌（E. coli）的抑菌直径为(11.33± 0.81)mm,对金黄色葡萄球菌（S. aureus）的抑菌直径为(13.38±0.88)mm。综上所述,负载0.3%茶树精油–MSRP乳液效果最好,既能达到抑菌效果,同时也能最大程度保持槟榔外观品质和营养品质,可作为延长槟榔保鲜时间和贮藏品质的适宜处理条件。